DMH1聯(lián)合Forskolin誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)效果分析

顧 文，楊建東

（1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225000；2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇 揚州 225000）

DMH1為一種小分子化合物，常用于骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的抑制劑中。近幾年的文獻報道，小分子化合物DMH1可促使hiPSCs產(chǎn)生神經(jīng)元細胞[1]。Forskolin在許多細胞類型中，是一種有效的腺苷酸環(huán)化酶激活劑，相關(guān)文獻報道，脂肪源性干細胞不僅有自我喚醒的能力，而且還具有萬能性，與其它干細胞一樣，是通過bFGF結(jié)合Forskolin誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)細胞[2]。本文旨在敘述DMH1聯(lián)合Forskolin誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)變化及NSE、Nestin、SOX1的表達水平分析，給神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療措施提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

采購（一月齡）SPF級SD大鼠2只作為研究對象，每只體重為（101±13）g。

1.2 實驗試劑

實驗試劑采用DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清，胰酶，盤尼西林，鏈黴素A，DMH1，F(xiàn)orskolin，蛋白提煉試劑盒，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)試劑盒，牛血清白蛋白（BSA），抗NSE、Nestin、SOX1及β-actin抗體，單克隆抗體（CD34、CD44、CD45、CD90、CD105）。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨髓間質(zhì)干細胞培養(yǎng)

使用頸椎脫臼法快速將SD大鼠殺死，然后進行酒精徹底消毒，在凈化工作臺上實施剖解，解剖時將大腿骨與脛骨分開，使用注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基液（含10%FBS）清洗大腿骨與脛骨的骨髓腔，然后收集培養(yǎng)基液來回吹打成細胞懸液。對懸液進行細胞密度測定，再次使用培養(yǎng)基液稀釋細胞，細胞密度調(diào)成1×109/L后倒入培養(yǎng)皿里將其鋪勻。然后使用胞培養(yǎng)箱進行貼壁培植細胞，溫度為37℃，CO2濃度為5%。等細胞貼壁滋長后，2 d更換50%新鮮培養(yǎng)基，3 d將其全部更換，然后用顯微鏡查看細胞狀態(tài)，若細胞滋長平穩(wěn)，間隔2d更換所有新鮮培養(yǎng)基液，如果貼壁滋長的細胞匯合度為80%-90%時，能夠?qū)⒓毎M行傳代，其比列為1:2。

1.2.2 骨髓間質(zhì)干細胞鑒定

采集生長形態(tài)很好的P3代細胞，用0.25%胰酶消化細胞，離心4℃，轉(zhuǎn)速1000 r/min離心5 min，使用磷酸緩沖鹽溶液（含1%BSA）沖洗細胞3次，計算細胞數(shù)，將單克隆抗體CD34、CD44、CD45、CD90、CD105按順序加入各細胞管。并且將每個細胞管都設(shè)置一個陰性作為參照對象。然后放于避光冰上孵育，時間為45 min，再次用磷酸緩沖液沖洗細胞3次，為清除細胞上沒有結(jié)合的抗體，最后用500 μL磷酸緩沖液重新懸浮細胞，采用流式細胞儀進行骨髓間質(zhì)干細胞鑒定。

1.3.3 DMH1與Forskolin誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化

使用第3代形態(tài)良好的細胞，將密度調(diào)成5×105個/mL在培養(yǎng)皿鋪勻培養(yǎng)，其匯合度達到70～80%時，開始用Forskolin（0.01 mm）預(yù)誘導(dǎo)，時間為1 d，進而用DMH1（0.04 mm）誘導(dǎo)，時間為3d，并采用不誘導(dǎo)細胞為參照對象。最后查看細胞狀態(tài)情況。

1.3.4 Western Bolt檢測骨髓間充質(zhì)干細胞特異性蛋白水平

采集培養(yǎng)過的細胞將其裂解后提煉蛋白質(zhì)，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠實施蛋白質(zhì)電泳，后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用BSA封閉，進而將一抗NSE、β-actin、SOX1及Nestin抗體攙和，4度孵育一夜，最后進行二抗室內(nèi)溫度孵育2h顯色后照相。

1.3.5 RT-PCR分析

采取3×106cells/mL未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞，通過TRIZOL法抽提核糖核酸（RNA）。以試劑盒說明進行RT—PCR分析。共30個循環(huán)，采用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察凝膠成像系統(tǒng)并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 誘導(dǎo)前后的細胞狀態(tài)觀察

誘導(dǎo)前，使用顯微鏡觀察細胞，細胞狀態(tài)分開并貼壁滋長，參差不齊，形態(tài)各異，滋長狀態(tài)優(yōu)異。DMH1聯(lián)合Forskolin誘導(dǎo)第1d，細胞折射產(chǎn)生變化，并發(fā)現(xiàn)部分細胞突起。誘導(dǎo)第3d，細胞折射性顯著高于誘導(dǎo)第1天，其狀態(tài)顯著變化，并且細胞長突起，構(gòu)成網(wǎng)狀。

2.2 Western Bolt 檢測特異性蛋白水平

誘導(dǎo)后，檢測誘導(dǎo)細胞的NSE、Nestin、SOX1及內(nèi)參β-actin蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，NSE、Nestin及SOX1蛋白的表達水平提高。

2.3 RT—PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細胞中的蛋白基因表達水平

采用RT—PCR檢測誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞中的蛋白基因表達水平情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSE、Nestin、SOX1及內(nèi)參β-actin蛋白在骨髓間充質(zhì)干細胞中均有表達，而且NSE、Nestin、SOX1的表達水平明顯上升。

3 討 論

化學(xué)生物學(xué)是一門交叉學(xué)科，是通過活躍的小分子化合物干擾蛋白質(zhì)與分解生物，可識別生物特點與內(nèi)在規(guī)律[3]。小分子化合物可迅速誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化，能夠準確把握誘導(dǎo)時間，而且將小分子的濃度調(diào)整，作用效果可反向進行。小分子化合物混合后具有穩(wěn)定性、有效性和極易量化，可重復(fù)，而且成本較低，對培養(yǎng)細胞來說至關(guān)重要。隨進一步的研究顯示，小分子化合物在干細胞誘導(dǎo)中具有至關(guān)重要的作用[4]。相關(guān)研究顯示，有學(xué)者采用小分子化合物誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的萬能性，如使用β-巰基乙醇、二甲亞砜及丁基大茴香醚等小分子化合物成功誘導(dǎo)細胞向神經(jīng)元分化[5]。而且用丙戊酸鈉（VPA）、CHIR99021、Repsox 化學(xué)雞尾酒聯(lián)合誘導(dǎo)后，向小鼠與人的神經(jīng)元分化。

本研究采用DMH1聯(lián)合Forskolin誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞后，轉(zhuǎn)變成神經(jīng)元細胞。開始使用Forskolin預(yù)誘導(dǎo)細胞，是因該小分子化合物為一種腺苷酸環(huán)化酶激活劑，能夠調(diào)控細胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)元，而且Forskolin可進一步使神經(jīng)細胞軸突生長。進而用DMH1誘導(dǎo)，是因DMH1為一種BMP的有效抑制劑，可阻礙BMP的路線，骨髓間充質(zhì)干細胞就不會往中胚層分化，所以，可幫助細胞產(chǎn)生神經(jīng)元。本研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)后，細胞折射性顯著增強，其狀態(tài)顯著變化，并細胞長突起，構(gòu)成網(wǎng)狀。誘導(dǎo)后，通過Western Bolt 檢測結(jié)果顯示，特異性NSE、Nestin及SOX1蛋白的表達水平提高。并且RT—PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細胞中的蛋白基因表達水平顯示，內(nèi)參β-actin蛋白的表達水平無明顯變化，而NSE、Nestin、SOX1的表達水平明顯上升。

綜上所述，采用DMH1聯(lián)合Forskolin誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞后，產(chǎn)生神經(jīng)元細胞。由于DMH1、Forskolin的小分子化合物還不明確，誘導(dǎo)時存在一定的安全隱患，仍需改進DMH1、Forskolin聯(lián)合協(xié)作誘導(dǎo)的方法，如果深入探究或許對再生醫(yī)學(xué)迅速進展有幫助。