木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白工藝優(yōu)化研究

甘 雨 李富貴 馬海銳 王致遠(yuǎn) 冉 權(quán) 陶志東 馬娜娜 丁功濤

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅蘭州 730124；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅蘭州 730030）

馬鈴薯是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品之一，因其抗逆性強(qiáng)，在我國被廣泛栽培，成為世界上僅次小麥、水稻和玉米的第四大糧食作物[1]。馬鈴薯蛋白是馬鈴薯淀粉加工的副產(chǎn)物，新鮮的馬鈴薯塊莖中蛋白質(zhì)含量為1.7%～2.1%，分為高分子蛋白質(zhì)、糖蛋白、蛋白酶抑制劑三部分[2]。馬鈴薯蛋白屬于完全蛋白質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源，在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景，其氨基酸組成有19 種，營養(yǎng)價(jià)值很高，能預(yù)防心血管系統(tǒng)的脂肪沉積，保持動(dòng)脈血管的彈性，防止過早發(fā)生動(dòng)脈粥樣化，還可防止肝、腎中結(jié)締組織的萎縮和膠原病[3-4]。馬鈴薯蛋白水解物是以馬鈴薯蛋白為原料，在酸、堿或酶的作用下，將馬鈴薯蛋白水解為小分子肽以及游離氨基酸，Asokan 等[5]從馬鈴薯蛋白水解物中分離出2 種多肽，利用鼠心成肌細(xì)胞（H9C2）作為肥大心肌體外模型。

酶法水解馬鈴薯蛋白的研究，最初是利用酶降解部分蛋白質(zhì)，增加其分子內(nèi)、分子間交聯(lián)或連接特殊功能基團(tuán)，改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，以獲得良好加工特性的研究[6-7]。目前，關(guān)于馬鈴薯蛋白水解工藝的研究，主要集中于單酶或多酶法[8]。高丹丹等[9]以馬鈴薯渣為原料，用木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白，通過優(yōu)化最佳工藝，得到水解度為20.19 %的產(chǎn)物。趙晶等[10]利用胰蛋白酶水解馬鈴薯蛋白，通過優(yōu)化工藝條件，蛋白質(zhì)水解度可達(dá)39.9%。張澤生[11]等利用三種酶KD1、KD2、KD3水解馬鈴薯蛋白，比較三種酶的水解度，通過優(yōu)化工藝，得到KD3的水解度最高，水解度為48.794 %。本實(shí)驗(yàn)采用酶解法，以馬鈴薯蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白探究pH 值、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶添加量對酶解效果的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，探究較佳的水解條件。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

市場選購馬鈴薯蛋白粉（純度90 %，陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司），木瓜蛋白酶（200 000 U/g，南寧龐博生物工程有限公司），中性蛋白酶（150 000 U/g，河南仰韶生化工程有限公司），堿性蛋白酶（200 000 U/g，河南仰韶生化工程有限公司），復(fù)合蛋白酶（150 000 U/g，安琪酵母股份有限公司），氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸、甲醛（分析純，天津市百世化工有限公司）。

1.2 儀器和設(shè)備

AR224 CN 型電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；L9 型可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；FOSS 全自動(dòng)凱氏定氮儀，DenMark；HH-S4A 型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；GL21 M 型高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

選用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶進(jìn)行水解酶的篩選。以廠家提供的商品最適pH 值和溫度，取5 g 馬鈴薯蛋白，按照1 g 蛋白添加1 000 U 單位的酶水解3 h[12]，利用甲醛滴定法測定水解后的氨基態(tài)氮含量，并計(jì)算馬鈴薯蛋白的水解率，最終確定實(shí)驗(yàn)用酶為木瓜蛋白酶。

1.3.2 馬鈴薯蛋白水解單因素實(shí)驗(yàn)

（1）酶添加量對馬鈴薯蛋白水解度的影響

稱取5 g 馬鈴薯蛋白粉溶于100 mL 去離子水中，調(diào)整溶液初始pH 值為6，分別加入0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的木瓜蛋白酶，55 ℃水解3 h 后，利用甲醛滴定法測定酶解液的水解度。

（2）酶解時(shí)間對馬鈴薯蛋白水解度的影響

稱取5 g 馬鈴薯蛋白粉溶于100 mL 去離子水中，在溶液初始pH 值為6，酶濃度0.5%的條件下，于55 ℃分別水解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 后，利用甲醛滴定法測定酶解液的水解度。

（3）酶解溫度對馬鈴薯蛋白水解度的影響

稱取5 g 馬鈴薯蛋白粉溶于100 mL 去離子水中，在溶液初始pH 值為6，酶濃度0.5%，分別于50 ℃、52.5 ℃、55 ℃、57.5 ℃、60 ℃條件下水解3 h 后，利用甲醛滴定法測定酶解液的水解度。

（4）pH 值對馬鈴薯蛋白水解度的影響

稱取5 g 馬鈴薯蛋白粉溶于100 mL 去離子水中，分別調(diào)節(jié)溶液初始pH 值為4.5、5、5.5、6、6.5、7，在酶濃度0.5%的條件下，55 ℃水解3 h 后，利用甲醛滴定法測定酶解液的水解度。

1.3.3 木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的正交實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH 值四個(gè)因素，以酶解馬鈴薯蛋白的水解率為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[13]，采用L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)表，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用SPSS 和Origin2016 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.4 數(shù)據(jù)測定方法

馬鈴薯蛋白含量測定：凱氏定氮法[14]。

式中：

X：樣品中蛋白質(zhì)的含量（g/100 g）。

V1：試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積（mL）。

V2：試劑空白組消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積(mL)。

C：硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度（mol/L）。

0.0140：1.0 mL 硫酸[c（1/2H2SO4）=1.000 mol/L]或鹽酸[c（HCl）=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量（g）。

m：試樣的質(zhì)量（g）。

V3：吸取消化液的體積（mL）。

100：換算系數(shù)。

酶解液中氨基態(tài)氮的含量測定：甲醛滴定法[15]

式中：

X：樣品中氨基酸態(tài)氮的含量（g/ 100 mL）。

V1：測定用樣品稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL）。

V2：試劑空白組加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL）。

C：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/L）。

0.014：與1.00 mL 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（NaOH）=1.000 mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量（g）。

V：吸取試樣的體積（mL）。

V3：樣品稀釋液的取用量（mL）。

V4：樣品稀釋液的定容體積（mL）。

100：單位換算系數(shù)。

水解度計(jì)算[16]：

水解度（%）=（氨基酸態(tài)氮／樣品中總氮）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 篩選實(shí)驗(yàn)用酶水解率對比

由表2可知，利用不同酶水解馬鈴薯蛋白，計(jì)算其水解率，以馬鈴薯蛋白水解率為篩酶實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的水解率分別為29.61 %、11.66 %、14.18 %和19.28 %。因此本實(shí)驗(yàn)選用木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白。

2.2 酶添加量對馬鈴薯蛋白水解率的影響

由圖1可知，當(dāng)酶添加量在0.3%～0.8%之間時(shí)，水解率隨著酶添加量增加而不斷增加，當(dāng)酶添加量達(dá)到0.6%時(shí)水解速率逐漸降低。其主要原因可能是隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，酶解產(chǎn)物過多阻礙了馬鈴薯蛋白和木瓜蛋白酶之間基團(tuán)的結(jié)合，導(dǎo)致水解率下降。另外，隨著反應(yīng)增加水解產(chǎn)物濃度后會(huì)增加反應(yīng)體系的黏性和產(chǎn)物抑制[17]，從經(jīng)濟(jì)效益上考慮，選擇0.6%酶添加量。

2.3 酶解時(shí)間對馬鈴薯蛋白水解率的影響

由圖2可知，馬鈴薯蛋白的水解率隨著水解時(shí)間的延長而不斷增加，直到底物被水解完，水解率變?yōu)橐粋€(gè)定值。當(dāng)酶解時(shí)間超過3 h 后，水解速率呈現(xiàn)降低的趨勢。其主要原因可能是隨著酶解的進(jìn)行，酶解產(chǎn)物不斷增加，當(dāng)酶解產(chǎn)物積累到一定量后會(huì)對木瓜蛋白酶產(chǎn)生抑制作用[18]。選擇3 h 為水解時(shí)間。

2.4 酶解溫度對馬鈴薯蛋白水解率的影響

由圖3可知，溫度在50 ℃～55 ℃之間時(shí)，水解率呈增長趨勢，在55 ℃時(shí)水解率達(dá)到最大；溫度在55 ℃～60 ℃之間時(shí)，水解率呈下降趨勢?？赡苁怯捎跍囟冗^高破壞了酶的非共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)，使酶的結(jié)構(gòu)改變而失活，而溫度過低導(dǎo)致內(nèi)能不夠，不足以支持酶和蛋白之間基團(tuán)的集合，從而造成酶活力下降，進(jìn)而影響馬鈴薯蛋白水解[19]，因此選擇55 ℃為水解溫度。

2.5 pH 值對馬鈴薯蛋白水解率的影響

由圖4可知，pH 值從4.5 到6.0 時(shí)，水解率隨著pH 值的升高而升高，pH 值從6.0 到7.0 時(shí)，水解率隨著pH 值升高而下降，pH 值為6 的時(shí)候水解率最高，達(dá)到20.15%。其原因可能是木瓜蛋白酶分子上的結(jié)合基團(tuán)受到極端pH 值的影響而發(fā)生解離，導(dǎo)致底物無法與酶結(jié)合；或者是催化基團(tuán)受到極端pH 值的影響發(fā)生解離，導(dǎo)致底物無法被催化生成產(chǎn)物[20]，所以呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，最終選擇6.0 為水解pH 值。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3中的R 值分析可知，對于馬鈴薯蛋白質(zhì)的水解率，A、B、C、D因素對木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的影響次序是D＞B＞A＞C。pH 值是主要因素，酶解時(shí)間是一般因素，酶添加量和酶解溫度是次要因素，較優(yōu)組合為A3B2C2D1，即酶添加量0.7%、時(shí)間3 h、水解溫度55 ℃、pH 值6.0。選擇該自由組合條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出在該條件下馬鈴薯蛋白的水解率為28.23 %，與正交試驗(yàn)中提取率最高的一組進(jìn)行比較，可知馬鈴薯蛋白質(zhì)的較佳水解條件為 A3B2C2D1，即酶添加量0.7%、時(shí)間3 h、水解溫度55 ℃、pH 值 6.0。此條件下馬鈴薯蛋白的水解率為28.23 %。

表3 正交實(shí)驗(yàn)與極差分析

2.7 結(jié)果分析討論

由表4可知，本次實(shí)驗(yàn)中用木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白酶的水解率不是很高，可能是因?yàn)槊傅姆N類不同或者水解馬鈴薯蛋白的種類不同，導(dǎo)致水解效率有差異，不同的酶其分子的酶活性基團(tuán)有差異，結(jié)合馬鈴薯蛋白或者解離馬鈴薯蛋白的能力各不相同，不同的馬鈴薯蛋白分子用于與酶結(jié)合側(cè)鏈基團(tuán)不同，直接影響了結(jié)合效率及水解效率[21-22]。

表4 本實(shí)驗(yàn)水解率與其他實(shí)驗(yàn)水解率對比

3 結(jié)論

本研究以馬鈴薯蛋白粉作為原料，利用木瓜蛋白酶研究水解工藝，以水解率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，對水解條件優(yōu)化，最終水解較優(yōu)條件為酶解溫度55 ℃、酶添加量為0.7%、酶解時(shí)間3 h、pH 值6.0，本研究優(yōu)化了木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白條件，最終驗(yàn)證水解率高達(dá)28.23%。