山仙顆粒對(duì)大鼠肝癌前病變Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

潘艷芳，賈曉濤，芮 冉，應(yīng)小平，方 艷，孟博博

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712046；2.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710006）

原發(fā)性肝癌是全球第四大導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因。在過去幾年中,大多數(shù)國家的5年生存率不到20%［1-2］。在我國,由于乙肝病毒的高感染率而導(dǎo)致慢性肝病、肝硬化、肝癌的高發(fā)性［3-4］。肝炎-肝纖維化-肝癌前病變-肝癌是慢性肝病的惡性發(fā)展過程,在目前尚不能治愈肝癌的情況下,世界著名科學(xué)雜志提出“預(yù)防腫瘤的發(fā)生比治療腫瘤更重要”［5］。肝癌前疾病是指具有惡性轉(zhuǎn)變可能的肝臟良性病變,包括肝硬化、肝細(xì)胞的再生結(jié)節(jié)、腺瘤樣增生等［6］。若能及時(shí)阻斷其病理進(jìn)程,則可有效預(yù)防肝癌發(fā)生?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),肝癌前疾病的發(fā)生發(fā)展及惡化與信號(hào)通路的改變、血管生成及機(jī)體免疫微環(huán)境的異常、端粒酶活性的表達(dá)等因素密切相關(guān)［7-8］。其中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路的改變?cè)诟谓M織惡性改變中的作用尤為重要。研究發(fā)現(xiàn),該信號(hào)通路不僅能調(diào)節(jié)正常肝細(xì)胞的再生,且能通過活化肝星狀細(xì)胞、激發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)的形成、改變肝內(nèi)膽管形態(tài)等促進(jìn)肝癌前疾病的發(fā)生發(fā)展［9-11］。因此課題組設(shè)想,是否可以通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白以抑制或逆轉(zhuǎn)其惡變。山仙顆粒是陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科團(tuán)隊(duì)研發(fā)的抗腫瘤中成藥,其良好的療效使其廣泛應(yīng)用于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝臟及肺臟等腫瘤的治療［12-13］。前期研究的結(jié)果,明確了山仙顆粒治療肝癌的機(jī)理［14］。本研究擬通過制造肝癌前疾病動(dòng)物模型,采用HE染色、Masson染色、實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot等實(shí)驗(yàn)方法,觀察山仙顆粒是否通過影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路來抑制或逆轉(zhuǎn)肝癌前疾病的發(fā)生發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF雄性SD大鼠90只,體質(zhì)量（190±10）g,由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （川）2015-030。

1.2 藥物、試劑與儀器 山仙顆粒由西洋參、鱉甲、龜板、莪術(shù)、生山楂、仙鶴草、丹參、薏苡仁、豬苓組成,是陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑 （生產(chǎn)批號(hào)20180204）,由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥劑科制備,水提過濾、減壓濃縮干燥,干膏得率約為25.2%,成品顆粒的臨界相對(duì)濕度為62%,休止角為29.89,規(guī)格10 g/包。分別配置比例為山仙顆粒（g）∶生理鹽水（mL）為1 ∶40,配成0.1、0.05、0.025 g/mL的高、中、低劑量混懸液,制備后貯存于4 ℃冰箱中備用。根據(jù)人、動(dòng)物體質(zhì)量計(jì)量換算法計(jì)算,大劑量組（2 g/kg）、中劑量組（1 g/kg）、小劑量組（0.5 g/kg）分別相當(dāng)于臨床等效劑量的4、2、1倍。二乙基亞硝胺購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司（生產(chǎn)批號(hào)20180309,規(guī)格為25 mL/瓶）。KYA1797K（S8327,美國Selleck公司）；Anti-Wnt3a抗體（ab219412,英國Abcam公司）；Anti-β-catenin抗體（ab6302,英國Abcam公司）；Anti-c-Myc抗體 （ab32072,英國Abcam公司）；Anti-GAPDH抗體 （ab9485,英國Abcam公司）；RNA iso Plus試劑盒（D9108B,日本Takara公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（D6130,日本Takara公司）；羅氏Green PCR Master Mix （QPK-201,日本Toyobo公司）；HE染色試劑盒（G1120,北京索萊寶科技有限公司）；Masson染色試劑盒（G1340,北京索萊寶科技有限公司）；RM2235石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司）；7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）；蛋白電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 80只SD大鼠隨機(jī)分為空白組,模型組,山仙顆粒大、中、小劑量組和Wnt/βcatenin抑制劑KYA1797K （陽性對(duì)照組）。大鼠肝癌前病變模型制備［15-16］：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn),將配制好的二乙基亞硝胺分別腹腔注射（50 mg/kg,2次/周）于模型組,山仙顆粒大、中、小劑量組,Wnt/β-catenin抑制劑組大鼠,空白組大鼠腹腔注射生理鹽水,至16周結(jié)束。山仙顆粒大、中、小劑量組大鼠分別以中藥灌胃（2、1、0.5 g/kg）,每日1次；Wnt/β-catenin抑制劑組大鼠腹腔注射KYA1 797 K （25 mg/kg）,每日1次；同時(shí),空白組、模型組給予等劑量生理鹽水灌胃,連續(xù)給藥16周結(jié)束。

1.3.2 取材及指標(biāo)測(cè)量 16周最后一次造模和用藥后禁食24 h,大鼠稱定質(zhì)量,并用 10% 的水合氯醛（0.35 mL/kg,腹腔注射）麻醉,75%的酒精消毒腹部皮膚并放于超凈工作臺(tái),開腹,下腔靜脈取血送于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生化科檢測(cè)肝功能相關(guān)指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）的變化。ALT、AST和GGT是診斷肝臟疾病的重要指標(biāo)。隨著肝細(xì)胞損傷情況越嚴(yán)重,其血清ALT、AST和GGT水平上升程度越高。腹腔內(nèi)取出肝臟,稱定質(zhì)量、觀察肝臟顏色、質(zhì)地、表面是否有結(jié)節(jié)及結(jié)節(jié)數(shù)目,若有結(jié)節(jié),取結(jié)節(jié)及其周圍肝臟約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 2塊,如果沒有結(jié)節(jié)和病變,肝臟隨機(jī)取約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 1塊放入10% 的福爾馬林中固定,石蠟包埋備,用另一塊放于-80 ℃?zhèn)溆?其余肝臟組織放于-80 ℃保存。

1.3.3 HE染色 取各組的肝組織進(jìn)行固定、脫水、浸蠟與包埋,以3 μm厚度進(jìn)行切片；60 ℃烤片1 h后常規(guī)脫蠟至水。取出玻片,蘇木素浸泡5～20 min進(jìn)行染色,用自來水沖洗1 min,鹽酸乙醇分化液分化15 s,自來水沖洗15 min,伊紅染色2 min,自來水浸泡5 min。然后進(jìn)行脫水與透明,中性樹膠進(jìn)行封片。晾干后顯微鏡觀察。

1.3.4 Masson染色 取各組的肝組織切片脫蠟至水,用配制好的Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min。用1%鹽酸乙醇分化液分化5～15 s、水洗,Masson藍(lán)化液返藍(lán)3～5 min、水洗、蒸餾水洗1 min。麗春紅品紅染色液染色。磷鉬酸溶液洗1～2 min,弱酸工作液洗1 min。直接放入苯胺藍(lán)染色液中染色1～2 min,弱酸工作液洗1 min。常規(guī)脫水透明中性樹膠進(jìn)行封片；晾干后顯微鏡觀察。然后用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)Masson染色的病理組織進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量內(nèi)容：觀察每×100視野下假小葉數(shù)目、纖維間隔數(shù)目和纖維間隔的平均厚度（μm）。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR取出肝組織后進(jìn)行RNA提取。按Trizol法提取總RNA,核酸紫外分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)稀釋的RNA提取物的OD值和含有量,判斷RNA純度,計(jì)算RNA含有量。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒和羅氏Green PCR Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,設(shè)計(jì)合成針對(duì)不同目的片段的引物,以cDNA為模板進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增。引物序列如下,Gapdh正向?yàn)?’ -AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’,Gapdh反向?yàn)?’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’； Wnt-3a正向?yàn)?’ -TGCTGGACAAAGCTACCAGG-3’,Wnt-3a反向?yàn)?’ -CGAGACACCATCCCACCAAA-3’； β-catenin正向?yàn)?’ -CTGAGGACAAGCCACAGGA-3’,β-catenin反向?yàn)?’ -CACCAATGTCCAGTCCGAGA-3’； c-Myc正向?yàn)?’ -CCACCTCCAGCTTGTACCTG-3’,c-Myc反向?yàn)?’ -GGAGGACTCAGCAGAGGAGA-3’。

1.3.6 Western blot取出凍存的肝組織,將組織加蛋白裂解液進(jìn)行勻漿裂解,收集蛋白,Bradford法定量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液,98 ℃煮10 min,4 ℃放置。制備12% SDS-PAGE （十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺）分離膠和5%濃縮膠,蛋白上樣后用SDS-PAGE電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)移至尼龍膜,然后用5%脫脂牛奶封閉0.5 h,加入一抗4℃孵育過夜。TBST （緩沖液）沖洗5 min,反復(fù)3次,加入二抗常溫?fù)u床1 h孵育,TBST沖洗5 min,反復(fù)3次,滴加化學(xué)發(fā)光劑ECL進(jìn)行發(fā)光顯影。灰度掃描后用ImageJ軟件分析條帶的灰度值,結(jié)果以各目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值的比值表示。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（）表示,多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST、GGT水平比較 肝癌前病變發(fā)生發(fā)展過程中,肝細(xì)胞逐漸受到損傷,肝功能逐漸下降,因此在本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),課題組采集了各組動(dòng)物的靜脈血,測(cè)定反映肝功能相關(guān)指標(biāo)ALT、AST、GGT的變化。如表1所示,與空白組比較,模型組ALT、AST、GGT水平均明顯高于空白組（P＜0.01）；與模型組比較,山仙顆粒小劑量組ALT、GGT均有所降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而山仙顆粒大、中劑量組ALT、AST、GGT均降低明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01,P＜0.05）。與模型組比較,Wnt/β-catenin抑制劑KYA1797K組ALT、AST、GGT均降低明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果表明山仙顆粒大、中劑量能夠明顯減低二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠肝功能的下降。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、GGT水平（，n=15）

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、GGT水平（，n=15）

注：與空白組比較,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

2.2 肝臟總體外觀 如圖1所示,空白組大鼠肝臟顏色鮮紅,表面光滑且無結(jié)節(jié)；模型組大鼠肝臟顏色暗紅,表面不光滑且有大量大小不等的結(jié)節(jié)；山仙顆粒小劑量組大鼠肝臟顏色暗紅,表面凹凸不平,可見較多大小不等的結(jié)節(jié)。山仙顆粒中劑量組大鼠肝臟顏色較暗紅,表面可見大小不等的結(jié)節(jié),其結(jié)節(jié)數(shù)少于模型組和山仙顆粒小劑量組；山仙顆粒大劑量組肝臟顏色稍暗紅,表面不光滑,有顆粒感,可見若干小結(jié)節(jié)。Wnt/β-catenin抑制劑KYA1797K組肝臟顏色變暗,表面不光滑,可見少量小結(jié)節(jié),其結(jié)節(jié)數(shù)明顯比模型組減少。這些結(jié)果表明大、中劑量山仙顆粒能夠明顯緩解二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠肝臟的病變程度。

圖1 各組大鼠肝臟的總體外觀

2.3 HE染色結(jié)果 為了進(jìn)一步觀察肝臟微細(xì)結(jié)構(gòu)的變化,將各組大鼠的肝組織做成石蠟切片進(jìn)行HE染色,如圖2所示,光鏡下觀察,空白組大鼠的肝細(xì)胞形態(tài)正常,沿中央靜脈呈放射狀排列,無明顯的水腫、脂變、壞死和纖維增生；模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂,可見水腫、脂變,肝組織內(nèi)有大量假小葉形成；山仙顆粒小劑量組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂,可見大量肝細(xì)胞水腫、脂變、壞死,肝組織內(nèi)有假小葉生成,但較模型組少；山仙顆粒中劑量組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂較模型組輕,肝組織中未見明顯假小葉,可見大量纖維增生、水腫、脂變、壞死,但較模型組和山仙顆粒小劑量組減輕；山仙顆粒大劑量組大鼠肝細(xì)胞排列基本正常,肝臟內(nèi)有少量纖維增生、細(xì)胞水腫、脂變、壞死,其程度比中劑量山仙顆粒減輕。KYA1797K組大鼠肝細(xì)胞排列基本正常,肝臟內(nèi)有少量纖維增生、細(xì)胞水腫、脂變、壞死,其程度比模型組和山仙顆粒小、中劑量組減輕。這些結(jié)果表明山仙顆粒大、中劑量能夠明顯改善二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠肝臟的病理損傷程度。

圖2 各組大鼠肝臟組織HE染色（×200）

2.4 Masson染色結(jié)果 如圖3所示,空白組大鼠肝細(xì)胞索排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰。模型組大鼠肝組織中纖維增生明顯,藍(lán)色纖維明顯增多、增粗,匯管區(qū)顯著增寬,廣泛假小葉形成,形成纖維間隔破壞界板,分割包繞肝小葉。與模型組比較,KYA1797K組和山仙顆粒中、高劑量組假小葉數(shù)目均明顯減少,纖維間隔的數(shù)目和厚度也明顯減少（P＜0.05、 P＜0.01）,見表2。這些結(jié)果表明山仙顆粒大、中劑量能夠減少二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠肝臟的纖維化程度。

圖3 各組大鼠肝臟組織Masson染色（×100）

2.5 大鼠肝組織中Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達(dá)水平 從慢性肝炎發(fā)展到肝細(xì)胞癌的過程中,Wnt/βcatenin信號(hào)通路被持續(xù)激活,為了檢測(cè)山仙顆粒對(duì)二乙基亞硝胺引起的肝臟損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制研究,本研究檢測(cè)了各組大鼠肝組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分于Wnt-3a、 β-catenin和c-Myc的表達(dá)。如圖4所示,與正常組比較,模型組Wnt-3a、 β-catenin和C-MycmRNA的表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較,山仙顆粒小劑量組Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）,山仙顆粒中劑量組Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。山仙顆粒大劑量組Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達(dá)下降的更顯著（P＜0.01）。KYA1797K組Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達(dá)也顯著降低（P＜0.01）。這些結(jié)果表明山仙顆粒能夠劑量依賴性減少二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達(dá)。

表2 各組大鼠肝組織的假小葉和纖維間隔數(shù)目（，n=15）

表2 各組大鼠肝組織的假小葉和纖維間隔數(shù)目（，n=15）

注：與空白組比較,** P＜0.01；與模型組比較,# P＜0.05,##P＜0.01。

圖4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各種動(dòng)物肝組織中Wnt-3a、 β-catenin、 c-MycmRNA水平

2.6 大鼠肝組織中Wnt-3a、β-catenin和c-Myc蛋白的表達(dá)水平 Western blot檢測(cè)及圖像分析結(jié)果顯示（圖5）,與空白組比較,模型組Wnt-3a、β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較,山仙顆粒大、中劑量組Wnt-3a、β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)量降低,差異明顯（P＜0.01,P＜0.05）,而山仙顆粒小劑量組Wnt-3a、β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)量差異均不明顯（P＞0.05）。與模型組比較,KYA1797K組Wnt-3a、β-catenin和c-Myc蛋白的表達(dá)也顯著降低（P＜0.01）。這些結(jié)果表明山仙顆粒能夠劑量依賴性抑制二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt-3a、β-catenin和c-Myc表達(dá)水平。

3 討論

癌前病變是指某些具有癌變潛在可能性的良性病變或疾病,若長期不能治愈即有可能轉(zhuǎn)變?yōu)榘Ｈ绻茉缙诎l(fā)現(xiàn)和及時(shí)治愈癌前病變和疾病,對(duì)腫瘤的預(yù)防具有重要意義。本研究采用腹腔注射二乙基亞硝胺成功誘導(dǎo)了具有肝硬化背景的肝癌前病變模型,并觀察了山仙顆粒對(duì)肝癌前病變的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)山仙顆粒中、大劑量能夠明顯改善肝癌前病變大鼠的肝功能和緩解其肝臟病變損傷程度。

癌前疾病的發(fā)生發(fā)展及惡化與信號(hào)通路的改變密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝臟再生和肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中都具有重要的作用,本研究首次觀察了山仙顆粒對(duì)肝癌前病變大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響,探討其治療肝癌前病變的作用機(jī)制。Wnt-3a為該信號(hào)通路的重要蛋白,研究證實(shí)在Wnt配體的刺激下,Wnt-3a與跨膜卷曲蛋白受體（FZD）等結(jié)合,從而影響糖原合成激酶3的活性,抑制β-catenin的降解,使其在細(xì)胞質(zhì)中大量聚集,βcatenin聚集量增加到一定程度時(shí)其可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),從而激活該通路下游靶基因c-Myc、cyclinD1等,促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展［17］。據(jù)報(bào)道,肝硬化患者肝臟中β-catenin明顯增高,而通過各種方法抑制β-catenin的表達(dá)可有效改善肝硬化的進(jìn)展［18］。研究發(fā)現(xiàn),β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的聚積是Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的核心事件,且在肝臟非纖維化組織中β-catenin的表達(dá)呈弱陽性,在肝硬化組織中其陽性表達(dá)增加,而在肝癌組織中其呈中等強(qiáng)度表達(dá),使用其通路抑制劑后該蛋白的表達(dá)明顯減弱［19］。本研究中給大鼠腹腔注射KYA1797K,Wnt/β-catenin信號(hào)通路的一個(gè)高度選擇性抑制劑［20］,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制確實(shí)能夠減輕二乙基亞硝胺所致大鼠肝臟的損傷。

山仙顆粒包括西洋參、丹參、莪術(shù)、鱉甲、龜板、生山楂、仙鶴草、薏苡仁、豬苓、全方藥物配伍嚴(yán)謹(jǐn),諸藥合用,共同達(dá)到活血化瘀、益氣養(yǎng)陰、扶正祛邪的功效。本實(shí)驗(yàn)證明,山仙顆粒能夠明顯能夠改善肝癌前病變大鼠肝臟的纖維化程度,降低變性、壞死的肝細(xì)胞數(shù)目,減少異型增生結(jié)節(jié)的數(shù)目和體積。qPCR及Western blot結(jié)果顯示,模型組大鼠的Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA及蛋白表達(dá)量較空白組顯著升高（P＜0.01）,山仙顆粒對(duì)其具有顯著的下調(diào)作用（P＜0.05）。綜上所述,山仙顆粒能夠抑制肝細(xì)胞異常增生及肝硬化形成,有效抑制肝癌前病變的發(fā)生、發(fā)展,其作用機(jī)制與其調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)。

圖5 Western blot檢測(cè)各組大鼠肝組織中Wnt-3a、β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)水平