黃酮類化合物對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用

邢春玉 孫浩晨

（天津天獅學(xué)院 天津 301700）

目前，針對(duì)藍(lán)藻水華的控制技術(shù)可以歸納為物理、化學(xué)、生物三類，各類技術(shù)均有明顯的特點(diǎn)，但也均存在一定的局限性。物理方法可分為工程除藻和直接物理除藻，雖然見(jiàn)效快，但耗費(fèi)人力、物力，且易復(fù)發(fā)[1-2]；化學(xué)方法往往只能短期奏效，且容易造成“二次污染”[3]；生物方法強(qiáng)調(diào)的是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的管理，從營(yíng)養(yǎng)環(huán)節(jié)來(lái)控制藍(lán)藻生長(zhǎng)，具有經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。水生植物對(duì)藍(lán)藻的抑制可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、調(diào)節(jié)水體的氮磷比例來(lái)實(shí)現(xiàn)，還可以通過(guò)其分泌的化感物質(zhì)來(lái)顯著抑制藍(lán)藻生長(zhǎng)[4-6]?；形镔|(zhì)在水體生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用研究備受關(guān)注，酚酸類、黃酮類、生物堿類等物質(zhì)是目前發(fā)現(xiàn)數(shù)量最多且活性較強(qiáng)的化感物質(zhì)[7-9]，其中黃酮類化感物質(zhì)具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，在控制水華藻類方面得到了越來(lái)越廣泛的研究和關(guān)注[10]。文章選取蘆丁和槐米中提取的黃酮類化合物進(jìn)行抑藻試驗(yàn)，通過(guò)研究其對(duì)銅綠微囊藻藻細(xì)胞密度和葉綠素a含量的影響，為藍(lán)藻水華的治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用銅綠微囊藻（型號(hào)FACHB-1328 ）購(gòu)于武漢水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98 %）購(gòu)自天津市盛淼科技有限公司，槐米購(gòu)買于中藥市場(chǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 銅綠微囊藻的擴(kuò)大培養(yǎng)

將藻種接種到BG11 培養(yǎng)基中，在溫度為25 ±1℃，光照強(qiáng)度4 000 lx，光暗比為12 h∶12 h 條件下培養(yǎng)，每4 h 搖動(dòng)一次，培養(yǎng)3～4 d 達(dá)到對(duì)數(shù)期，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）蘆丁對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用研究

配置蘆丁BG11 溶液，使其濃度為45 mg/L、75 mg/L、105 mg/L，經(jīng)0.22 μm 濾膜除菌。在無(wú)菌條件下準(zhǔn)確吸取除菌后的蘆丁BG11 溶液10 mL 和處于對(duì)數(shù)期的藻液40 mL加入100 mL BG11 培養(yǎng)基中，使得藻液中蘆丁最終濃度為3mg/L、5mg/L、7mg/L。銅綠微囊藻的初始藻密度為0.15×105cells/mL。接種后在溫度為25 ±1℃，光照4000 lx，光暗比為12 h∶12 h 的環(huán)境條件下培養(yǎng)。每天測(cè)定其藻細(xì)胞密度和葉綠素a 含量，觀察銅綠微囊藻的生長(zhǎng)情況。

（2）槐米黃酮化合物對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用研究

準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥、粉碎后的槐米1 g、2 g、4 g。按照料液比1∶20 加入60 %的乙醇溶液，60 ℃下水浴處理30 min，在超聲溫度為60 ℃，功率為200 W 的條件下提取30 min 后，將提取液置于4 000 r/min 的離心管中離心10 min，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮。待濃縮后倒入100 mL BG11 培養(yǎng)基，搖勻后經(jīng)0.22 μm 的濾膜除菌。在無(wú)菌條件下準(zhǔn)確吸取除菌后的槐米BG11 溶液10 mL 和處于對(duì)數(shù)期的菌液40 mL 加入100 mL BG11 培養(yǎng)基中，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照，3 個(gè)處理組中黃酮濃度分別為5.28 mg/L、8.94 mg/L、11.86 mg/L。每隔24 h 測(cè)定其藻細(xì)胞密度和葉綠素a 的含量。

1.2.3 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定方法

（1）藻細(xì)胞密度的測(cè)定

取搖勻后的藻液，采用25×16 型號(hào)血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。藻類抑制率公式為：IR=(1-Nt/Mt)×100 %，式中IR為抑制率，Nt為處理組第t 天藻細(xì)胞密度，Mt為對(duì)照組第t 天藻細(xì)胞密度。

（2）葉綠素a 含量的測(cè)定

取銅綠微囊藻藻液10 mL 置于離心管中，4 500 r/min 離心10 min，取底部藻細(xì)胞置于研缽中，進(jìn)行研磨，分3 次加入95 %乙醇，使總體積為10 mL。提取葉綠素后置于4 000 r/min 的離心管中離心10 min，取上清液，以95 %乙醇做空白對(duì)照，分別在波長(zhǎng)665 nm、649 nm 下測(cè)其吸光度值。根據(jù)公式Ca（mg/L）=13.95 OD665-6.88 OD649計(jì)算葉綠素a 的含量。

（3）蘆丁及槐米黃酮化合物含量的測(cè)定

采用分光光度法測(cè)定蘆丁及槐米總黃酮的含量[11]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁對(duì)銅綠微囊藻藻密度的影響

從圖1可以看出，不同濃度蘆丁對(duì)銅綠微囊藻均表現(xiàn)出抑制作用。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蘆丁對(duì)銅綠微囊藻抑制作用明顯增加，在蘆丁濃度為7mg/L 處理組中，培養(yǎng)7d后，銅綠微囊藻抑制率可達(dá)到57.23 %（見(jiàn)表1）。

表1 蘆丁對(duì)銅綠微囊藻的抑制率（%）

2.2 槐米黃酮對(duì)銅綠微囊藻藻密度的影響

圖2顯示了不同濃度槐米黃酮提取物對(duì)銅綠微囊藻的影響。在藻類培養(yǎng)初期，對(duì)照組和處理組中藻細(xì)胞密度差別不大，從第3 天開(kāi)始對(duì)照組中藻細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)，處理組藻細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢。11.86 mg/L 槐米黃酮對(duì)銅綠微囊藻的抑制率可達(dá)到73.20%。

表2 槐米黃酮化合物對(duì)銅綠微囊藻的抑制率（%）

2.3 蘆丁對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a 含量的影響

葉綠素a 含量的變化可以揭示出藻類的生長(zhǎng)情況，如圖3所示，不同濃度蘆丁處理組中銅綠微囊藻中葉綠素a 含量均顯著低于對(duì)照組，對(duì)照組中葉綠素a 含量一直保持較高的水平。說(shuō)明蘆丁可以進(jìn)入藻細(xì)胞，破壞藻類的光合系統(tǒng)，引起葉綠素a 的降解，以此來(lái)抑制藻類的生長(zhǎng)。

2.4 槐米黃酮化合物對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a 含量的影響

加入槐米黃酮化合物的銅綠微囊藻處理組和對(duì)照組藻葉綠素a 含量變化如圖4所示。培養(yǎng)7 d 后，對(duì)照組中葉綠素a 的含量明顯增加。與對(duì)照組相比，處理組中葉綠素a 含量表現(xiàn)出升高緩慢或下降的趨勢(shì)。從圖4可以看出3 個(gè)處理組中葉綠素a 含量變化與藻密度的變化趨勢(shì)基本一致。

3 結(jié)論

本研究中蘆丁及槐米中提取的黃酮類化合物對(duì)銅綠微囊藻均表現(xiàn)出一定的抑制作用，根據(jù)藻細(xì)胞密度和葉綠素a含量變化來(lái)揭示黃酮類物質(zhì)對(duì)藻類的抑制情況，得出如下結(jié)論：

（1）蘆丁對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)具有抑制效果，在不同濃度下抑制效果不同：濃度越高，對(duì)藻類的抑制效果越明顯，使得藻細(xì)胞密度降低，葉綠素a 含量下降。

（2）槐米中提取的黃酮類化合物對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)亦具有抑制效果，且抑制作用較強(qiáng)；在11.86 mg/L黃酮類化合物培養(yǎng)藻類7 d，抑制率可達(dá)到73.20%。

（3）黃酮類化合物可通過(guò)影響銅綠微囊藻的光合作用系統(tǒng)來(lái)抑制其生長(zhǎng)。黃酮類化合物的存在會(huì)降低藍(lán)藻細(xì)胞的葉綠素a 含量，通過(guò)降低藻細(xì)胞的光能利用率從而影響其光合作用。

本研究中蘆丁及槐米黃酮化合物能有效抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，因植物中提取的黃酮類化合物本身具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，且成本低，不會(huì)引發(fā)水環(huán)境污染，因此可廣泛運(yùn)用到藍(lán)藻水華的治理中。