PAQR9 對棕色脂肪產(chǎn)熱及UCP1 表達的影響

劉 玲 劉思佳 劉 洋 湯其群

（復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系 上海 200032）

脂肪組織是一種重要的能量代謝器官，當機體攝入能量大于消耗能量，多余的能量會以甘油三酯的形式儲存在脂肪組織中［1］。脂肪組織過多會引發(fā)肥胖、2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病，對公眾健康造成了巨大威脅。人體有3 種脂肪組織，分別是白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT），棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）和米色脂肪組織（beige adipose tissue）［2］。WAT 可以將多余的能量以甘油三酯的形式儲存，而BAT 中含有較多線粒體，通過解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）將跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子勢能與ATP 解偶聯(lián)，將能量轉(zhuǎn)化為熱能，從而起到產(chǎn)熱和消耗能量的作用［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境誘導下小鼠腹股溝皮下白色脂肪會產(chǎn)生功能、形態(tài)類似于棕色脂肪的細胞，內(nèi)含許多線粒體和小脂滴，能夠高表達UCP1，和棕色脂肪細胞一樣能夠促進脂肪組織代謝產(chǎn)熱。但其與傳統(tǒng)棕色脂肪細胞的前體起源不同，因此被命名為米色脂肪細胞［4］。二者被統(tǒng)稱為產(chǎn)熱性脂肪組織。自此，研究者對于米色脂肪細胞的誘導激活產(chǎn)生了極大的興趣，其可作為對抗肥胖的新型靶細胞。

UCP1 特異性表達于BAT 的線粒體中［5］，是成熟棕色脂肪特異性的產(chǎn)熱基因［6］。白色脂肪細胞被誘導為米色脂肪細胞后高表達UCP1。實驗中往往將UCP1 作為重要的標志物來研究脂肪組織的產(chǎn)熱功能。棕色、米色脂肪細胞的線粒體內(nèi)膜上有UCP1 質(zhì)子通道，通過線粒體內(nèi)膜來消散質(zhì)子梯度，使質(zhì)子回流，破壞電子傳遞中的跨膜電化學梯度，物質(zhì)氧化和ATP 生成解偶聯(lián)，ATP 合成受到抑制，能量會以熱量的形式散發(fā)出去。UCP1 在體溫維持過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當機體的交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生興奮，如受到冷刺激的誘導時［7］，棕色和米色脂肪組織的產(chǎn)熱功能被激活，可以被用于治療肥胖、糖尿病等代謝性疾?。?］。冷刺激誘導下，腹股溝皮下WAT 中UCP1 表達明顯上調(diào)［9］，使其出現(xiàn)BAT 的典型特點，增加產(chǎn)熱和能量消耗［10］。

由于傳統(tǒng)的減肥藥具有不良反應(yīng)，未達到理想的臨床效果。因此，篩選出新型基因來誘導激活棕色脂肪產(chǎn)熱有助于改善機體代謝和減輕肥胖程度，具有良好的研究前景。本課題組致力于研究脂肪細胞發(fā)育分化及代謝調(diào)控機制，篩選在脂肪組織產(chǎn)熱過程發(fā)揮重要作用的蛋白。此前，課題組通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在冷刺激誘導后的腹股溝皮下WAT中篩選，發(fā)現(xiàn)PAQR9 的表達水平顯著升高，推測其可能在激活脂肪組織產(chǎn)熱過程中發(fā)揮重要作用。近年來對PAQR9 的研究非常少見，對其在該過程中的功能進行初步探索，可以為肥胖等疾病治療提供新的理論依據(jù)。

本研究中，我們首先檢測了PAQR9 在小鼠脂肪組織中的表達情況及冷暴露刺激條件下脂肪組織和腹股溝皮下WAT 成熟脂肪細胞中PAQR9 的表達情況，對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行驗證。再利用前棕色脂肪細胞系DE2-3 和間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2 為模型開展研究，通過在細胞中過表達和敲低PAQR9 基因，探討該基因?qū)ψ厣井a(chǎn)熱及UCP1表達的影響。

材料和方法

儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Thermo Fisher 公司；PCR 儀購于德國Eppendorf 公司；蛋白質(zhì)印跡電泳槽等購于美國Bio-Rad 公司；化學發(fā)光儀購于美國GE 公司；冷凍離心機購于德國Eppendorf AG 公司；Milli-q 超純水系統(tǒng)購于德國Millipore 公司。

主要試劑DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清購于美國Gibco 公司；UCP1 抗體購于美國Abcam 公司；HSP90 抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology 公司；SYBR Green reagent 購于美國ABI 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa 公司；ECL 發(fā)光液購于上海圣爾生物有限公司；三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇、無水乙醇均購于國藥集團化學試劑上海有限公司；BCA 定量試劑盒、opti-MEM 培養(yǎng)基、蛋白Marker 購于美國Thermo Fisher 公司；Trizol 和lipofectamine RNAiMAX 試劑購于美國Invitrogen公司；PBS 試劑購于以色列BI 公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、三碘甲狀腺氨酸（T3）、吲哚美辛、羅格列酮、油紅O 購于美國Sigma-Alderich 公司；胰島素、蛋白酶抑制劑購于瑞士Roche 公司。

實驗動物雄性C57BL/6J 小鼠購于南京大學模式動物中心，小鼠置于SPF 級動物房，在（22±2）℃，相對濕度55%±5%的環(huán)境中飼養(yǎng)。維持12/12 h 光/暗循環(huán)。動物實驗均遵循復旦大學實驗動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

處死取材將動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后處死，取5只雄性C57BL/6J 小鼠BAT、附睪內(nèi)臟WAT 及腹股溝皮下WAT，速凍于液氮中。

前棕色脂肪細胞系DE2-3 培養(yǎng)及誘導分化實驗室前期獲得了永生化的前棕色脂肪細胞系［11］（美國麻省大學醫(yī)學院王永旭博士及復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院潘東寧教授惠贈），按照下述標準法可誘導其分化為成熟棕色脂肪細胞。細胞培養(yǎng)箱恒溫37 ℃，含有5%CO2。在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，每2 天給細胞換1 次液，傳代后接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿。鏡下觀察貼壁細胞密度占視野70%時記為第2 天（day-2），培養(yǎng)基中加入三碘甲狀腺氨酸和胰島素，混勻后給細胞換液；2 天后細胞密度達到100%，記為第0 天（day 0），在DMEM 中加入0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，0.5 μmol/L 地塞米松，0.125 mmol/L吲哚及1 μg/mL 胰島素，搖勻后換液；在第2 天（day 2）和第4 天（day 4），操作同第-2 天（day -2），補加三碘甲狀腺氨酸和胰島素，混勻后給細胞換液，鏡下觀察到細胞的脂滴逐漸增多；第6 天（day 6），可以觀察到鏡下布滿脂滴，誘導分化結(jié)束，收取細胞樣本進行后續(xù)實驗。

C3H10T1/2 細胞系培養(yǎng)及誘導分化間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2 購于美國ATCC 細胞庫。該細胞系是科學家于1973 年由14～17 日齡C3H 小鼠胚胎中分離出來［12］，細胞呈現(xiàn)成纖維細胞形態(tài)。Tang等［13］研究發(fā)現(xiàn)該細胞模型可以定向誘導分化為成熟脂肪細胞。細胞培養(yǎng)箱恒溫37 ℃，含有5%CO2。在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，每2 天換1 次液，傳代后接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿。細胞接觸抑制2 天后開始誘導分化，記為第0 天（day 0），在DMEM 培養(yǎng)基中加入1 μg/mL 胰島素、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和1 μmol/L 羅格列酮誘導48 h。第2 天（day 2）時更換培養(yǎng)基，補加1 μmol/L羅格列酮和1 μg/mL 胰島素繼續(xù)誘導細胞48 h。在第4 天（day 4）給細胞更換含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，不補加藥物。直至第6 天（day 6）脂肪細胞分化成熟。

構(gòu)建過表達腺病毒設(shè)計帶有酶切位點的引物，PCR 得到兩端帶有酶切位點的基因。酶切回收得到目的片段和載體，將回收的產(chǎn)物相連接；擴增連接產(chǎn)物，測序以驗證序列；LR 重組及PacⅠ酶切；將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)染至HEK 293A 工具細胞中包裝病毒。向培養(yǎng)皿中加入LacZ 病毒（對照組）和PAQR9病毒各（實驗組）60 μL 感染DE2-3 細胞，24 h 后更換為含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至脂肪細胞分化成熟。

小干擾RNA 100 μL opti-MEM 中加入6 μL 3.5 cm 細胞培養(yǎng)皿用量的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），根據(jù)所需用量配齊總管，輕輕吹打混勻，記為管1。再取另一EP 管加入100 μL opti-MEM 及6 μL轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine RNAiMAX（3.5 cm 細胞培養(yǎng)皿用量），根據(jù)所需用量配齊總管，輕輕吹打混勻，記為管2，管1、管2 靜置3 min，將管2溶液緩緩滴加到管1 中，反復吹打5 次，混勻后靜置20 min。將細胞上清培養(yǎng)基傾倒，換為2 mL opti-MEM。將靜置的siRNA 緩緩加到細胞，每個3.5 cm培養(yǎng)皿加入200 μL siRNA。24 h 后傾倒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，換成含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，在轉(zhuǎn)染48 h 后進行后續(xù)實驗操作。siNC 為對照組，siPAQR9 1-3 為實驗組。siRNA 序列如下：NC 上游引物序列5’-UUCUCCGAACGUGUCACG-UTT-3’，NC 下游引物序列ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；siPAQR9-1 上游引物序列5’-GCUGCCGCUGUGGUGCUAUTT-3’，siPAQR9-1 下游引物序列5’-AUAGCACCACAGCGGCAGCTT-3’；siPAQR9-2 上游引物序列5’-GCCUUCUUCUACCUGGACUTT-3’，siPAQR9-2下游引物序列5’-AGUCCAGGUAGAAGAAGGCTT-3’；siPAQR9-3 上游引物序列5’-GCACCUUCGUCUUCGUCAUTT-3’，siPAQR9-3 下游引物序列5’-AUGACGAAGACGAAGGUGCTT-3’。

液態(tài)氧電極檢測細胞氧氣消耗按照說明書安裝氧電極（YSI model 5300A），KCl 溶液作為電解液，連接線路接通電源。在電腦軟件中校正，清洗反應(yīng)室，將細胞用700 μL 胰酶消化，再加入700 μL緩沖液終止消化。500×g離心2 min，棄上清，用700 μL 緩沖液重懸細胞。加入機器中，觀察耗氧曲線，記錄數(shù)值。緩沖液配置方法：PBS 溶液中加入25 mmol/L 葡萄糖，1 mmol/L 丙酮酸鈉和2% BSA。每個3.5 cm 細胞培養(yǎng)皿中加入700 μL 緩沖液。

RNA 制備和實時熒光定量PCR 檢測利用Trizol 法提取細胞及組織中的RNA，測定RNA 濃度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列如下：18SrRNA 上游引物序列5’-CGCCGCTAGAGGTGAAATTCT-3’，18SrRNA下游引物序列5’-CATTCTTGGCAAATGCTTTCG-3’；PAQR9 上游引物序列5’-GGACTACGCTTCCATCAGCTA-3’，PAQR9 下游引物序列5’-CAGTCGGTGCGGCTCTTAC-3’；UCP1 上游引物序列5’-AGGCTTCCAGTACCATTAGGT-3’，UCP1 下游引物序列5’-CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT-3’；Adipoq 上游引物序列5’-TGTTCCTCTTAATCCTGCCCA-3’，Adipoq 下游引物序列5’-CCAACCTGCACAAGTTCCCTT-3’；Fabp4 上游引物序列：5’-CCTTTGTGGGAACCTGGAA-3’，F(xiàn)abp4 下游引物序列5’-CTGTCGTCTGCGGTGATT-3’；PPARγ 上游引物序列5’-GTGCCAGTTTCGATCCGTAGA-3’，PPARγ 下游引物序列5’-GGCCAGCATCGTGTAG-TGA-3’。

蛋白免疫印跡法檢測用細胞裂解液裂解細胞和組織蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣品加入上樣孔，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再經(jīng)過PVDF 膜濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，在4 ℃冰箱中搖床上用特異性的一抗孵育，過夜。孵育與之對應(yīng)的二抗，持續(xù)1 h。洗膜5 次后，用ECL 發(fā)光液發(fā)光顯影。

油紅O 染色稱量0.5 g 油紅O 粉末，溶于100 mL 異丙醇，搖床過夜搖勻后制備為貯存液。油紅O貯存液與蒸餾水比例為3∶2混合搖勻，轉(zhuǎn)速1 000×g，離心5 min，棄去管底沉淀，濾紙過濾3 次，制備成油紅O 工作液。脂肪細胞誘導分化成熟后，將細胞棄去DMEM 培養(yǎng)液，用PBS 清洗2～3 次，3.7%甲醛固定細胞20 min 后用水清洗，每個3.5 cm 培養(yǎng)皿加入2 mL 油紅O 工作液，染色2 h 以上。染色結(jié)束后用水清洗油紅，每個培養(yǎng)皿中加入少量蒸餾水，鏡下觀察及拍照。

統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0 分析處理，數(shù)據(jù)分析均為兩組結(jié)果之間相比較，采用非配對t檢驗。數(shù)據(jù)結(jié)果用表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

小鼠BAT 和WAT 及冷刺激后PAQR9 的mRNA水平變化取C57BL/6 雄性小鼠肩胛間區(qū)BAT、腹股溝皮下白色脂肪組織（inguinal WAT，iWAT）和附睪內(nèi)臟白色脂肪組織（epididymal WAT，eWAT）用于實驗研究（圖1A）。檢測以上不同位置脂肪組織中PAQR9 的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)BAT 中PAQR9 的mRNA 水平顯著高于WAT（P＜0.001，圖1B），這提示PAQR9 可能在BAT 中發(fā)揮重要功能。同時，實驗設(shè)計了3 種溫度條件，分別是在4 ℃冷暴露（cold）、室溫（RT）和30 ℃熱中性（warm）環(huán)境下，檢測發(fā)現(xiàn)，與室溫條件相比，BAT 和iWAT 在冷刺激誘導下PAQR9 的mRNA 水平顯著上調(diào)（BAT：P＜0.001，iWAT：P＜0.01，圖 1C），而eWAT 在冷刺激誘導下PAQR9 的mRNA 水平變化不明顯（圖1C）。相較于室溫條件，在冷刺激誘導下的iWAT 中提取出的成熟脂肪細胞中PAQR9 的mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.001，圖1D）。以上結(jié)果提示，PAQR9 在冷刺激誘導脂肪組織產(chǎn)熱的過程中可能扮演重要角色。

圖1 小鼠BAT 和WAT 及冷刺激后PAQR9 的mRNA 水平變化Fig 1 The mRNA level of PAQR9 from BAT and iWAT from C57BL/6 mice after cold stimulation

DE2-3 細胞中過表達PAQR9 對成脂分化及產(chǎn)熱基因UCP1 的影響將前棕色脂肪細胞系DE2-3通過標準法誘導分化為成熟棕色脂肪細胞。分別取第-2、0、2、4、6 天的細胞，檢測PAQR9 的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)第6 天時PAQR9 的mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.001，圖2A），推測PAQR9 在棕色脂肪細胞成脂分化過程中可能發(fā)揮功能。構(gòu)建過表達PAQR9 的腺病毒感染DE2-3 細胞，成功過表達PAQR9（P＜0.001，圖2B）。過表達PAQR9 后，DE2-3 細胞中產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.01，圖2C）。通過液態(tài)氧電極測量氧氣消耗量，發(fā)現(xiàn)過表達PAQR9 后耗氧量增加（P＜0.01，圖2D），說明過表達PAQR9 可以增加氧氣的消耗，促進細胞代謝功能。同時，探究PAQR9 是否對細胞的成脂分化能力有影響。在成脂誘導分化后第7 天收取細胞樣品，過表達PAQR9 病毒的實驗組與過表達LacZ 病毒的對照組相比，成脂分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂聯(lián)素（adiponectin/Adipoq）和脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP4）的mRNA 水平?jīng)]有顯著性差異（圖2E）。對細胞進行油紅O 染色，肉眼觀察和鏡下觀察（比例尺50 μm）并拍照，發(fā)現(xiàn)兩組細胞的油紅染色率相當（圖2F、2G）。說明過表達PAQR9 不影響DE2-3 細胞的成脂分化功能，可以促進細胞氧氣消耗，使產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 水平升高。

DE2-3 細胞中敲低PAQR9 抑制產(chǎn)熱基因UCP1的mRNA 水平將前棕色脂肪細胞系DE2-3 通過標準法誘導分化為成熟棕色脂肪細胞。設(shè)計了3 條siRNA 進行實驗，成功將PAQR9 在DE2-3 細胞中敲低（P＜0.001，圖3A）。檢測發(fā)現(xiàn)DE2-3 細胞在敲低PAQR9 之后UCP1 mRNA 水平顯著下調(diào)（P＜0.001，圖3B）。

C3H10T1/2 細胞中敲低PAQR9 對成脂分化及產(chǎn)熱基因UCP1 的影響間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2能夠在誘導劑作用下分化為成熟脂肪細胞［14］。在C3H10T1/2 細胞培養(yǎng)過程中，取第0、2、4、6 天的細胞，檢測發(fā)現(xiàn)在第4～6 天脂肪細胞分化成熟時PAQR9 的mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.001，圖4A）。設(shè)計了2 條siRNA，檢測發(fā)現(xiàn)siPAQR9-2 將基因敲低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4B）。檢測發(fā)現(xiàn)C3H10T1/2 細胞在敲低PAQR9 之后UCP1的蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)（圖4C）。以上結(jié)果表明，敲低PAQR9 會抑制脂肪細胞產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平。對細胞進行油紅O 染色，肉眼觀察并拍照，發(fā)現(xiàn)兩組細胞的油紅染色率相當（圖4D），說明敲低PAQR9 不影響C3H10T1/2 細胞的成脂分化功能。

圖2 DE2-3 細胞中過表達PAQR9 對成脂分化及產(chǎn)熱基因UCP1 的影響Fig 2 The effect on adipogenesis and thermogenesis gene UCP1 after the overexpression of PAQR9 in DE2-3 cells

圖3 DE2-3 細胞中敲低PAQR9 抑制產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 水平Fig 3 The mRNA level of thermogenesis gene UCP1 after knocking down PAQR9 in DE2-3 cells

討論

隨著生活水平提高、社會環(huán)境改變及遺傳等多方面因素的影響，人們攝入體內(nèi)的能量遠遠高于其消耗量，導致了能量不平衡［15］，進一步誘發(fā)肥胖等疾病，給患者及其家庭和社會帶來痛苦和沉重負擔，已然成為科學界密切關(guān)注的問題。遺憾的是，傳統(tǒng)的治療方法效果不能令人滿意［16］。

圖4 C3H10T1/2 細胞中敲低PAQR9 對成脂分化及產(chǎn)熱基因UCP1 的影響Fig 4 The effect on adipogenesis and thermogenesis gene UCP1 after knocking down PAQR9 in C3H10T1/2 cells

棕色脂肪細胞內(nèi)存在多個小脂滴，含有大量線粒體，便于其吸收、利用葡萄糖和脂肪酸等能量供應(yīng)物質(zhì)［17］。通過細胞內(nèi)線粒體中UCP1 將能量轉(zhuǎn)化為熱能，使機體內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)態(tài)。正因為棕色脂肪具有產(chǎn)熱功能，已然成為了當下治療代謝性疾病的潛在靶點之一。米色脂肪則與傳統(tǒng)的棕色脂肪來源不同，但它們都是產(chǎn)熱性脂肪，能夠在寒冷刺激等因素誘導下激活產(chǎn)熱功能，具有消耗多余能量的潛力。產(chǎn)熱性脂肪的功能調(diào)節(jié)成為了代謝領(lǐng)域的研究熱點，科研人員試圖以此為突破口篩選出能夠促進產(chǎn)熱功能的基因，開發(fā)出健康有效的新一代肥胖治療方法［18］。

UCP1 是成熟棕色脂肪細胞的特異性標志物，同時也是白色脂肪棕色化激活的表現(xiàn)。在低溫環(huán)境下，哺乳動物會發(fā)生顫栗，通過產(chǎn)熱來維持體溫恒定，而后會轉(zhuǎn)變成利用棕色脂肪組織進行非顫栗性產(chǎn)熱，線粒體內(nèi)膜的UCP1 則是決定BAT 產(chǎn)熱功能的關(guān)鍵因素。而在熱中性條件下，無需額外消耗能量即可維持生理活動。冷暴露是一種非顫抖性產(chǎn)熱的強刺激因子，實驗經(jīng)常在冷暴露誘導的條件下開展，探究激活產(chǎn)熱脂肪發(fā)揮作用的機制［19］。

既往研究發(fā)現(xiàn)，6 周齡大小的C57BL/6 小鼠BAT 中Zfp516 的mRNA 水平顯著高于WAT。相比于室溫條件，在4 ℃冷暴露刺激下BAT 中的Zfp516 和UCP1 蛋白質(zhì)水平顯著上調(diào)，從而促進棕色脂肪產(chǎn)熱［20］。還有文獻報道，在4℃條件下BAT中JAK2 基因蛋白質(zhì)水平上調(diào)，而在WAT 中變化不明顯，且UCP1 的mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平都顯著上調(diào)［21］。篩選出調(diào)控棕色脂肪產(chǎn)熱功能的新型基因?qū)τ谥委煼逝值却x性疾病具有深遠意義。本課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，在冷暴露誘導下腹股溝皮下WAT 中PAQR9 表達上調(diào)，結(jié)合前人的研究經(jīng)驗，我們推測PAQR9 可能在棕色脂肪產(chǎn)熱過程中發(fā)揮著重要功能。PAQRs 共有11 個家族成員，具有7 次跨膜結(jié)構(gòu)，特有1 個PFAM-UPF0073 結(jié)構(gòu)域。該家族成員分為3 個亞群：PAQR1-PAQR4 屬于脂聯(lián)素受體，能夠在葡萄糖攝取及脂肪酸代謝方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；孕激素膜蛋白受體為PAQR5-PAQR9；此外，還有溶血素受體即PAQR10 和PAQR11［22］。PAQR 蛋白家族發(fā)揮著廣泛的生物學功能，在細胞凋亡、脂肪酸氧化、性激素調(diào)控等方面發(fā)揮作用［23］。然而近年來對PAQR9 的研究非常少，僅有報道其在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制方面的作用［24］，其功能尚未被完全闡明，且在脂肪代謝領(lǐng)域未見報道。根據(jù)前期實驗結(jié)果，我們推測PAQR9 可能在脂肪代謝產(chǎn)熱過程中扮演一定角色，進一步探索將為治療相關(guān)代謝性疾病提供新型靶標。

為了進一步探究PAQR9 基因在脂肪代謝產(chǎn)熱過程中的作用，我們首先檢測了肩胛間區(qū)BAT、iWAT 和eWAT 中PAQR9 的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在BAT 中特異性高表達。與室溫條件相比較，4 ℃冷暴露刺激后，BAT 和iWAT 中PAQR9 表達顯著上調(diào)，在iWAT 中提取的成熟脂肪細胞中的結(jié)果與上述一致。由于冷刺激能夠促進BAT 產(chǎn)熱，以上結(jié)果提示脂肪產(chǎn)熱過程中PAQR9 扮演著重要角色。

后續(xù)實驗采用兩種不同的細胞模型進行研究，首先將DE2-3 前棕色脂肪細胞系誘導分化為成熟棕色脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)在分化第6 天脂肪細胞中PAQR9 顯著性高表達，提示PAQR9 在棕色脂肪細胞的成脂分化過程中可能發(fā)揮作用。PPARγ 被認為是脂肪早期形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，而脂聯(lián)素（adiponectin/Adipoq）和FABP4 則負責成熟脂肪細胞的形成［25］。于是通過實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測以上成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA 水平，結(jié)合油紅O 染色法檢測發(fā)現(xiàn)過表達PAQR9 后DE2-3 細胞的成脂分化能力無明顯變化。在DE2-3 細胞中成功過表達PAQR9，檢測發(fā)現(xiàn)標志性產(chǎn)熱基因UCP1 的mRNA 水平顯著上調(diào)。細胞耗氧量的檢測是研究細胞代謝及其功能的一項重要指標，液態(tài)氧電極法檢測發(fā)現(xiàn)PAQR9 上調(diào)可以促進氧氣消耗，促進細胞代謝。在DE2-3 細胞中敲低PAQR9 后，UCP1 的mRNA 水平顯著下調(diào)。

以C3H10T1/2 細胞為研究模型，檢測發(fā)現(xiàn)在第4～6 天脂肪細胞分化成熟時PAQR9 的mRNA 表達顯著上調(diào)。敲低PAQR9 之后UCP1 蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)。敲低PAQR9 后脂肪細胞的成脂分化無明顯變化。以上結(jié)果表明，在C3H10T1/2 細胞中敲低PAQR9 會抑制產(chǎn)熱基因UCP1 的表達。

本研究發(fā)現(xiàn)，PAQR9 能夠促進棕色脂肪細胞產(chǎn)熱，調(diào)控產(chǎn)熱基因UCP1 的表達，為PAQR9 在脂肪代謝領(lǐng)域的研究提供了思路，為治療肥胖等疾病提供更多理論依據(jù)，為研發(fā)新型減肥藥帶來了重大突破。未來可以進一步開展動物實驗研究，進一步研究和探討PAQR9 的作用通路及機制等問題。