發(fā)酵型青腐乳菌群結構與風味物質及其相關性分析

孫 娜，張雅婷，于寒松，朱先明，朱世杰，周樹輝，任大勇,

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.長春市朱老六食品股份有限公司，吉林 長春 130500）

青腐乳是我國傳統(tǒng)腐乳中風味最為獨特的一種，因其“聞著臭、吃著香”被部分人所喜愛[1-2]。根據(jù)工藝不同青腐乳可分為非發(fā)酵型和發(fā)酵型兩種。南方青腐乳屬于非發(fā)酵型，采用瀏陽黑豆豉、香菇、莧菜等長期發(fā)酵制成的鹵水浸泡后形成，油炸即可食用。發(fā)酵型青腐乳以北方為代表，經(jīng)嚴格的前發(fā)酵和長時間的后發(fā)酵形成[3]。青腐乳營養(yǎng)價值高，VB12、游離氨基酸及鐵、鋅、鈣等礦物質含量豐富，利于人體腸道的吸收[4]。

青腐乳的制作由于工藝和地域的不同，鹵水差異較大，導致青腐乳的風味差別很大。影響風味的因素有很多，其中微生物[5-7]對其影響最大。而揮發(fā)性風味物質[8]也是青腐乳重要的質量參數(shù)，對產(chǎn)品整體風味起著重要作用。因此研究青腐乳中微生物多樣性和菌群構成與其風味之間的關系具有重要意義。目前對青腐乳中微生物的多樣性研究，主要是采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法。但基于傳統(tǒng)的方法在研究復雜的微生物菌群時，無法檢測出所有微生物，導致低估了菌群數(shù)量和多樣性[9-11]。相比之下，高通量測序技術具有較為明顯的優(yōu)勢，不僅能檢測出優(yōu)勢微生物，對于低豐度微生物也能檢出，能夠全面準確地揭示環(huán)境中微生物的多樣性[12-13]。高通量技術已被廣泛應用[14-15]于發(fā)酵食品中，如發(fā)酵豆腐[16-18]、發(fā)酵酒精飲料[19-20]、發(fā)酵蔬菜[21]和發(fā)酵乳[22]等。到目前為止，對青腐乳中微生物資源及鹵水中揮發(fā)性成分分析并進行對比的研究報道較少。

本研究通過高通量測序技術對青腐乳中的微生物信息進行比較，采用固相微萃取方法對其中的揮發(fā)性成分進行提取，并結合氣相色譜-質譜聯(lián)用方法進行分析，以探討微生物與青腐乳風味成分的關系，有利于深入了解青腐乳中細菌和揮發(fā)性成分的組成，進而改進青腐乳的制作工藝，提高產(chǎn)品風味質量及穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)酵前期青腐乳和發(fā)酵末期青腐乳均來自長春市朱老六食品股份有限公司，發(fā)酵前期青腐乳為剛加鹵水發(fā)酵時的樣品作為對照實驗，發(fā)酵末期青腐乳為發(fā)酵6 個月的可售青腐乳。

1.2 儀器與設備

T100梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Ion S5TMXL高通量測序分析儀 美國Thermo Fisher公司；QP 2010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 日本島津公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取裝置 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取和PCR擴增

采用十二烷基硫酸鈉方法對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇通用引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴增DNA中V3、V4區(qū)域。使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性[23]。

1.3.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度等量混合樣品，充分混勻后使用2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，剪切回收目標條帶[24]。

1.3.3 文庫構建和上機測序

使用Thermo Fisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Thermo Fisher公司的Ion S5TMXL進行上機測序。建庫、上機測序以及數(shù)據(jù)分析由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.4 固相微萃取

取10 mL青腐乳鹵水置于20 mL的頂空樣品瓶中，蓋上密封墊和鋁帽，密封后在80 ℃條件下磁力攪拌加熱平衡12 min，攪拌速率500 r/min，通過隔墊插入已活化好的固相微萃取萃取頭，推出纖維頭，頂空吸附40 min，在拔出萃取頭前抽回纖維頭，再將萃取頭插入氣相色譜進樣口，并推出纖維頭，在250 ℃條件下解吸5 min。

1.3.5 氣相色譜-質譜條件

Agilent色譜柱DB-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），分流比10∶1，載氣為高純氦氣，流速1 mL/min。升溫程序：40 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至300 ℃保持3 min。離子源溫度200 ℃，接口溫度260 ℃，掃描m/z33～500[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

高通量測序結果采用可分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類整合分析；氣相色譜-質譜檢測得到離子色譜圖，通過計算機譜庫檢索，去除相似度低于90%組分，確定青腐乳揮發(fā)性風味物質成分。

2 結果與分析

2.1 青腐乳中微生物物種多樣性曲線

稀釋曲線可用說明檢測樣品的測序數(shù)據(jù)量是否足以反映環(huán)境中的微生物多樣性，也可用來比較不同樣品中的微生物多樣性情況。從圖1A可以看出，發(fā)酵末期青腐乳和發(fā)酵前期青腐乳的曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)足以覆蓋所有的微生物，表明了樣品中微生物的多樣性。

通過圖1B的Rank-Abundance曲線能夠更清晰地反映出發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳中微生物豐度和分布均勻程度，曲線的形狀反映物種組成的均勻程度，兩條曲線形狀相似，說明發(fā)酵末期青腐乳和發(fā)酵前期青腐乳中物種組成均勻程度相近；用曲線在橫軸上的長度反映物種的豐富程度，由圖1B可知，發(fā)酵前期青腐乳的曲線比發(fā)酵末期青腐乳的曲線寬，說明發(fā)酵前期青腐乳中的微生物組成比發(fā)酵末期青腐乳更豐富，物種多樣性存在明顯差異。

圖1 稀釋度曲線（A）和Rank-Abundance曲線（B）Fig. 1 Rarefaction curves (A) and Rank-Abundance curves (B)

2.2 青腐乳OTU分布Venn圖

Venn圖可以直觀地表現(xiàn)出樣品獨有和共有的OTU數(shù)目，以及樣本的OTU數(shù)目組成相似性和重疊情況。由圖2可知，發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳中OTU的重疊數(shù)目為259，占總OTU的76.17%；發(fā)酵末期青腐乳與發(fā)酵前期青腐乳獨有的OTU數(shù)目分別為29和52，說明兩個樣品間微生物存在一定的差異。發(fā)酵末期青腐乳和發(fā)酵前期青腐乳共有的物種數(shù)占總數(shù)的比例較高，而發(fā)酵前期青腐乳和發(fā)酵末期青腐乳的風味差距較大，可推斷共有的物種數(shù)對青腐乳風味不起主要作用，而單獨的物種才是影響青腐乳風味的關鍵。

圖2 青腐乳樣品OTU分布Venn圖Fig. 2 Venn diagram of OTU distribution in fermented stinky tofu samples

2.3 青腐乳中微生物在屬水平的分類比較

圖3 青腐乳樣品在屬水平的細菌相對豐度Fig. 3 Bacterial abundance of fermented stinky tofu samples at the genus level

由圖3A可知，在發(fā)酵末期青腐乳中分列前3 位的屬為Lactobacillus、Chishuiella、Tetragenococcus，所占比例分別為23.44%、21.45%、16.28%。而發(fā)酵前期青腐乳中Lactobacillus的比例為19.5%，所占比例最高。其次為Chishuiella和短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter），分別占18.12%和15.59%；發(fā)酵前期Tetragenococcus含量相對發(fā)酵末期青腐乳較低，在發(fā)酵前期青腐乳中位居第3的Empedobacter在發(fā)酵末期青腐乳中含量幾乎為零。其他微生物菌屬，如Leuconostoc、Halanaerobium在發(fā)酵前期青腐乳和發(fā)酵末期青腐乳中均有體現(xiàn)，但是在發(fā)酵末期青腐乳中所占比例顯著高于發(fā)酵前期青腐乳，所占比例差異較大。通過圖3B可知，發(fā)酵末期青腐乳相比，除Halanaerobium末期-3比末期-1、末期-2所占比例高，其他菌屬含量接近。發(fā)酵前期青腐乳相比，Empedobacter在前期-3中最多，其他菌屬含量相似，說明所測樣品的菌屬比較穩(wěn)定。綜合分析可推斷，發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳細菌差異顯著，雖然Lactobacillus、Chishuiella、Tetragenococcus、Empedobacter所占比例較高，但都不是青腐乳風味的主要貢獻者，而Leuconostoc與Halanaerobium為青腐乳獨特風味提供了主要貢獻。

2.4 青腐乳中菌群主成分分析

圖4 青腐乳樣品菌群結構的主成分分析Fig. 4 PCA analysis of bacterial community structure of fermented stinky tofu samples

由圖4可以看出，發(fā)酵末期青腐乳末期-1與末期-2兩點距離較近說明兩樣品相似度較高，而這兩點與末期-3距離較遠，菌群結構差異明顯。發(fā)酵前期青腐乳前期-1、前期-2與前期-3三點呈現(xiàn)明顯的分離狀態(tài)且距離較遠，可推斷菌落結構差異比較大。發(fā)酵末期青腐乳與發(fā)酵前期青腐乳之間距離相對較遠，表明發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳之間的菌落結構有明顯的差異。這些現(xiàn)象說明，在進行發(fā)酵的過程中發(fā)酵環(huán)境有所改變導致了青腐乳中微生物的情況差異顯著。

2.5 各組樣本距離矩陣熱圖分析

β多樣性研究中，選用Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac距離衡量2 個樣本間的相異系數(shù)，其值越小，表示這2 個樣本在物種多樣性方面存在的差異越小。以Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離繪制的熱圖結果見圖5。發(fā)酵末期青腐乳末期-1、末期-2與末期-3之間的相異系數(shù)較小、發(fā)酵前期青腐乳前期-1、前期-2與前期-3之間相異系數(shù)也不大，說明微生物群落結構差異小，而發(fā)酵末期青腐乳與發(fā)酵前期青腐乳的各個相異系數(shù)較大，表明發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳之間物種多樣性的差異較大。

2.6 青腐乳鹵水揮發(fā)性風味成分的氣相色譜-質譜分離鑒定

圖5 青腐乳樣品的β多樣性指數(shù)熱圖Fig. 5 Heat map for β-diversity index of fermented stinky tofu samples

將檢測的青腐乳總離子流圖中各峰一級質譜經(jīng)計算機檢索以及與NIST14標準普庫相匹配，并與標準物質對照，結合保留時間和相關文獻[26-29]進行鑒定，最終得到青腐乳香氣組分的定性結果，利用峰面積歸一化法得出不同化學成分的相對含量，結果見表1。

表1 青腐乳鹵水中主要揮發(fā)性物質的相對含量Table 1 Relative contents of volatile components in fermented stinky tofu brine

續(xù)表1

由表1可知，發(fā)酵末期青腐乳鹵水中共鑒定出27 種揮發(fā)性物質，其中含硫化合物7 種，醇類3 種，酯類4 種，酸類3 種，烷烴類2 種，醛類3 種，酚類1 種，其他化合物4 種。發(fā)酵前期青腐乳鹵水中共鑒定出45 種揮發(fā)性物質，其中醇類12 種，酯類1 種，酸類1 種，酮類6 種，醛類7 種，酚類5 種，烷烴類1 種，其他化合物12 種。鄭小芬等[30]從湖南臭豆腐中共鑒定出38 種揮發(fā)性風味物質成分，主要以酯類化合物為主，但文獻中鑒定出的揮發(fā)性物質成分與本研究在種類和數(shù)量上都存在較大差異，如文獻中未鑒定出醛類物質而在本研究中鑒定出，這與青腐乳的制作工藝及產(chǎn)地的不同有很大關系。劉玉平等[31]從北京王致和臭豆腐中鑒定出31 種成分，其中鑒定出的正己醇、苯酚，也存在于本研究的青腐乳鹵水中。馬艷莉等[32]在青方腐乳中鑒定出25 種關鍵揮發(fā)性風味物質，認為對風味貢獻最大的為苯酚、三甲基肼、吲哚、二甲基二硫醚、乙酸乙酯，為完善青腐乳的工業(yè)化生產(chǎn)及風味起到很大作用。本研究從發(fā)酵末期青腐乳鹵水中鑒定出的成分中含硫化合物最多，發(fā)酵前期青腐乳鹵水中醇類化合物最多，含硫化合物大多呈臭味，醇類化合物大多具有花香、水果香、酒香或干草香。

從發(fā)酵前期青腐乳和發(fā)酵末期青腐乳中鑒定出相同的揮發(fā)性物質成分有6 種，其中醛類物質2 種，分別為苯乙醛和3-甲基丁醛；酸類1 種，為乙酸；醇類1 種，為二甲基西拉二醇；其他化合物2 種，分別為氨基甲酸銨鹽和2-甲基萘。其中，苯乙醛具有濃郁的風信子的香氣，稀釋后有水果的甜香，天然存在于雞肉、西紅柿、面包、玫瑰油、柑橘油。3-甲基丁醛具有蘋果香氣；乙酸具有食醋內(nèi)酸味；氨基甲酸銨鹽具有氨味。分析可知，這6 種相同的揮發(fā)性成分在發(fā)酵前期青腐乳鹵水中的含量比在發(fā)酵末期青腐乳鹵水中的都要高；尤其是苯乙醛、3-甲基丁醛、乙酸和氨基甲酸銨鹽的含量高出很多，而二甲基西拉二醇和2-甲基萘在發(fā)酵前期和末期青腐乳鹵水中的含量都比較低。這些物質都提供了青腐乳的香氣，但并不包含特有的臭味，表明發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳具有一定相同的風味物質成分，但這些物質成分不是青腐乳主要的風味物質成分，主要成分是發(fā)酵末期青腐乳鑒定出而發(fā)酵前期青腐乳未鑒定出的含硫化合物及吲哚，這些物質具有特有的臭味，青腐乳才會具有獨特的令人喜愛的香氣。

圖6 青腐乳鹵水中各類物質的相對含量Fig. 6 Relative contents of major classes of volatile compounds in fermented stinky tofu brine

由圖6可知，發(fā)酵末期青腐乳鹵水中的揮發(fā)性物質成分以含硫化合物、醇類和酯類為主，其中含硫化合物含量最高，主要為二甲基二硫化物、二甲基三硫化物和二甲基四硫化物，二甲基三硫化物和二甲基四硫化物相對含量高達20%，其次是吲哚。含硫化合物和吲哚的嗅覺閥值很低，在較低濃度時就能聞到臭味，濃度高時具有強烈的臭味，增強了青腐乳的特征香氣。而發(fā)酵前期青腐乳的揮發(fā)性物質成分以醇類和酸類為主，主要呈花香、果香、酒香和酸味。除此之外，3-辛酮、2-戊基呋喃的含量也較高，3-辛酮具有水果的香氣，2-戊基呋喃具有豆香和果香的氣味。

2.7 青腐乳菌群結構與風味的相關性

由圖7可知，Lactobacillus、Tetragenococcus和Chishuiella在發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳中所占比例最高，與風味成分酯類、酮類、醇類相關性最大，這些物質呈現(xiàn)的大多為水果香氣、花香、酒香，雖不是青腐乳獨特風味的主要貢獻者，卻是青腐乳風味中必不可少的菌屬和香氣；Leuconostoc和Halanaerobium與含硫化合物、吲哚含量呈正相關，相關性最大且僅在發(fā)酵末期青腐乳鹵水中出現(xiàn)，說明這兩個菌屬是提供風味的主要貢獻者，這與前文推斷相符。在發(fā)酵前期青腐乳中占有較高比例的Empedobacter與含硫化合物相關程度極低，不是臭味的來源。

圖7 青腐乳菌群結構與風味相關性熱圖Fig. 7 Heat map for correlation between bacterial community structure and flavor components of fermented stinky tofu

3 結 論

研究結果表明，發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳鹵水中微生物的相似度較低，差異顯著。發(fā)酵前期與發(fā)酵末期青腐乳中含有相同且比例較高的屬為Lactobacillus、Chishuiella；Leuconostoc和Halanaerobium差異尤為明顯。Leuconostoc和Halanaerobium與二甲基三硫化物、吲哚等呈臭味揮發(fā)性成分相關性最大。Empedobacter與含硫化合物相關程度極低，不貢獻臭味。Lactobacillus、Tetragenococcus和Chishuiella與酯類、酮類、醇類相關性最大，為青腐乳提供了香氣。本研究有助于解析青腐乳菌群結構對風味的形成機制，開發(fā)基于微生物調控技術的優(yōu)質腐乳生產(chǎn)技術，提高產(chǎn)品風味及品質穩(wěn)定性，為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)升級提供依據(jù)。后續(xù)將在菌株水平上鑒定呈味細菌，并通過單菌株發(fā)酵進一步驗證其呈味作用及其對青腐乳核心風味的貢獻度。