豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液異常毒性檢查研究

徐 磊 游開鏗 鄭 青 林祚貴 郜飛燕 胡小榕 傅光華 施少華 劉小龍 許秀梅 杜 君 廖惠珍 黃 瑜＊ 張淵魁＊

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福州 350119；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；3.派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500；4.兆豐華生物科技（南京）有限公司 南京 211102；5.福州市長樂區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 福建長樂 350200）

轉(zhuǎn)移因子（Transfer Factor，TF）是動物白細胞中具有免疫活性的T 淋巴細胞所釋放的一類能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的可透析小分子量物質(zhì)。 作為多肽類物質(zhì)，TF 的肽分子量相比蛋白質(zhì)小很多， 但具有較高的生物學(xué)活性，具有無毒副作用、無藥物殘留、無抗原性、分子質(zhì)量小、不產(chǎn)生對抗抗體、不引起過敏反應(yīng)、使用安全、作用迅速、效果顯著、來源廣、無種屬特異性和可超越種系界限應(yīng)用的優(yōu)點， 具有十分重要的研究價值和應(yīng)用價值[1-6]。 在人類醫(yī)學(xué)中，TF 不僅已成為當前無法治療的疾病的標準療法， 而且已成為現(xiàn)有療法具有毒副作用的疾病的標準療法。 此外，TF 還作為與抗菌藥或抗病毒藥聯(lián)合使用的輔助藥物， 已被廣泛用于無確切療法的細菌病和病毒病的治療[7-8]。 1979 年TF 被引入到獸醫(yī)免疫和臨床治療中，可以提高豬、雞、羊等多種動物的細胞免疫水平和體液免疫水平[9-14]。

有別于藥品本身具有的毒性特征， 異常毒性是指由生產(chǎn)制造過程中引入或其它原因所致的毒性。異常毒性檢查法，不僅可用于檢查藥品在生產(chǎn)制造、制劑過程中引入的外來異物， 而且可用于檢查藥物降解產(chǎn)生的不正常毒性反應(yīng)， 適用于對多組分多成分制品中有毒雜質(zhì)和有毒成分的檢測[15-16]。

本研究旨在建立TF 的異常毒性檢查方法，并對本發(fā)明專利TF 制造技術(shù)進行工藝驗證， 按照本課題組已授權(quán)國家發(fā)明專利TF 制造技術(shù)制備3 批TF[17-20]，通過小鼠動物模型建立異常毒性檢查方法，并對3 批TF 開展異常毒性檢查， 以期明確本發(fā)明專利TF 制造技術(shù)對異常毒性的控制效果， 為規(guī)?；圃飓F用TF 提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物 體重17～20 g 健康昆明小鼠，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 TF 制備 按照本課題組已授權(quán)的國家發(fā)明專利制備3 批TF[17-20]：以健康豬脾臟為原料，經(jīng)勻漿、細胞破碎、滅活、微濾、超濾、除菌后精制而成，3 批TF 分別為 TF-1、TF-2、TF-3。 經(jīng)檢驗， 所制備 3 批TF 的多肽含量分別為 2.92 mg/mL、2.68 mg/mL 和2.60 mg/mL， 脫 E 受體法效力分別為 15.7%、15.4%和 17.1%，核糖含量分別為 59.8 μg/mL、58.4 μg/mL和 56.3 μg/mL， 細菌內(nèi)毒素含量均不超過10 EU/mL，pH 值 分 別 為 6.88、6.92 和 6.96， 在253 nm 處均有最大吸收峰，OD260nm/OD280nm的比值分別為 2.29、2.30 和 2.32（均大于 1.9），無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、安全檢驗、過敏反應(yīng)檢查、蛋白質(zhì)定性檢驗、熱原檢查均合格。

1.3 試劑 磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、生理鹽水均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器 光學(xué)顯微鏡為Nikon 公司產(chǎn)品， 型號：ECLIPSE E100； 紫外分光光度計為日本島津產(chǎn)品，型號：UVmini-1240；離心機為湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品，型號：TDZ5-WS；電子天平為上海精科天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品， 型號：JA2603B； 水浴鍋為上海上登實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品，型號：HH-S2。

1.5 試驗設(shè)計 按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄“異常毒性檢查法”對3 批TF 進行異常毒性檢查，具體如下：取小鼠 15 只，隨機分成 3 組：第 1 組、第 2 組和第 3 組，每組 5 只，分別編號 1～15。 3 批 TF 各隨機抽取 3 瓶，TF-1、TF-2 和 TF-3 分別對應(yīng)混勻后作為待檢樣品。第1、2 及3 組小鼠分別以0.5 mL/只劑量腹腔注射待檢樣品，進行異常毒性檢查，試驗設(shè)計見表1。

表1 異常毒性檢查試驗設(shè)計

1.6 結(jié)果判定 48 h 內(nèi)小鼠應(yīng)全部健活；如果小鼠有死亡， 應(yīng)選取加倍數(shù)量小鼠開展重檢，48 h 內(nèi)重檢小鼠應(yīng)全部健活。

2 結(jié) 果

結(jié)果顯示，3 組小鼠于腹腔注射后48 h 內(nèi)均健活，15 只小鼠全部沒有出現(xiàn)異常情況，見表2。因此，判定3 批TF 無異常毒性，3 批TF 的異常毒性檢查結(jié)果均符合現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定。

表2 試驗結(jié)果

3 結(jié) 論

目前， 我國的獸用藥品檢驗是按照 《中國獸藥典》2015 年版的標準來執(zhí)行的。 在獸藥典中安全性檢查包括有無菌、微生物限度、熱原、細菌內(nèi)毒素、異常毒性、過敏等檢查項目。 異常毒性、過敏檢查是生物類藥物所特有。 其中， 異常毒性檢查法是用于檢查藥物的生產(chǎn)工藝水平， 而不是檢查藥物本身毒性[21]。

常規(guī) TF 制備技術(shù)利用透析法回收 TF，即Lawrence 方法。 該法工藝簡單易于實現(xiàn)、操作簡單、設(shè)施設(shè)備投入少。 但是，Lawrence 方法依靠透析袋內(nèi)外濃度差完成透過分離，屬于無動力分離，不僅具有透過效率差、 分離收率低、 物料浪費大等工藝劣勢，而且Lawrence 方法工藝時間長、制備周期長、容易細菌繁殖導(dǎo)致所獲得TF 容易腐敗、 內(nèi)毒素含量高。 此外，Lawrence 方法制備 TF，機械化程度低，主要依靠人員手工操作將透析原液轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)進行透析，在人工裝袋過程中，透析原液中的外源細菌和外源病毒極易污染透析袋外壁， 并且所用透析袋的完整性無法驗證，容易出現(xiàn)不易察覺的輕微損傷，這些均導(dǎo)致TF 異常毒性檢驗容易出現(xiàn)不合格。 因此， 生產(chǎn)穩(wěn)定性差，Lawrence 方法不適合規(guī)?；a(chǎn)。

本課題組已授權(quán)的國家發(fā)明專利TF 制備技術(shù)，采用切向流過濾方法制備TF[17-20]。 有別于Lawrence方法及其他常規(guī)垂直過濾方法， 切向流過濾方法采用液體流動方向與過濾方向垂直的工藝流程，即：液體流動方向與過濾膜平面平行， 部分液體在側(cè)向跨膜壓力的作用下垂直穿過膜孔，實現(xiàn)組分分離。切向流過濾方法會產(chǎn)生二次流，即湍流。在二次流的作用下，流動液體會在過濾介質(zhì)表面產(chǎn)生剪切力，使過濾介質(zhì)表面的沉淀從膜表面剝離，減少了凝膠層（濾餅層）在膜表面的堆積，降低了過濾介質(zhì)表面堵塞和污染的機率，保證了穩(wěn)定的過濾速度[22]。

本試驗按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄中“異常毒性檢查法”，對本課題組已授權(quán)國家發(fā)明專利TF 制備技術(shù)所制備的3 批豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液開展異常毒性檢查。 結(jié)果顯示，3 批豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液腹腔注射后48 h 內(nèi)全部小鼠均健活，符合現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定。 結(jié)果表明，本發(fā)明專利制備的豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液無異常毒性， 制造工藝異常毒性的控制效果良好，保證TF 制品的安全性。