醬油渣異黃酮抗氧化功效成分純化研究

黃福氣， 于志成， 劉步青， 許 宙， 焦 葉，崔 波， 鄒飛雪， 藏慶佳， 程云輝*，

（1.長(zhǎng)沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410114；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南250353；3.煙臺(tái)雙塔食品股份有限公司，山東 煙臺(tái)265404）

醬油發(fā)酵后經(jīng)淋油或抽油產(chǎn)生的剩余殘?jiān)礊獒u油渣[1]。據(jù)中國調(diào)味品協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，僅2017年我國醬油產(chǎn)量接近860萬噸[2]，按照每生產(chǎn)1噸醬油產(chǎn)生0.67噸醬油渣計(jì)算[3]，醬油渣年產(chǎn)生量可達(dá)580萬噸。醬油渣中不僅含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等營養(yǎng)成分[4]，還含有大量的大豆異黃酮、皂苷、低聚糖、膳食纖維、磷脂等生物活性物質(zhì)，是一種廉價(jià)的生物資源，尤其是其中的大豆異黃酮，它主要以苷元形式存在，具有很好的生物活性[5]。然而，國內(nèi)大多將醬油渣用作價(jià)格低廉的飼料或肥料，甚至當(dāng)作廢渣丟棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6]。因此，醬油渣中異黃酮類化合物提取工藝及純化方法的研究具有非常重要的意義。

大豆異黃酮屬于黃酮類化合物中的異黃酮類，是大豆生長(zhǎng)過程中的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物之一[7-10]，同時(shí)還是一種天然植物雌激素，具有多種生物活性作用。大豆異黃酮除具有抗氧化作用外[11]，還有改善婦女更年期綜合征[12-13]、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松[14]、抗癌[15]、抗炎[16-17]、抗菌[18]等作用，在保健品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。有研究表明醬油渣中異黃酮抗氧化活性高于大豆[19]，而且異黃酮不溶于水的特點(diǎn)使其在醬油釀造過程中僅有小部分異黃酮流失，大部分異黃酮仍殘存于醬油渣中[20]。因此，采用合適的提取純化方法從醬油渣中提取異黃酮，可使醬油渣資源得到更高值化利用。沈春華[21]利用超聲波結(jié)合乙醇提取法從醬油渣中提取大豆異黃酮，所獲得的異黃酮粗提物中異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.09%。何雋婷等[22]采用NKA9樹脂對(duì)醬油渣中大豆異黃酮進(jìn)行純化，所得到的產(chǎn)品純度可達(dá)到32%，但仍然不能滿足商品化異黃酮純度不低于40%的市場(chǎng)要求。

作者以醬油渣為原料，擬采用乙醇溶劑提取法，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化提取條件；從6種方法中篩選出效果較佳的方法進(jìn)行聯(lián)用，以提高異黃酮產(chǎn)品純度。同時(shí)通過對(duì)超氧陰離子和DPPH自由基清除能力的考察對(duì)其抗氧化性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步開發(fā)利用醬油渣資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

醬油渣由加加醬油集團(tuán)提供；大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、大豆黃素、大豆黃苷（純度均大于98%）：中國科學(xué)院成都生物研究所產(chǎn)品；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）、二氯甲烷（分析純）、正丁醇（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海常豫儀器有限公司產(chǎn)品；LGJ-18C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司產(chǎn)品；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；UV1800紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司產(chǎn)品；Waters 2695高效液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；KQ5200B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；新型密封式粉碎機(jī)：上海燁昌食品機(jī)械有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 醬油渣的預(yù)處理 將醬油渣在60℃烘箱中烘干，再用粉碎機(jī)將其粉碎（過60目篩），脫脂，干燥備用。

1.3.2 醬油渣中基本成分的測(cè)定 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：參考《GB 5009.3-2016》恒重法；蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：參考《GB/T 6432-2018》的凱氏定氮法；脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：參考《GB 5009.6-2016》的索氏提取法；灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：參考《GB 5009.4-2016》的干法灰化；總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：參考《GB/T 15672-2009》的苯酚硫酸法。

1.3.3 大豆異黃酮含量的測(cè)定

1）HPLC測(cè)定條件 參考文獻(xiàn)[23]，稍有修改。色譜柱：XBridge?C18；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液（A）、乙腈（B）；流量：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；梯度洗脫：0～3 min，流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)5%；3～10 min，流動(dòng)相B：15%；10～12 min，流動(dòng)相B：32.5%；12～13 min，流動(dòng)相B：100%；13～15 min，流動(dòng)相B：5%；15～22 min，流動(dòng)相B：5%。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別取適量大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品和醬油渣樣品用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇定容至10 mL，用0.45μm的膜過濾標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，進(jìn)行HPLC分析，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素6種異黃酮單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。6種大豆異黃酮在質(zhì)量濃度8～40 mg/L范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系。

醬油渣中大豆異黃酮主要由染料木素、大豆素、黃豆黃素、染料木苷組成。作者以染料木素、大豆素、黃豆黃素、染料木苷4種大豆異黃酮單體的總和來表示醬油渣大豆異黃酮的總量。

1.3.4 大豆異黃酮提取條件優(yōu)化 稱取5 g醬油渣，液料體積質(zhì)量比12 mL∶1 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，在70℃條件下提取4 h。選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料體積質(zhì)量比為考察因素，其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%、95%，提取溫度分別為30、40、50、60、70、80℃，提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h，液料體積質(zhì)量比分別為4、6、8、10、12、14、16 mL/g。提取完成后，將提取液離心（3 500 r/min，10 min），取上清液定容，過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算醬油渣中大豆異黃酮的提取率，計(jì)算公式如下：

式中：Y為大豆異黃酮提取率（%）；C為定容后異黃酮提取液中總大豆異黃酮質(zhì)量濃度（mg/L）；V為異黃酮提取液經(jīng)離心、定容后的體積（L）；M為所用5 g醬油渣中大豆異黃酮總質(zhì)量（mg）。

1.3.5 醬油渣中大豆異黃酮的純化方法

1）醇沉法[24]（簡(jiǎn)稱EP） 稱取醬油渣100 g，按1.3.4的最佳提取條件得到大豆異黃酮粗提液，將所得到的異黃酮粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去除乙醇溶劑后冷凍干燥，得到異黃酮粗提物，取之加入1 000 mL的純乙醇，4℃靜置5 h后過濾，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮，將濃縮液冷凍干燥獲得醇沉法大豆異黃酮純化產(chǎn)物。

2）等電點(diǎn)沉淀法[25]（簡(jiǎn)稱IS） 稱取醬油渣100 g，按1.3.4的最佳提取條件得到大豆異黃酮粗提液，將粗取液pH調(diào)至4.5，置于4℃的冰箱中放置48 h后，3 500 r/min離心20 min，取上清液濃縮、冷凍干燥，得到大豆異黃酮純化產(chǎn)物。

3）濃縮離心法[26]（簡(jiǎn)稱CCF） 稱取醬油渣100 g，按1.3.4的最佳提取條件得到大豆異黃酮粗提液，將粗提液至于濃縮至原體積的1/4，然后將濃縮液在4 000 r/min條件下離心，離心后快速倒出上清液，而沉淀中加入100 mL冷水，均勻攪拌混合20 min，再次離心，倒出水洗液，得到沉淀，將異黃酮沉淀冷凍干燥，得到濃縮離心法大豆異黃酮純化產(chǎn)物。

4）溶劑萃取法[27]分別準(zhǔn)確稱取3份醬油渣100 g，按1.3.4的最佳提取條件得到大豆異黃酮粗提液，將粗取液濃縮回收乙醇，將濃縮液倒入錐形瓶中，分別加入等體積的乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷，500 r/min下攪拌0.5 h后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜止1 h，分液，萃取3次，合并3次萃取的有機(jī)溶劑相，對(duì)其進(jìn)行真空濃縮，回收有機(jī)溶劑，并用適量的蒸餾水洗滌濃縮液，將濃縮液冷凍干燥，從而獲得大豆異黃酮純化產(chǎn)物。

5）濃縮離心法與二氯甲烷萃取法聯(lián)用（簡(jiǎn)稱CCF-DCM）：首先稱取醬油渣100 g，按1.3.4的最佳提取條件得到大豆異黃酮粗提液，然后按照1.3.5.3中（2）的方法獲得濃縮離心法大豆異黃酮產(chǎn)物，再將所得產(chǎn)物加入適量水使其分散于水中，用二氯甲烷萃取法進(jìn)行處理，從而得到濃縮離心法與二氯甲烷萃取法聯(lián)用大豆異黃酮純化物（文中簡(jiǎn)稱“異黃酮純化物”）。

1.3.6 大豆異黃酮的純度及回收率計(jì)算

式中：M1為經(jīng)純化后所得純化產(chǎn)物總異黃酮質(zhì)量，（mg）；M2為經(jīng)純化后所得純化產(chǎn)物總質(zhì)量，（mg）；C1為100 g醬油渣經(jīng)提取后所得異黃酮粗提液中異黃酮質(zhì)量濃度，（mg/L）；V1為100 g醬油渣經(jīng)提取后所得異黃酮粗提液的總體積，（L）。

1.3.7 超氧陰離子清除能力的測(cè)定 采用鄰苯三酚氧化法[28]測(cè)定。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 采用DPPH法[29]測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 醬油渣成分分析

對(duì)原料醬油渣中的水分、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、總糖等各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，醬油渣原料（干基）中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.35%的大豆異黃酮，而大豆中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2%左右[26]，相比于大豆，醬油渣原料（干基）中大豆異黃酮的含量更高，這主要是因?yàn)榇蠖巩慄S酮難溶于水，因此在抽取醬油后，仍然有大量大豆異黃酮?dú)埩粼卺u油渣中。然而，醬油渣原料（干基）中還含有較多的雜質(zhì)，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)32.57%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)8.48%，灰分及總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)26.53%，此分析結(jié)果可為異黃酮提取純化方法的選用提供依據(jù)。

2.2 醬油渣大豆異黃酮的提取

2.2.1 大豆異黃酮提取條件的優(yōu)化 基于操作流程簡(jiǎn)單、提取率高、毒性小及容易回收溶劑等優(yōu)點(diǎn)，作者采用乙醇提取醬油渣中大豆異黃酮。分別考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料體積質(zhì)量比對(duì)異黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于90%時(shí)，提取率顯著下降，而乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的提取率與體積分?jǐn)?shù)80%、90%的提取率沒有顯著性差異，見圖1（a）；此變化趨勢(shì)和沈春華等研究得到的結(jié)果相類似[21]。這可能是由于體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%乙醇溶液的極性與大豆異黃酮的極性更相近，依據(jù)相似相容的原理，有較多的大豆異黃酮溶于乙醇溶液中。當(dāng)提取溫度超過70℃時(shí)，大豆異黃酮的提取率顯著下降，見圖1（b）；出現(xiàn)此現(xiàn)象可能是由于溫度過高，導(dǎo)致乙醇揮發(fā)和大豆異黃酮裂解，從而使得提取率下降。在4 h時(shí)提取率達(dá)到最大值，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降，結(jié)果見圖1（c）。這可能是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)、高溫導(dǎo)致大豆異黃酮氧化、降解，因此提取時(shí)間不宜過長(zhǎng)。液料體積質(zhì)量比在4～12 mL/g范圍內(nèi)，提取率增加顯著，料液體積質(zhì)量比達(dá)到12 mL/g之后，大豆異黃酮提取率無明顯改變，見圖1（d）。這是因?yàn)樵谄渌崛l件不變的情況下，相對(duì)大量的提取溶劑能夠溶出更多的目標(biāo)產(chǎn)物，當(dāng)溶解達(dá)到平衡時(shí)，提取溶劑的量對(duì)大異黃酮的提取率影響不大，同時(shí)還會(huì)造成提取溶劑的浪費(fèi)產(chǎn)生更多的成本。

綜合考慮大豆異黃酮的提取率和提取成本，選取最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、溫度70℃、時(shí)間4 h、液料體積質(zhì)量比12 mL/g，以此條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)得到大豆異黃酮提取率為 （85.36±0.09）%，所得到的異黃酮粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去除乙醇溶劑后冷凍干燥，即可獲得醬油渣大豆異黃酮粗提物（簡(jiǎn)稱“異黃酮粗提物”）。

2.2.2 異黃酮粗提物基本成分分析 對(duì)異黃酮粗提物的基本成分進(jìn)行測(cè)定，異黃酮粗提物中蛋白質(zhì)、灰分、糖分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較高，分別達(dá)到27.97%、42.75%、8.28%，而異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有1.21%，沒有達(dá)到商品化異黃酮純度的要求。因此，需對(duì)異黃酮粗提物進(jìn)行除蛋白、灰分、總糖的處理，以提高大豆異黃酮的純度。

2.3 醬油渣大豆異黃酮粗提物的純化

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[24-27]，醇沉法、等電點(diǎn)沉淀法、濃縮離心法能有效去除豆粉異黃酮粗提物和醬油渣異黃酮粗提物中的蛋白質(zhì)，而二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取法具有去除豆粕、醬油渣異黃酮粗提液中灰分、糖分的效果。因此，作者選用這6種方法對(duì)異黃酮粗提物進(jìn)行純化處理。

2.3.1 6種異黃酮純化產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)、灰分、總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料體積質(zhì)量比對(duì)異黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration，extraction temperature，extraction time and liquid-solid ratio on extraction rate of isoflavones

1）6種異黃酮純化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量分析 比較了異黃酮粗提物和6種異黃酮純化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化情況，結(jié)果如圖2（a）所示。與蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.97%的粗提物相比，濃縮離心法所得異黃酮產(chǎn)物中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降到10.84%，蛋白質(zhì)去除率達(dá)61.24%，在6種純化方法中除蛋白質(zhì)效果最好。這是由于異黃酮粗提液中的蛋白質(zhì)主要以小分子蛋白質(zhì)或肽類形式存在，而肽類的水溶性較好，大豆異黃酮水溶性較差，濃縮離心法水洗離心時(shí)可以沉淀大豆異黃酮，上清液可以溶解小分子蛋白質(zhì)或多肽[30]。其他5種純化方法所得異黃酮產(chǎn)物中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與粗提物相當(dāng)，去除蛋白質(zhì)效果差。因此，濃縮離心法可獲得低蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的異黃酮產(chǎn)物，合適用于去除蛋白質(zhì)。

2）6種異黃酮純化產(chǎn)物中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析比較了異黃酮粗提物和6種異黃酮純化產(chǎn)物中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化情況，結(jié)果如圖2（b）所示。在6種純化方法中，二氯甲烷萃取法所得的異黃酮產(chǎn)物中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，灰分去除率達(dá)到87.23%，而醇沉法和等電點(diǎn)沉淀法所得異黃酮產(chǎn)物中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)幾乎沒有變化。此外，濃縮離心法異黃酮產(chǎn)物中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降到11.72%，僅次于二氯甲烷萃取法，結(jié)合圖2（a）結(jié)果可知，濃縮離心法能同時(shí)去除蛋白質(zhì)和灰分，可能因?yàn)樵谶M(jìn)行濃縮離心處理時(shí)粗提液的鹽分也溶于上清液中，從而導(dǎo)致灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。

3）6種異黃酮純化產(chǎn)物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析從圖2（c）可知，6種純化方法中濃縮離心法所得異黃酮產(chǎn)物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，除糖效果最差。二氯甲烷萃取法所得異黃酮產(chǎn)物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，僅有3.15%，總糖去除率達(dá)到61.91%，去除效果佳。此外，從圖2（b）可知，二氯甲烷萃取法去除灰分效果相對(duì)也是最好的，這可能是由于二氯甲烷溶液與大豆異黃酮皆屬于弱極性物質(zhì)，依據(jù)相似相容的原理，大部分的大豆異黃酮能溶于二氯甲烷溶液中[31]，而灰分、糖分等雜質(zhì)仍然保留在濃縮粗提液中。

圖2 異黃酮粗提物和6種純化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、灰分、糖分的比較Fig.2 Comparison of protein content，ash content and sugar content in isoflavone crude extracts and 6 purified products

2.3.2 不同純化方法所得大豆異黃酮純化物的純度及回收率分析 比較了醬油渣、異黃酮粗提物、6種不同純化方法和CCF-DCM聯(lián)用法所得異黃酮純化產(chǎn)物中異黃酮純度及回收率變化情況，結(jié)果如圖3所示。醬油渣和異黃酮粗提物的純度為0.35%和1.21%，與之相比，6種純化方法所得異黃酮純化產(chǎn)物中異黃酮純度皆有不同程度提高，其中采用濃縮離心法所得純化產(chǎn)物異黃酮的純度達(dá)到7.75%，二氯甲烷萃取法所得異黃酮純化產(chǎn)物中異黃酮純度最高，為27.74%。因此，作者將濃縮離心法與二氯甲烷萃取法聯(lián)用（CCF-DCM）對(duì)異黃酮粗提物進(jìn)行純化處理，聯(lián)用后所得異黃酮純化產(chǎn)物中的異黃酮純度及回收率分別達(dá)到44.88%和53.36%，比異黃酮粗提物和醬油渣的異黃酮純度分別提高37和128倍。CCF-DCM聯(lián)用法所得純化物中異黃酮純度及回收率高于董玲燕等采用AB-8型樹脂純化所得的醬油渣異黃酮純化產(chǎn)物中異黃酮純度（41.98%）及回收率（41.84%）的報(bào)道[25]。

比較了異黃酮粗提物和CCF-DCM聯(lián)用測(cè)定異黃酮純化物中灰分、總糖、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化，結(jié)果如圖4所示。與異黃酮粗提物相比，經(jīng)CCFDCM處理得到的異黃酮純化產(chǎn)物中灰分、總糖、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別從42.75%、8.27%、27.97%下降到0.88%、4.03%、4.99%，說明濃縮離心法與二氯甲烷萃取法聯(lián)用后純化效果更好，不僅操作簡(jiǎn)單，且所用二氯甲烷溶劑還能回收利用。

圖3 異黃酮粗提物、異黃酮純化物和6種異黃酮純化產(chǎn)物中異黃酮純度及回收率的比較Fig.3 Comparison of purity and recovery of isoflavones in isoflavone crude extracts，isoflavone purified products and 6 isoflavone purified products

圖4 異黃酮粗提物與異黃酮純化物中主要成分的比較Fig.4 Comparison of main components of isoflavone crude extract and isoflavone purified products

2.3.3 大豆異黃酮純化物單體成分分析 醬油渣、異黃酮粗提物、CCF-DCM異黃酮純化物的HPLC色譜圖如圖5所示。純化后醬油渣、異黃酮粗提物的雜峰被有效去除，CCF-DCM異黃酮純化物中異黃酮特征峰變化不大，且4種異黃酮單體（大豆素、大豆黃素、染料木素、染料木苷）均被得到很好保留，表明作者采用的乙醇提取、CCF-DCM聯(lián)用分離純化醬油渣中異黃酮的方法可行。

醬油渣中的異黃酮主要由大豆素（1.45 mg/g）、大豆黃素（0.20 mg/g）、染料木素（1.69 mg/g）、染料木苷（0.02 mg/g）組成；異黃酮粗提物中異黃酮單體大豆素、大豆黃素、染料木素、染料木苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.06、0.57、5.96、0.52 mg/g；CCF-DCM異黃酮純化物中的異黃酮單體主要以糖苷配基型為主，大豆素、大豆黃素、染料木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為104.57、41.87、302.35 mg/g，均比純化前顯著提高，在總黃酮中所占比例分別為23.30%、9.33%、67.37%，其中染料木素所占比例較純化前提高顯著（P＜0.05），但未檢測(cè)出染料木苷，這可能是由于純化過程中糖苷型的染料木苷裂解為糖苷配基型的染料木素所致。

圖5 醬油渣、異黃酮粗提物、CCF-DCM異黃酮純化物的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of soy sauce residue，isoflavone crude extract and CCF-DCM isoflavone purified products

2.4 異黃酮粗提物和CCF-DCM異黃酮純化物的抗氧化活性分析

異黃酮類化合物普遍存在于自然界植物體內(nèi)，具有多種生理活性，而這些生理活性大都建立在異黃酮化合物具有較強(qiáng)抗氧化活性的基礎(chǔ)上[32-33]。因此，以VC為對(duì)照品，作者考察了異黃酮粗提物和CCF-DCM異黃酮純化物對(duì)超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除效果，結(jié)果如圖7所示。

由圖6（a）可知，隨著異黃酮粗提物和異黃酮純化物質(zhì)量濃度的提高，超氧陰離子自由基的清除率逐漸提高，且清除率和濃度之間存在一定的量效關(guān)系。相同質(zhì)量濃度下，異黃酮純化物對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果顯著優(yōu)于異黃酮粗提物，但與VC有一定差距，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，VC、異黃酮純化物、異黃酮粗提物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為99.83%、67.65%、16.75%（P＜0.05）。

由圖6（b）可知，DPPH自由基清除率也隨著粗提物和純化物質(zhì)量濃度的提高而提高。質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，VC、異黃酮純化物、異黃酮粗提物對(duì)DPPH自由基的清除率分別為101.03%、89.18%、45.50%（P＜0.05），說明異黃酮純化物對(duì)DPPH自由基的清除能力顯著優(yōu)于異黃酮粗提物，稍弱于VC。

圖6 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rates of superoxide radicals and DPPH radicals by different mass concentration samples

同時(shí)，異黃酮純化物超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除能力的IC50值分別為0.34、0.26 mg/mL，顯著低于異黃酮粗提物IC50值9.81、1.13 mg/mL（P＜0.05），說明異黃酮粗提物經(jīng)CCF-DCM純化后具有更強(qiáng)的抗氧化活性。異黃酮純化物抗氧化活性的提高可能是基于純化過程中糖苷配基型異黃酮（染料木素）得到有效濃縮，而糖苷配基型異黃酮比其相應(yīng)的糖苷型異黃酮具有更高的生物活性[34]。

3 結(jié)語

選用乙醇提取法提取大豆異黃酮，最佳條件下獲得的異黃酮粗提物中異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.21%，經(jīng)濃縮離心法與二氯甲烷萃取法聯(lián)用純化處理后，所得異黃酮純化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、灰分、總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別從純化前的42.75%、8.27%、27.97%下降到0.88%、4.03%、4.99%，聯(lián)用純化方法不僅具有很好的純化效果，且操作簡(jiǎn)單、成本低。所得異黃酮純化物中異黃酮純度達(dá)到44.88%，比醬油渣和異黃酮粗提物分別提高128倍和37倍，能滿足商品化異黃酮產(chǎn)品對(duì)純度的要求。此外，異黃酮純化物中的異黃酮單體主要由大豆素、大豆黃素、染料木素組成，染料木素占比最高，為67.37%。抗氧化活性試驗(yàn)表明異黃酮純化物對(duì)超氧陰離子自由基和DPPH自由基皆具較好的清除能力，其IC50分別為0.34、0.26 mg/mL，并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，有望將其作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)利用。本研究結(jié)果可為醬油渣異黃酮的開發(fā)利用提供一定的參考。