韓麗娟,黃楚雄,李 潔,嚴守雷,劉義滿
(1.華中農業(yè)大學園藝林學學院,湖北 武漢 430070;2.華中農業(yè)大學食品科學技術學院,湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術研究中心,湖北 武漢 430070;3.武漢市農業(yè)科學院林業(yè)果樹研究所,湖北 武漢 430070)
蓮藕(Nelumbo nuciferaGaertn.)是一種多年生宿根水生草本植物[1],原產于中國和印度,俗稱藕、蓮菜等。蓮藕肥嫩根狀莖可供食用,是我國重要水生蔬菜,在中國已栽培3 000多年,分布廣泛,以長江流域為主[2]。蓮藕不僅富含淀粉、蛋白質、碳水化合物、脂肪等,而且含有礦物質、生物堿、酚類等活性物質[3]。蓮藕的加工品種類繁多,其中有東南亞地區(qū)的蓮藕發(fā)酵糖漿、國內的蓮藕復合飲料、即食藕片、鹽漬藕、脫水藕、蓮藕罐頭、速凍藕等[4-6]。當前有關蓮藕產品風味的研究主要集中在鹵藕[7]、油炸藕夾[8]、蓮藕泡菜[9]、牛骨藕湯和排骨藕湯[10]等加工食品上,但是關注蓮藕本身風味的報道較少。尤其是排骨蓮藕湯,以獨特而鮮美的味道深受湖北、廣東等南方消費者的喜愛。蓮藕作為主要食材,風味是其重要品質指標,因此選擇一種香氣濃郁、符合大眾口味的蓮藕尤其重要。
隨著風味分析技術的發(fā)展,當前測定揮發(fā)性風味物質提取常用的方法包括蒸餾萃取法[11]、溶劑萃取法[12]、頂空掃集法[13]、頂空固相微萃?。╯olid phase micro-extraction,SPME)等[14]。SPME作為一種新的萃取技術,能夠減少風味物質的散失,集采樣、萃取、濃縮、進樣一體,保證了食品風味的完整性,現在已經廣泛應用于食品風味物質的定性定量分析中。電子鼻能夠給出樣品風味成分整體信息。將電子鼻和氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)共同檢測,對所得數據進行融合分析,對檢測風味物質更具有可靠性和合理性。采用SPME技術檢測樣品中風味物質的種類和含量,使用電子鼻技術代表樣品的整體性,已用于蝦膏、大米、魚等食品風味分析中[15-16]。
雖然儀器分析具有客觀性和準確性等諸多優(yōu)點,但是不能全面評價食材的品質。因此需要借助感官評價。感官評價是一種借助人的感官器官檢測分析產品相關性的科學,通過視覺、嗅覺等反映測定分析解釋產品的一種科學方法[17]。如基于頂空SPME結合感官評價能夠有效綜合評價食材,如菜籽油的風味[18]。
本研究以4 個蓮藕品種為材料,水煮30 min,通過SPME提取GC-MS定性定量分析,電子鼻技術進行主成分分析,對蓮藕整體風味進行比較,結合感官評價,為建立水煮蓮藕風味分析及其篩選風味蓮藕提供理論指導。
湖北省洪湖藕(‘Honghu Lotus Root’,野生蓮藕,購于洪湖農貿市場)、沔城藕(‘Miancheng Lotus Root’,傳統地方品種,購于仙桃市南橋村農戶)、毛節(jié)藕(‘Maojie Lotus Root’,傳統地方品種,購于武漢市華中農業(yè)大學菜市場)、鄂蓮五號(‘Hubei Lotus Root No. 5’,選育品種,來自武漢市農業(yè)科學院)共4 個品種,采收日期2019年4月,選取大小均一蓮藕的中間部位。
無水乙醇、氯化鈉、環(huán)乙酮(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。
TSQ8000Evo型GC-MS聯用儀 美國Thermo公司;手動SPME進樣裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司;FOX4000型電子鼻 法國Alpha M.O.S公司;BSA124S分析天平 德國賽多利斯集團;DZ-500K傾斜式真空包裝機 上海申越包裝機械有限公司。
1.3.1 SPME-GC-MS測定
參考唐翠娥等[19]的方法,略作修改。將40 g蓮藕切成碎丁,裝入100 mL頂空瓶中,蒸餾水定容100 mL加蓋封口,放入電磁爐上沸水煮制30 min,冷卻。均質,放入5 g氯化鈉,再放入50 μL環(huán)己酮內標物(質量濃度0.01 mol/L),在50 ℃水浴鍋中平衡20 min,將SPME萃取頭插入頂空瓶,伸出萃取頭中的纖維萃取40 min,縮回纖維、拔針,最后將萃取頭插入GC進樣口,伸出纖維,解吸5 min。
GC條件:HP-5石英毛細管柱(30 m×320 μm,0.25 μm);程序升溫:起始溫度40 ℃,以5 ℃/min升至230 ℃,保持3 min;進樣口溫度250 ℃;氦氣(He),流速1 mL/min;進樣方式:不分流。
MS條件:離子源溫度280 ℃,電子能量70 eV,質量掃描范圍m/z45~550。
定性:由Xcalibur軟件系統完成,用MS Library of Wiley 7.0和NIST Chemistry WebBook譜庫相匹配,取正反匹配度均大于800的化合物[20]。
定量:采用內標法計算各揮發(fā)性物質的絕對含量。
1.3.2 電子鼻樣品的檢測
將蓮藕水煮30 min后,打漿,取1 g置于10 mL的頂空進樣瓶中,參考李黎[7]的方法,使用FOX4000型電子鼻對蓮藕中風味物質進行測定。電子鼻系統共有18 個傳感器分別為LY2/LG、LY2/G、LY0/AA、LY2/GH、LY2/gCTL、LY2/Gct、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1、TA/2。
具體測定條件如下:頂空注射參數:注射體積2 500 μL,注射速率2 500 μL/s;獲取參數:獲取時間120 s,獲取周期1 s,延滯時間300 s;載氣參數:以干燥空氣為載氣,流速150 mL/min;樣品不加熱。每個樣品重復測定4 次。
電子鼻的數據分析采用FOX4000型電子鼻配套的軟件Alpha SOFT 12.4進行統計學分析。
1.3.3 蓮藕的感官評價
參考葛孟甜等[21]的方法,略作修改。蓮藕感官評價由專業(yè)6 人組成小組,品嘗前不能吃氣味較大食物。切換樣品時需要漱口。評分采取100 分,對不同品種蓮藕進行感官評價,進行總體打分,評價標準見表1。
表1 不同品種蓮藕感官評價得分Table 1 Sensory evaluation scores of lotus roots from different varieties
使用SPSS 23軟件進行數據方差分析;使用Origin 8.0、Microsoft Office Excel 2016進行圖表制作。
2.1.1 不同品種蓮藕揮發(fā)性風味物質測定
通過SPME-GC-MS技術進行檢測,根據GC-MS分析與譜圖檢索,4 個蓮藕品種揮發(fā)性風味物質及相對含量見表2。
4 種蓮藕共鑒定出38 種揮發(fā)性風味物質,其中醛類、醇類、酸類、呋喃類對蓮藕風味具有突出貢獻,其中醛類物質突出,除此之外,還有烷烴類、酮類、芳香烴類、硫類、醚類、烯烴類、酯類、其他都是蓮藕揮發(fā)性風味物質的重要組成。其中洪湖藕23 種,沔城藕17 種,鄂蓮五號17 種,毛節(jié)藕20 種。4 種樣品中有8 種物質共同檢出,分別為二甲基硫、正己醛、正辛醛、壬醛、十一醛、3,5-二甲基辛烷、癸醛、2,6-二叔丁基對甲酚。看出不同品種揮發(fā)性物質的種類和含量不同可能造成風味差異,不同類型的揮發(fā)性成分呈現不同味覺體驗。
根據表2可知,洪湖藕所含的風味物質種類最多、含量最高,共鑒定出23 種風味物質,得到風味物質含量為7.47 μg/kg,其中醛類6 種相對含量為34.40%,烷烴類4 種相對含量為6.02%,醇類1 種相對含量為15.66%,酮類2 種相對含量為2.81%,芳香烴1 種相對含量為0.54%,硫類1 種相對含量為1.74%,醚類1 種相對含量為0.40%,呋喃類1 種相對含量為5.89%,酸類2 種相對含量為16.87%,烯烴類1 種相對含量為0.40%,酯類1 種相對含量為5.09%,其他2 種相對含量為10.17%。
沔城藕共鑒定出17 種風味物質,得到風味物質2.47 μg/kg,其中醛類6 種相對含量為63.56%,烷烴類6 種相對含量為14.22%,醇類1 種相對含量為8.00%,酮類1 種相對含量為0.89%,硫類1 種相對含量為7.56%,其他2 種相對含量為5.78%。
鄂蓮五號共鑒定出17 種風味物質,得到風味物質4.42 μg/kg,其中醛類6 種相對含量為69.30%,烷烴類2 種相對含量為11.06%,醇類1 種相對含量為0.90%,芳香烴類3 種相對含量為1.81%,硫類1 種相對含量為0.45%,醚類1 種相對含量為0.68%,呋喃類1 種相對含量為10.16%,烯烴類1 種相對含量為1.58%,其他1 種相對含量為4.06%。
表2 不同品種蓮藕揮發(fā)性物質種類及相對含量Table 2 Composition of volatile substances of lotus roots from different varieties
毛節(jié)藕共鑒定出20 種風味物質,得到風味物質5.02 μg/kg,其中醛類6 種相對含量為41.07%,烷烴類4 種相對含量為3.77%,醇類1 種相對含量為0.20%,酮類1 種相對含量為1.39%,芳香烴類2 種相對含量為1.19%,硫類1 種相對含量為3.37%,醚類2 種相對含量為1.19%,呋喃類1 種相對含量為5.95%,其他2 種相對含量為41.87%。
2.1.2 不同品種蓮藕揮發(fā)性風味物質比較
表3 不同品種蓮藕揮發(fā)性物質SPM-GC-MS分析Table 3 SPM-GC-MS analysis results of volatile components of lotus roots from different varieties
表3 不同品種蓮藕揮發(fā)性物質SPM-GC-MS分析Table 3 SPM-GC-MS analysis results of volatile components of lotus roots from different varieties
注:ND.未檢出。
時間/min 揮發(fā)性物質 絕對含量/(μg/kg)洪湖藕 沔城藕 鄂蓮五號 毛節(jié)藕保留1.72 2-硝基乙醇 2-nitro-ethanol ND ND ND 0.01 1.94 二甲基硫 dimethyl sulfide 0.13 0.17 0.02 0.17 3.03 正丁醇 1-butanol ND ND 0.04 ND 5.85 正己醛 hexanal 0.11 0.10 0.18 0.12 7.84 對二甲苯 p-xylene 0.04 ND 0.05 0.02 8.26 正丁醚 n-butyl ether 0.03 ND ND ND 11.71 2-正戊基呋喃 2-pentyl-furan 0.44 ND 0.45 0.30 12.13 正辛醛 octanal 0.34 0.20 0.51 0.36 12.63 對甲苯甲醚 1-methoxy-4-methyl-benzene ND ND 0.03 0.05 12.79 鄰-異丙基苯 o-cymene ND ND 0.01 0.04 12.89 甲氧基辛烷 1-methoxy-octane ND ND 0.48 0.16 12.93 2-乙基己醇 2-ethyl-1-hexanol 1.17 0.18 ND ND 13.29 2-乙基-甲酯己酸 2-ethyl-methyl hexanoic acid 0.11 ND ND ND 13.79 2,4,6-三甲基癸烷 2,4,6-trimethyl-hecane ND 0.06 ND ND 14.73 1-(1-環(huán)己烯-1-基)-1-丙酮 1-(1-cyclohexen-1-yl)-1-propanone 0.11 ND ND ND 14.74 3,3,5-三甲基環(huán)己烯 3,3,5-trimethyl-cyclohexene ND ND 0.07 ND 15.30 壬醛 nonanal 1.17 0.80 1.64 1.08 15.39 2,3-二氫-2,2,6-三甲基苯甲醛 0.14 ND ND ND 1,3-cyclohexadiene-1-carboxaldehyde, 2,6,6-trimethyl 16.79 2,3-二甲基癸烷 2,3-dimethyldecane 0.37 ND ND ND 16.96 反式-2-壬醛 (E)-2-nonenal ND 0.01 ND 0.01 17.27 十一醛 dodecanal 0.31 0.07 0.19 0.12 17.35 2-甲基-2-丙基甲酯己酸 1.15 ND ND ND 2-methyl-2-propyl-methyl esterhexanoic acid 17.55 2,2-二甲基-3-氧代丁酸甲酯 0.38 ND ND ND 2,2-dimethyl-3-oxo-methyl ester butanoic acid 17.69 1-亞甲基-1H-茚 1-methylene-1h-indene ND 0.01 ND 0.02 17.68 萘 naphthalene ND ND 0.02 ND 18.18 3,5-二甲基辛烷 3,5-dimethyl-octane 0.01 0.10 0.01 0.01 18.32 癸醛 decanal 0.50 0.25 0.54 0.38 20.29 3,3-二甲基庚烷 3,3-dimethyl-hexane ND 0.04 ND ND 20.30 2,6,11-三甲基十二烷 2,6,11-trimethyl-dodecane ND ND ND 0.01 20.57 草蒿腦 estragole ND ND ND 0.01 21.00 正十三烷 tridecane 0.06 0.04 ND ND 21.57 2,6,10-三甲基十二烷 2,6,10-trimethyl-dodecane 0.01 0.02 ND ND 23.46 (Z)-3-十二碳烯 (Z)-3-dodecene 0.03 ND ND ND 23.63 1-甲基-3-丙基-1-茚 1-methyl-3-propyl-1h-indene 0.06 ND ND ND 23.67 正十四烷 tetradecane ND 0.06 ND 0.01 23.88 十二醛 dodecanal ND ND 0.01 ND 24.83 香葉基丙酮 (E)-5,9-undecadien-2-one, 6,10-dimethyl 0.10 0.02 ND 0.07 26.23 2,6-二叔丁基對甲酚 butylated hydroxytoluene 0.70 0.12 0.18 2.09
根據表3可知,4 種蓮藕,醛類物質含量最為豐富,張靜妍[10]研究檢測出排骨藕湯中,醛類物質含量最豐富的,蓮藕增添排骨藕湯的風味。不同品種蓮藕都含有6 種醛類,類別上有所差別,其次是含量上,分別檢測出洪湖藕、沔城藕、鄂蓮五號、毛節(jié)藕的含量為2.57、1.43、3.07 μg/kg和2.07 μg/kg。壬醛具有玫瑰香味、柑橘味、脂肪味,癸醛具有脂肪香甜瓜香,正辛醛具有清香橙香,十一醛具有蠟香、檸檬香。正己醛具有清草味、蔬菜芳香[22]。在4 種蓮藕中,洪湖藕的十一醛含量最高。洪湖藕與鄂蓮五號含量高于其他2 個品種。醛類化合物一般是蓮藕在煮制的過程中脂肪氧合酶催化下不飽和脂肪酸氧化形成過氧化物的過程中產生的[23-24]。說明脂質氧化是生成蓮藕風味的重要途徑,形成蓮藕的蒸煮風味。
醇類化合物主要來自熱處理過程中,源于脂質氧化,洪湖藕和沔城藕檢測到2-乙基己醇,且含量相對較高為1.17 μg/kg和0.18 μg/kg,2-乙基己醇的感覺閾值為270 000 μg/kg[25],基本對蓮藕風味沒有貢獻。鄂蓮五號含有正丁醇,毛節(jié)藕含有2-硝基乙醇,含量相對較少。烴類物質化合物主要來源于烷氧自由基的分解,其中洪湖藕、鄂蓮五號的含量(0.45 μg/kg和0.49 μg/kg)明顯高于其他2 個品種的。雖然閾值較高,對蓮藕風味直接貢獻不大,但起著一定作用,有助于提高蓮藕整體風味。
酮類是脂肪氧化的產物,性質較穩(wěn)定、香氣持久,一般具有花香氣味,對食品風味貢獻較大[26-27]。實驗檢測出香葉基丙酮,生產上常用作香料。洪湖藕、沔城藕、毛節(jié)藕的含量依次為0.10、0.02 μg/kg和0.07 μg/kg。其中洪湖藕含量最高,對蓮藕總體風味也起著關鍵作用。同時,洪湖藕還檢測出1-(1-環(huán)己烯-1-基)-1-丙酮,其他蓮藕中均沒有檢測到,可能是洪湖藕獨特的風味。
呋喃類呈蔬菜香、豆香,2-正戊基呋喃是亞油酸氧化產生的,洪湖藕與鄂蓮五號含量高于其他2 個品種。酸類物質在4 個蓮藕品種中只有洪湖藕中檢測到2 種,含量為1.26 μg/kg,相對含量較高,并且閾值較低,對香氣有一定貢獻。酯類一般具有令人愉快的水果香氣、呈清香果香,4 個品種中只在洪湖藕中檢測到一種酯類,2,2-二甲基-3-氧代丁酸甲酯(0.38 μg/kg),這可能是洪湖藕風味優(yōu)于其他品種的原因。
芳香烴化合物含量較少甚至沒有檢測到,在鄂蓮五號中檢測出3 種,對二甲苯、鄰-異丙基苯、萘含量最高。與韓小苗等[28]檢測3 種鮮藕風味其中鄂蓮五號含有對二甲苯結果相似,可能是由于蓮藕生長在水下,受到水體污染產生的。硫類、醚類、烯烴類、其他含量較低,增加了蓮藕的復雜性。
蓮藕水煮后各個品種種類和含量上存在差異,可能是蓮藕品種差異引起的。羅慶[29]采用有機溶劑萃取檢測出大量烷烴類、芳香烴類等化合物,胡西洲等[30]采用水蒸氣蒸餾與乙醇提取蓮藕成分檢測出羧酸類、胺類、烷烴類等化合物,與本研究有所不同,但是本研究通過SPME技術,更能體現蓮藕原有的風味。存在差異的原因可能品種、風味檢測方法不同引起的,需要再進行研究探討。
綜上所述,在洪湖藕、沔城藕、鄂蓮五號、毛節(jié)藕4 個品種中揮發(fā)性物質種類及含量差異較大,與鄧嬌等[31]檢測6 種蓮花花瓣揮發(fā)性物質成分的差異與蓮花品種密切相關的結果類似。洪湖藕的種類最多為23 種,含量最高。醛類、烷烴類、呋喃類、酸類、酯類含量均較高。香氣表現為脂肪香、玫瑰香味、柑橘味、蒸煮香、蔬菜香。因此洪湖藕可作為最適煨湯的蓮藕品種。
2.1.3 不同品種蓮藕揮發(fā)性物質主成分分析比較
表4 主成分的特征值及其貢獻率Table 4 Characteristic values of principal components and their contribution rates to total variance
對不同品種蓮藕的揮發(fā)性物質的種類峰面積進行主成分分析,得到各主成分特征值、方差貢獻率,累計方差貢獻率。提取特征值大于1的主成分,結果如表4所示。第1主成分貢獻率為43.589%,第2主成分貢獻率為32.507%,第3主成分貢獻率23.904%,3 個主成分貢獻率達到100%,能夠表達樣品揮發(fā)性成分的組成,反映了原始變量信息,達到降維的目的。
圖1 不同品種蓮藕12 類揮發(fā)性物質的載荷分析圖Fig. 1 Loading plots of 12 volatile compounds in lotus roots from different varieties
如圖1所示,醛類、呋喃類作為蓮藕主要揮發(fā)性風味物質與第1主成分高度正相關(載荷系數>0.9),硫類與第1主成分呈負相關(載荷系數<-0.7);第2主成分中載荷最高是酮類、醇類(載荷系數>0.8);第3主成分中載荷最高的正相關揮發(fā)性物質是醚類(載荷系數>0.8)。上述結果說明醛類、呋喃類、酮類、醇類、醚類是水煮蓮藕中重要的揮發(fā)性物質,其他種類貢獻較大。
圖2 不同品種蓮藕得分圖Fig. 2 Score plots of lotus roots from different varieties
如圖2所示,4 個品種蓮藕均勻分布在坐標軸上,樣品在分布圖上距離越近代表香氣組成相似度越高,第1主成分很好地將沔城藕、毛節(jié)藕與其他2 種蓮藕分開,沔城藕與毛節(jié)藕距離相近,說明2 種蓮藕香氣相似。第2主成分將洪湖藕、毛節(jié)藕、沔城藕與鄂蓮五號分開,鄂蓮五號分布在第2主成分負半軸,影響物質主要為芳香烴、烯烴類、醛類化合物。第3主成分將毛節(jié)藕與沔城藕分布在正負半軸,影響物質主要為其他類。
對4 種水煮蓮藕樣品進行電子鼻分析,結果見圖3A。鄂蓮五號與洪湖藕、毛節(jié)藕、沔城藕輪廓不一,其中LY2/G、LY2/GH、LY2/gCTL、LY2/gCT為負值,其他均為正值。傳感器變化較大的為T30/1、P30/2、P40/2、T70/2、P30/1、PA/2、P40/1、P10/1、LY2/gCTL、LY2/gCT對鄂蓮五號與其他3 個品種感應值較大,說明洪湖藕、毛節(jié)藕、沔城藕距離相近,較為相似,與鄂蓮五號風味區(qū)別較大,電子鼻主要依靠這些傳感器進行區(qū)分。
如圖3B所示,主成分1的方差貢獻率為83.09%,主成分2方差貢獻率為8.22%。前2 個主成分的方差貢獻率達91.31%,能夠充分保存樣品的原始數據信息。洪湖藕、沔城藕、鄂連五號、毛節(jié)藕的揮發(fā)性香氣物質的電子鼻檢測值不同重復的坐標位置相對較為集中,重復性好,所有樣品基本都能被區(qū)分開。洪湖藕、沔城藕、毛節(jié)藕距離較近,風味方面有相似,但是每個樣品都各自成為一組,說明不同品種蓮藕之間存在差異性,可能由于品種、地區(qū)位置環(huán)境以及不同栽培管理方式造成的。本研究通過電子鼻技術分析4 種蓮藕品種整體風味上有明顯差異(圖3),SPME-GC-MS結果也顯示4 個品種蓮藕種類含量上呈現的差異。SPME-GC-MS技術對樣品中揮發(fā)性物質具體種類的含量進行檢測分析比較,電子鼻分析這些物質作為整體時對風味特征貢獻,得到樣品整體物質結果,因此兩者配合有利于從宏觀和微觀上研究樣品風味。
圖3 不同品種蓮藕揮發(fā)性物質雷達圖(A)和主成分分析圖(B)Fig. 3 Radar pattern (A) and principal component analysis (B) of volatiles from roots of different lotus varieties
由圖4感官分析發(fā)現,洪湖藕的口感最粉糯,質地均勻,顏色偏白,風味濃郁,綜合評分最高;沔城藕質地較均勻,色澤偏白,風味較淡,藕湯滋味較純正;鄂蓮五號口感質地偏硬,顏色粉紅,蓮藕風味略淡,湯汁滋味較純正;毛節(jié)藕質地較均勻,顏色粉嫩,風味略淡,湯汁滋味純正。相比之下,考慮蓮藕口感與風味,較適合煨湯的蓮藕是洪湖藕,藕香味濃郁,質地均勻,口感粉糯。
圖4 不同品種蓮藕質地、色澤、風味和湯汁風味感官評分(A)及綜合感官評分(B)Fig. 4 Sensory scores for texture, color, flavor and soup flavor of different varieties of lotus roots (A) and comprehensive sensory scores (B)
本實驗利用不同技術綜合分析4 種蓮藕(洪湖藕、沔城藕、鄂蓮五號、毛節(jié)藕)的水煮風味物質成分及感官評價。采用SPME提取GC-MS分析檢測出38 種揮發(fā)性風味物質,8 種共有物質,由不同品種蓮藕種類載荷圖得出醛類、呋喃類、酮類、醇類、醚類是水煮蓮藕中重要的呈香物質,其他種類貢獻較大。
通過主成分分析的總得分圖可以將4 個品種蓮藕進行有效區(qū)分。電子鼻分析發(fā)現各個品種蓮藕揮發(fā)性成分都存在差異。在檢測的蓮藕中揮發(fā)性物質種類和含量洪湖藕最豐富,同時通過感官分析結果顯示洪湖藕的質地粉糯,風味濃郁與頂空SPME的結果一致。洪湖藕較適合作為煨湯品種,本研究通過比較4 種蓮藕品種的風味結合感官評價,為蓮藕的深加工提供理論依據。