沙門氏菌污染豆腐干和牛肉干后代謝物的研究

胡 蝶， 胡 昊， 楊本芹， 潘學(xué)軍

（昆明理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明650500）

豆腐干和牛肉干均是即食性食品，營養(yǎng)豐富，在制作、運(yùn)輸及儲存過程中都有被致病菌污染的風(fēng)險[1-7]，評估此類即食食品的污染現(xiàn)狀十分重要。

目前的研究多數(shù)局限于已發(fā)生沙門氏菌病的病情調(diào)查和檢測可能被污染致病菌的食品中微生物的存在，但關(guān)于沙門氏菌污染食品后的代謝物的研究還較少。作者選取豆腐干和牛肉干作為沙門氏菌的接種培養(yǎng)基，并用氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）鑒定沙門氏菌污染豆腐干和牛肉干后的代謝物。因GC-MS的分辨率好，靈敏度高，數(shù)據(jù)庫較為健全，近年來被廣泛使用[8-9]。作者基于GC-MS檢測技術(shù)的代謝組學(xué)分析平臺研究沙門氏菌分別在污染豆腐干和牛肉干后的特征性和差異性代謝產(chǎn)物[10]，以期能夠?yàn)樯抽T氏菌的典型代謝物的篩選提供參考，并為篩選沙門氏菌污染食品后的潛在生物標(biāo)志物提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙門氏菌（ATCC14028S）：購自中國普通微生物保藏管理中心；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：購自百思生物公司；豆腐干和牛肉干：市售；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國西格瑪公司產(chǎn)品；二氯甲烷（色譜純）、2，4，6-三甲基吡啶：邁瑞達(dá)公司產(chǎn)品。

1.2 沙門氏菌的培養(yǎng)

選取沙門氏菌作為研究用菌株。首先將購買的菌株在37℃下水浴解凍，轉(zhuǎn)移1 mL沙門氏菌菌液至200 mL NB培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱溫育24 h進(jìn)行增菌[11]。增菌后觀察菌落形態(tài)、是否有雜菌，若無雜菌即可保藏以進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

豆腐干和牛肉干均與超純水按1 g∶10 mL的比例混合，然后攪拌10 min，18目篩網(wǎng)重復(fù)過濾，使豆腐干和牛肉干顆粒直徑小于1 mm，確保制成的培養(yǎng)基足夠均勻，121℃，103 kPa滅菌30 min待用。取20 mL配好的NB培養(yǎng)基、豆腐干培養(yǎng)基（DB）、牛肉干培養(yǎng)基（BJB）分別測定pH值[12]和總有機(jī)碳。

將-80℃保藏的菌種復(fù)蘇后取1 mL菌液分別加入到200 mL NB、DB、BJB中，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。取部分菌液在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)[13]，另外取10 mL菌液用于代謝組學(xué)分析。每組實(shí)驗(yàn)以空白培養(yǎng)基為對照，分別做6個平行。

1.3 基因組測序

首先對沙門氏菌的基因組進(jìn)行片段化，構(gòu)建基因組文庫，然后對單鏈DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，激光掃描后讀取核苷酸種類，重復(fù)讀取，獲得模板DNA片段的序列。利用Illumina Hiseq平臺對沙門氏菌的基因進(jìn)行測序，然后對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，統(tǒng)計(jì)和基因組評估，完成denovo組裝，隨后可對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因功能預(yù)測。

1.4 GC-MS鑒定代謝物

1.4.1 代謝物的提取 取10 mL菌液于50 mL離心管中，迅速加入體積分?jǐn)?shù)為60%的10 mL冷甲醇溶液（-40℃）后渦旋30 s并超聲處理2 h，置于-80℃冰箱中冷凍12 h放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥。冷凍干燥后的樣品加入10 mL乙腈、甲醇和超純水（體積比為2∶2∶1）萃取劑，振蕩后將混合液倒入帶有3種規(guī)格玻璃球的試管分散機(jī)（UTTD）中破碎10 min。將破碎后的樣品置于37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h，將混合液在-4℃、10 000g的條件下離心15 min，取上清液，真空冷凍干燥。將冷干樣品加入2 mL二氯甲烷，混勻，加入50μL 2，4，6-三甲基吡啶作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行GC-MS測定。

1.4.2 GC-MS操作條件GC-MS使用DB-624毛細(xì)管色譜柱；柱溫升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃保持6 min，10℃/min升溫至230℃，保持10 min。載氣為高純氦氣；載氣流量為2.0 mL/min。進(jìn)樣口溫度230℃，進(jìn)樣量1.0μL，采用不分流模式。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃；質(zhì)譜接口溫度230℃；全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍29～350。

1.5 數(shù)據(jù)處理

通過美吉生物云平臺（www.majorbio.com）利用基因組序列信息對基因功能進(jìn)行預(yù)測，并找到相關(guān)代謝酶的信息。代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理采用Agilent MSD Productivity Chem Station（Agilent Technologies Inc.USA）聯(lián)合NIST 2014質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行原始峰提取、數(shù)據(jù)基線過濾、基線標(biāo)準(zhǔn)、峰對齊、峰識別和峰面積集成，相似度＞70%的物質(zhì)被認(rèn)為是可信物質(zhì)。識別出的代謝物利用SIMCA14.1軟件包進(jìn)行主成分分析 （Principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別（Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLSDA）分析，將OPLS-DA模型中的預(yù)測值（VIP＞1）中第一個主成分和單因素方差分析（P＜0.05）相結(jié)合，鑒定出主要差異代謝物[14]，比較得出的差異代謝物在KEGG數(shù)據(jù)庫搜索代謝物途徑，研究不同食品被沙門氏菌污染后主要的代謝通路和潛在生物標(biāo)志物[15]。使用Origin9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、豆腐干培養(yǎng)基、牛肉干培養(yǎng)基的相關(guān)參數(shù)

NB、DB、BJB的pH值，TOC值如表1所示。3組培養(yǎng)基的pH分別屬微酸微堿性，張旭東等[16]表明pH值在5～7時，沙門氏菌均能正常生長。3組培養(yǎng)基的TOC值說明3組培養(yǎng)基提供的碳源相差不大，對沙門氏菌的生長不會有很大影響。按國標(biāo)法測得3組培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后的最大菌落數(shù)。菌落數(shù)都能達(dá)到2.29×108CFU/mL，說明沙門氏菌的生長都是正常的，并未因其他理化性質(zhì)不同明顯影響沙門氏菌的生長狀況。

表1 培養(yǎng)基的相關(guān)參數(shù)Table 1 Parameters of medium

2.2 代謝譜圖

沙門氏菌污染食品后會充分利用營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長，同時會代謝出多種代謝物，因此對沙門氏菌接種3個培養(yǎng)基12 h后的代謝物進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)有491個有效峰，經(jīng)過原始峰提取、數(shù)據(jù)基線過濾、基線標(biāo)準(zhǔn)、峰對齊、峰識別和峰面積集成，且相似度＞70%的峰有298個。如圖1所示，將TIC色譜圖疊放，可以直接反映每組代謝物的差異。

如圖1（a），沙門氏菌接種于NB之后，相對于未接種沙門氏菌的NB、1-丁醇、均三甲苯可能是差異性代謝產(chǎn)物；如圖1（b），沙門氏菌接種于豆腐干培養(yǎng)基（DS）之后，相對于空白豆腐干培養(yǎng)基（DB），甘油可能是差異性代謝產(chǎn)物；如圖1（c），沙門氏菌接種于牛肉干培養(yǎng)基（BJS）之后，相對于空白牛肉干培養(yǎng)基（BJB），乙醇、甘油、2，4-二叔丁基苯酚可能是差異性代謝產(chǎn)物，作者將結(jié)合PCA和OPLSDA進(jìn)行詳細(xì)分析。

圖1 典型GC-MS TIC疊放圖Fig.1 Typical GC-MS TIC stacking map

2.3 沙門氏菌的特征性代謝產(chǎn)物

如圖2所示，可以看出3組空白培養(yǎng)基和接種沙門氏菌的培養(yǎng)基的物質(zhì)數(shù)量和總豐度。因NB、DB和BJB的營養(yǎng)成分有一定的差異[17-19]，因此接種沙門氏菌后降解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物必然有一定差異。結(jié)果如下：NB有125種物質(zhì)檢出，接種沙門氏菌的NB（SM）的代謝物有174種代謝物；DB檢出159種物質(zhì)，接種沙門氏菌的DB（DS）檢出159種代謝物；BJB檢出270種物質(zhì)，接種沙門氏菌的BJB（BJS）檢出84種代謝物。

圖2 3組空白培養(yǎng)基和接種沙門氏菌的培養(yǎng)基鑒定的物質(zhì)總量和總豐度Fig.2 Comparation of the total number and abundance of metabolites in three media with inoculated and without inoculation of S.typhimurium

圖3 分別對3組未接種和接種沙門氏菌的培養(yǎng)基檢測出的代謝物進(jìn)行了OPLS-DA分析，以增強(qiáng)我們對沙門氏菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生的代謝物的了解。得分圖中的所有樣本都在95%的HotellingT平方橢圓內(nèi)，并且在組間發(fā)現(xiàn)了明顯的分離和區(qū)別。這些發(fā)現(xiàn)表明，OPLS-DA模型可用于識別本實(shí)驗(yàn)的代謝產(chǎn)物成對組之間的差異[20]。

如表2所示3組特征性代謝產(chǎn)物，即對未接種沙門氏菌的3組培養(yǎng)基的物質(zhì)和接種沙門氏菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后測出來的代謝物進(jìn)行OPLS分析，VIP＞1和P＜0.05的物質(zhì)即豐度差異顯著的物質(zhì)。SM的特征代謝物有20種，DS的特征代謝物有12種，BJS的特征代謝物有7種，這些代謝物主要是烷烴及部分小分子代謝物，如：乙醇、乙酸、甘油、丙二醇、1-丁醇等。表明沙門氏菌都顯著降解了3個培養(yǎng)基中的物質(zhì)且特征性代謝產(chǎn)物有所區(qū)別。

首先，沙門氏菌接種NB，DB，BJB產(chǎn)生的特征性代謝產(chǎn)物都包含大量的烷烴和芳香族物質(zhì)。由KEGG知烷烴主要參與脂肪酸降解，角質(zhì)、絲氨酸和蠟生物合成和次級代謝產(chǎn)物的生物合成三大代謝途徑，Piao表明烷烴是牛肉中脂質(zhì)氧化形成的主要揮發(fā)性化合物[21]，且革蘭氏陰性菌都有將醛類物質(zhì)降解為烷烴的能力[22]，因此3組培養(yǎng)基的特征性代謝產(chǎn)物都含有烷烴（表2）。而芳香族物質(zhì)的存在應(yīng)該是NB培養(yǎng)基的大分子芳香族物質(zhì)被降解。

其次，1-丁醇同時是3個培養(yǎng)基被沙門氏菌接種后的特征性代謝產(chǎn)物，因此1-丁醇有可能成為沙門氏菌降解的典型代謝物。另外，豆腐干和牛肉干接種沙門氏菌后的特征性代謝產(chǎn)物還有甘油，甘油是一種常見的細(xì)胞代謝產(chǎn)物，存在于各種生物體中[23]，豆腐干和牛肉干的特征性代謝產(chǎn)物中同時含有甘油，可能是因?yàn)閮烧咧谱鬟^程中加入脂肪，被沙門氏菌大量降解為短鏈脂肪酸及甘油。

圖3 OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot

表2 NB、DB、BJB中的特征性代謝產(chǎn)物Table 2 Characteristic metabolites of NB and SM，BD and BS，BJB and BJS

乙酸、乙醇等小分子大多都是生物進(jìn)行基本生命活動的產(chǎn)物，因此每組培養(yǎng)基的特征性代謝產(chǎn)物還有一些特殊的小分子醇酸酮。NB培養(yǎng)基中的乙酸、丙酸；豆腐干培養(yǎng)基的丙二醇、乙酰胺、3-甲基-2-丁酮、棕櫚酸甲酯、麥芽酚；牛肉干中的乙醇及兩種酮類可能是沙門氏菌降解牛肉干的特征性代謝物。

2.4 沙門氏菌的差異性代謝產(chǎn)物

有機(jī)體攝入外源物質(zhì)或發(fā)生病變時，對機(jī)體穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生干擾，反映其基因或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄發(fā)生的變化，代謝產(chǎn)物的種類或數(shù)量發(fā)生變化即為差異性代謝產(chǎn)物。因NB培養(yǎng)基有充足的碳源和氮源，且理化性質(zhì)適合多數(shù)菌株，因此將接種于NB培養(yǎng)基的沙門氏菌降解產(chǎn)物看作是對照，即差異性代謝產(chǎn)物在具體指將SM和DS、SM和BJS的代謝物分別進(jìn)行OPLS分析，其VIP＞1，P＜0.05即認(rèn)定為差異性代謝產(chǎn)物。SM、DS、BJS的代謝物PCA分析如圖4（a）所示，沙門氏菌在3組培養(yǎng)基能顯著分開，說明沙門氏菌污染不同食品產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是有差異的。SM與DS和BJS的OPLS-DA分析分別如圖4（b），圖4（c），可以看到，兩兩培養(yǎng)基的代謝物有明顯差異。進(jìn)一步的S-plot分析可得出差異性代謝產(chǎn)物。

圖4 PCA和OPLS-DA得分圖Fig.4 PCA and OPLS-DA score plot

如表3所示，SM和DS的差異性代謝產(chǎn)物有31種，SM和BJS的差異性代謝物有32種，且差異性代謝產(chǎn)物種類和上述沙門氏菌的特征性代謝產(chǎn)物（表2）類似，有大量的烷烴和芳香類化合物。除上述兩類物質(zhì)外，SM和DS的差異性代謝物有醋酸、異佛爾酮、1-丁醇，SM和BJS的差異性代謝物有丙酸、1-丁醇、乙酰胺、吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-六氫-二酮、2-吡咯烷酮、乙醇、二氫-2，4（1H，3H）-嘧啶二酮。從表中可以看出不同食品的差異性代謝產(chǎn)物都有1-丁醇和2，4-二叔丁基苯酚。

2.5 沙門氏菌的代謝系統(tǒng)分析

沙門氏菌的全基因組序列全長4 864 529 bp，共包含5 048個基因。隨后對得到的編碼基因進(jìn)行功能KEGG注釋，如圖4。沙門氏菌的基因中代謝（metabolism）相關(guān)的基因有1 924個，環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）相關(guān)的基因有456個，基 因 信 息 處 理 （Genetic Information Processing）相關(guān)的基因有231個，細(xì)胞過程（Cellular Processes）相 關(guān) 的 基 因 有225個?？?見，代 謝（metabolism）相關(guān)的基因占比最大，其中又以碳水化合物的代謝（Carbohydrate metabolism）和全局和概覽圖（Global and overview maps）的基因居多，分別有497和303個基因。

表3 沙門氏菌在不同培養(yǎng)基的差異性代謝產(chǎn)物Table 3 Differential metabolites in different medium with S.typhimurium

將SM和DS的差異性代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝通路分析（www.metaboanalyst.ca），表明主要參與丙酮酸代 謝 （Pyruvate metabolism） 和 糖 酵 解/糖 異 生（Glycolysis/Gluconeogenesis），而基因信息表明參與這兩條代謝路徑的關(guān)鍵酶分別有50和40條，都包含在碳水化合物的代謝里。將SM和BJS的差異性代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝通路分析，表明主要參與丙酸鹽代謝（Propanoate metabolism）和糖酵解/糖異生，而基因信息表明參與這兩條代謝路徑的關(guān)鍵酶分別有40和50條，都包含在碳水化合物的代謝中。

圖5 沙門氏菌基因組的KEGG注釋Fig.5 KEGG annotation of S.typhimurium genome

3 結(jié)語

綜上所述，1-丁醇和2，4-二叔丁基苯酚同時是沙門氏菌接種于豆腐干和牛肉干培養(yǎng)12 h后的差異性代謝產(chǎn)物。首先，KEGG數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/）并沒有收錄2，4-二叔丁基苯酚相關(guān)的代謝信息，只在沙門氏菌的基因信息中發(fā)現(xiàn)芳香化合物的降解（Degradation of aromatic compounds）有11個關(guān)鍵酶涉及芳香化合物的代謝。其次，KEGG數(shù)據(jù)庫表明1-丁醇主要參與丁酸代謝（Butanoate metabolism）、不同環(huán)境的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments）及芳香族化合物的降解（Degradation of aromatic compounds）3個代謝路徑，而沙門氏菌的KEGG基因注釋也表明沙門氏菌中有28個丁酸代謝相關(guān)基因和11個芳香族化合物的降解的相關(guān)基因，見表1和表2。此外，1-丁醇的代謝過程也可能會受到沙門氏菌中CoA?；┟摎涿傅挠绊慬24]。有研究表明，微生物Enteromorpha intestinalis[25]和Clostridium acetobutylicum[26]也能產(chǎn)生1-丁醇，因此1-丁醇是沙門氏菌污染豆腐干和牛肉干后的典型代謝物，但能不能作為沙門氏菌的潛在標(biāo)志物還有待進(jìn)一步研究。

作者利用GC-MS技術(shù)分別在不同的培養(yǎng)基中檢測到了100種左右的代謝產(chǎn)物，有大量的烴類物質(zhì)和芳香族物質(zhì)參與反應(yīng)。沙門氏菌的基因注釋表明碳水化合物的代謝的基因占比更多，且有39個有關(guān)1-丁醇的基因，結(jié)合沙門氏菌的特征性代謝產(chǎn)物和差異性代謝產(chǎn)物表明1-丁醇是主要的代謝物。因此1-丁醇是沙門氏菌污染食品的典型代謝物，但要確定其是否是潛在生物標(biāo)志物還需要進(jìn)一步研究。本研究為篩選沙門氏菌污染食品后的潛在生物標(biāo)志物提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。