結(jié)構(gòu)生物學(xué)在溶組織內(nèi)阿米巴致病機(jī)制研究中的應(yīng)用

趙晏慶（綜述） 程訓(xùn)佳（審校）

（復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系 上海 200032）

溶組織內(nèi)阿米巴（Entamoeba histolytica，Eh）是一種主要寄生在人體腸道的厭氧原蟲，可引起嚴(yán)重的阿米巴性結(jié)腸炎和腸外膿腫。阿米巴病的嚴(yán)重性在全球寄生原蟲病中居第二位，致死率僅次于瘧疾。據(jù)估計(jì)，全世界每年約有5～10 萬人死于阿米巴病，5 000 萬人出現(xiàn)Eh新感染。Eh感染人體的過程與一系列阿米巴毒力因子蛋白質(zhì)相關(guān)。具有感染性的Eh包囊經(jīng)口攝入人體，隨后通過胃和小腸，在回腸末端或結(jié)腸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兄虏⌒缘淖甜B(yǎng)體。滋養(yǎng)體通過細(xì)胞表面的半乳糖/乙酰氨基半乳糖可抑制性 凝 集 素（galactose/N-acetyl galactosamineinhibitable lectin，Gal/GalNAc lectin）等物質(zhì)黏附于宿主腸上皮細(xì)胞，隨后釋放阿米巴穿孔素（amoebapore）和半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CP）等毒力因子，通過接觸依賴性細(xì)胞溶解作用使與之接觸的細(xì)胞發(fā)生壞死或凋亡，亦或通過胞啃作用直接損傷宿主細(xì)胞，從而形成燒瓶樣的腸道潰瘍［1-4］。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)（structural biology）是一門通過交叉融合生物、化學(xué)、物理、數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)等多領(lǐng)域知識(shí)來研究生物大分子的結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而闡明生命現(xiàn)象的學(xué)科，這門學(xué)科的出現(xiàn)與發(fā)展為藥物設(shè)計(jì)、疫苗開發(fā)和蛋白質(zhì)分子性能改造等應(yīng)用方向奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)［5-6］。結(jié)構(gòu)生物學(xué)的起源可以追溯到20 世紀(jì)50 年代Waston 和Crick 解析出DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)［7］。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)構(gòu)生物學(xué)在核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中發(fā)揮越來越重要的作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)坐標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB，http：//www.rcsb.org/pdb）中收錄已解析的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)目從1989 年的300 余個(gè)增至156 101 個(gè)（截至2019 年9 月18 日）。結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)也已運(yùn)用到現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，包括人體寄生蟲學(xué)研究領(lǐng)域。在人體寄生原蟲Eh中，已經(jīng)解析出150 余種蟲體蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，為研究阿米巴代謝活動(dòng)、致病機(jī)制以及研發(fā)藥物和疫苗等提供了重要信息。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)發(fā)展概況目前結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要研究方法包括X 射線晶體學(xué)（X-ray macromolecular crystallography）、核磁共振波譜學(xué)（nuclear magnetic resonance spectroscopy）和冷凍電子顯微學(xué)（cryo-electron microscopy）。

X 射線晶體學(xué) 1957 年，英國科學(xué)家Kendrew等［8］首次將X 射線晶體學(xué)方法運(yùn)用于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析，即獲得分辨率為6? 的抹香鯨肌紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)。之后，Kendrew 等［9］將抹香鯨肌紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分辨率提高到2?，并獲得1962 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。X 射線晶體學(xué)的基本原理是利用X 射線對(duì)高純度蛋白質(zhì)晶體進(jìn)行衍射，通過對(duì)衍射數(shù)據(jù)的分析處理來獲得近原子分辨率的蛋白質(zhì)大分子三維結(jié)構(gòu)。經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的理論發(fā)展和硬件設(shè)備升級(jí)，X 射線晶體學(xué)已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中最主要的研究手段之一［10-11］。

目前PDB 數(shù)據(jù)庫收錄的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中有89.1%（139 132 個(gè)，截至2019 年9 月18 日）是通過X射線晶體學(xué)方法解析得到的。然而，X 射線晶體學(xué)的應(yīng)用仍存在一定的局限，即必須先獲得可衍射的蛋白質(zhì)晶體才能進(jìn)行結(jié)構(gòu)探測，而在實(shí)驗(yàn)室獲得蛋白質(zhì)結(jié)晶往往是一個(gè)非常耗時(shí)且具有挑戰(zhàn)性的工作，特別是膜蛋白和超大分子量蛋白質(zhì)復(fù)合物通常難以結(jié)晶，往往需要通過誘變和高通量篩選來獲得構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白質(zhì)樣品［5，12-13］。因此，一些重要的蛋白質(zhì)分子難以通過X 射線晶體學(xué)方法獲得三維結(jié)構(gòu)信息，需要尋求其他的解決方法。

核磁共振波譜學(xué) 20 世紀(jì)50 年代，核磁共振技術(shù)與X 射線衍射方法幾乎同時(shí)開始應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域。1957 年，Saunders 等［14］首次成功運(yùn)用核磁共振波譜學(xué)方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)即核糖核酸酶的三維結(jié)構(gòu)。多維光譜學(xué)、量子計(jì)算和高通量核磁共振技術(shù)的發(fā)展，為核磁共振波譜學(xué)提供了理論和技術(shù)支撐［15-18］。目前PDB 數(shù)據(jù)庫收錄的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中有8.1%（12 657 個(gè)，截至2019 年9 月18日）是通過核磁共振波譜學(xué)方法解析得到的。

核磁共振波譜學(xué)通常用于解析溶液中蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)特征以及蛋白質(zhì)間相互作用。與X射線晶體學(xué)相比，核磁共振波譜技術(shù)解析出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更接近于生理狀態(tài)。然而，該技術(shù)常用于解析不易結(jié)晶的小分子量蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對(duì)于大分子量蛋白質(zhì)復(fù)合體或難溶于水的蛋白質(zhì)往往不易得到理想的結(jié)果。在21 世紀(jì)之前，通過核磁共振技術(shù)解析結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子量幾乎都不超過25 000。隨著技術(shù)發(fā)展，特別是脈沖序列技術(shù)的突破，通過核磁共振解析的最大蛋白質(zhì)分子量突破1MDa，因此核磁共振波譜學(xué)依然具有很好的應(yīng)用前景［19-20］。

冷凍電子顯微學(xué) 冷凍電子顯微學(xué)，又稱冷凍電鏡技術(shù)，是一項(xiàng)從20 世紀(jì)70 年代發(fā)展起來的新興技術(shù)，現(xiàn)已成功運(yùn)用于細(xì)胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。2013 年，由于直接電子相機(jī)的應(yīng)用，冷凍電鏡技術(shù)成功解析高分辨率膜蛋白三維結(jié)構(gòu)，即分辨率為3.4 ? 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜蛋白辣椒素受體的三維結(jié)構(gòu)［21］。在此之后，越來越多的膜蛋白和分子量較大的蛋白質(zhì)及其復(fù)合物通過冷凍電鏡技術(shù)解析出三維結(jié)構(gòu)。目前PDB 數(shù)據(jù)庫收錄的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中有2.4%（3 755 個(gè)，截至2019 年9 月18 日）是通過冷凍電鏡技術(shù)解析得到的。

冷凍電鏡技術(shù)的基本原理是將細(xì)胞或生物大分子樣品快速冷凍，然后利用透射電子顯微鏡收集冷凍樣品的圖像，后續(xù)通過一系列數(shù)據(jù)處理方法來重構(gòu)冷凍樣品的三維結(jié)構(gòu)?；痉治龇椒ò▎晤w粒三維重構(gòu)法、電子晶體學(xué)方法和電子斷層掃描成像技術(shù)等，其中單顆粒三維重構(gòu)法是解析蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)最常用的方法。單顆粒三維重構(gòu)法是根據(jù)蛋白質(zhì)分子的不同取向，將電鏡視野中數(shù)以百萬計(jì)的單個(gè)蛋白質(zhì)分子顆粒圖像進(jìn)行分類和平均，提高圖像信噪比，從而解析得到高分辨率的蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)［22］。在冷凍電鏡技術(shù)中，蛋白質(zhì)樣品通常無需結(jié)晶，只需要很少量蛋白質(zhì)溶液（如在單顆粒三維重構(gòu)法中只需3 μL 左右濃度為1～10 μg/μL 的蛋白質(zhì)溶液）通過快速冷凍即可進(jìn)行圖像收集和處理，可以盡量保持樣品的原始狀態(tài)，得到更有意義的結(jié)構(gòu)分析［23-25］。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)在Eh 致病機(jī)制研究中的應(yīng)用目前，PDB 數(shù)據(jù)庫中收錄的Eh蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)共計(jì)156 個(gè)，其中有143 個(gè)是通過X 射線晶體學(xué)方法解析的，另外13 個(gè)是通過核磁共振波譜學(xué)技術(shù)解析的，暫無通過冷凍電鏡技術(shù)解析的結(jié)構(gòu)。在已解析的Eh蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中有39 個(gè)是結(jié)構(gòu)蛋白，包括肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、鈣調(diào)蛋白等，還有117 個(gè)是非結(jié)構(gòu)蛋白，主要是參與阿米巴細(xì)胞代謝的各類酶。Eh致病過程相關(guān)的重要蛋白質(zhì)當(dāng)中，三維結(jié)構(gòu)得到解析的有阿米巴穿孔素A 和半胱氨酸蛋白酶抑制劑。

阿米巴穿孔素A 在Eh幾種重要的毒力因子蛋白質(zhì)中，最先解析出三維結(jié)構(gòu)的是阿米巴穿孔素A。阿米巴穿孔素是一類存在于滋養(yǎng)體細(xì)胞質(zhì)顆粒中的小分子蛋白家族，包括阿米巴穿孔素A、B 和C。當(dāng)阿米巴滋養(yǎng)體與靶細(xì)胞或組織接觸時(shí)，滋養(yǎng)體可以分泌出阿米巴穿孔素，使得靶細(xì)胞表面形成離子通道，破壞靶細(xì)胞膜屏障，使靶細(xì)胞或組織發(fā)生損害［26-27］。早在1982 年，科學(xué)家就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)阿米巴穿孔素，并對(duì)其功能進(jìn)行研究［28］。1992 年，Leippe等［29］利用阿米巴穿孔素A 的互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）序列，推導(dǎo)出阿米巴穿孔素A 的氨基酸序列（即一級(jí)結(jié)構(gòu)）是由77 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的，其中包括6 個(gè)半胱氨酸殘基。同年，科學(xué)家利用圓二色光譜測定出阿米巴穿孔素的二級(jí)結(jié)構(gòu)為全α-螺旋構(gòu)象。2004年，Hecht 等［27］利用核磁共振波譜學(xué)方法解析了阿米巴穿孔素A 的三級(jí)結(jié)構(gòu)，證實(shí)了此前推測阿米巴穿孔素A 的全α-螺旋構(gòu)象（圖1A），并且通過分子篩色譜、化學(xué)修飾和蛋白質(zhì)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)證明了阿米巴穿孔素的激活與pH 依賴的蛋白質(zhì)二聚化有關(guān)。

阿米巴穿孔素是水溶性蛋白質(zhì)，但同時(shí)也可以分散在細(xì)胞膜上即具有一定的脂溶性。在阿米巴穿孔素A 的三維結(jié)構(gòu)中觀察到該蛋白質(zhì)的一側(cè)是親水性的，另一側(cè)是疏水性的，具有兩親性。阿米巴滋養(yǎng)體可以通過調(diào)節(jié)酸性物質(zhì)的分泌調(diào)控穿孔素的活性。在酸性環(huán)境下，阿米巴穿孔素通過靜電作用發(fā)生二聚化，親水結(jié)構(gòu)聚集在內(nèi)側(cè)，疏水結(jié)構(gòu)暴露在外側(cè)，形成整體疏水性的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1B、C），使穿孔素可以更好地分布在靶細(xì)胞膜上，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞膜出現(xiàn)寡聚孔。阿米巴穿孔素的二聚體活化機(jī)制提示，與阿米巴穿孔素結(jié)構(gòu)類似的可溶性球狀蛋白質(zhì)可能具有破壞細(xì)胞膜，從而殺死細(xì)菌和真核細(xì)胞的作用［27］。

CP 抑制劑 CP 是Eh另一種重要的毒力因子。Eh胞內(nèi)含有至少50 種CP，其中最主要的是EhCP1、EhCP2 和EhCP5。CP 最初表達(dá)為無活性的酶原，其活性由阿米巴精密的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，其中包含Chagasin 樣抑制劑家族的EhCP 抑制劑（Entamoeba histolyticainhibitor forcysteine proteases，EhICP），即EhICP1 和EhICP2［30-33］。2011年，Casados-Vázquez 等［34］利用X 射線衍射技術(shù)解析出EhICP2 的晶體結(jié)構(gòu)（圖2A）。

圖2 EhICP2 的三維晶體結(jié)構(gòu)及其與半胱氨酸蛋白酶相互作用的模型Fig 2 The crystal structure of EhICP2 and its interaction model with a cysteine protease（Papain）

EhICP2 的空間結(jié)構(gòu)由8 條β 鏈構(gòu)成的2 個(gè)β-折疊片組成，與免疫球蛋白的折疊方式非常相似。EhICP2 中含有致密的疏水核心集團(tuán)，起到穩(wěn)定整體結(jié)構(gòu)的作用（圖2A、B）。BC、DE 和FG 三個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有一定的柔性，其功能主要與蛋白質(zhì)間相互作用有關(guān)，其中BC 環(huán)中蘇氨酸和絲氨酸殘基可以與CP 活性中心即催化三聯(lián)體（His-159，Asn-175 和Cys-25）中的半胱氨酸和組氨酸殘基相互作用，從而抑制CP 活性，而DE 和FG 環(huán)在EhICP2 結(jié)合CP 時(shí)可轉(zhuǎn)變構(gòu)象，起到穩(wěn)定整體結(jié)構(gòu)的作用（圖2C、D）［34］。CP 抑制劑EhICP2 晶體結(jié)構(gòu)的解析，有助于在原子水平上理解Eh中CP 的活性調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)抑制蟲體CP 藥物奠定了基礎(chǔ)。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)在Eh 研究中的發(fā)展前景目前在Eh致病過程中起重要作用的Gal/GalNAc 凝集素、CP 和過氧化物氧化還原酶等毒力因子蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)尚未得到解析［2，35-37］，未來對(duì)這些毒力因子三維結(jié)構(gòu)的解析可能會(huì)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)在Eh研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

以EhGal/GalNAc 凝集素為例。研究表明該凝集素包含170 000 重鏈亞單位（heavy subunit of Gal/GalNAc lectin，hgl）、150 000 中間亞單位（intermediate subunit of Gal/GalNAc lectin，igl）和35/31 kDa 輕鏈亞單位（light subunit of Gal/GalNAc lectin，lgl），其中hgl是跨膜蛋白，igl和lgl通過糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨定在細(xì)胞膜胞外側(cè)（圖3）。已知hgl 由于含有特異性的糖類識(shí)別位點(diǎn)（carbohydrate recognition domain，CRD）而具有重要作用，而igl 和lgl 在阿米巴黏附和入侵過程中發(fā)揮的作用尚不明確。另外，Gal/GalNAc 凝集素富含半胱氨酸以及由半胱氨酸殘基構(gòu)成的CXXC 或CXC 基序（“C”為半胱氨酸殘基，“X”為任意氨基酸殘基），研究表明這一特點(diǎn)與滋養(yǎng)體吞噬宿主細(xì)胞和導(dǎo)致宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)［38-41］。由于Gal/GalNAc 凝集素的三維結(jié)構(gòu)尚未解析，特別是CXXC 或CXC 基序的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)尚不清楚，Gal/GalNAc 凝集素特別是igl 和lgl 兩個(gè)亞單位在致病過程中所扮演的角色難以從原子水平上進(jìn)行推測和理解。Eh中Gal/GalNAc 凝集素定位于細(xì)胞膜上，屬于膜蛋白，不易結(jié)晶，難以通過X 射線晶體學(xué)方法解析其結(jié)構(gòu)，預(yù)計(jì)將來可能通過冷凍電鏡技術(shù)獲得其三維結(jié)構(gòu)。在Gal/GalNAc 凝集素中，hgl 和lgl 通過共價(jià)鍵連接形成分子量為260 000 的異源二聚體，再與igl 通過非共價(jià)鍵的方式結(jié)合。實(shí)驗(yàn)條件下蛋白質(zhì)間的非共價(jià)鍵不易形成，因此可能需要分別解析hgl-lgl 異源二聚體與igl 的三維結(jié)構(gòu)，再對(duì)Gal/GalNAc 凝集素整體的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

圖3 Gal/GalNAc 凝集素結(jié)構(gòu)模型Fig 3 Schematic structural model of Gal/GalNAc lectin

結(jié)語在Eh致病機(jī)制研究中，結(jié)構(gòu)生物學(xué)作為一種新興的生物學(xué)研究方法，已經(jīng)得到一定程度的應(yīng)用。近些年，越來越多重要的蟲體酶、毒力因子和致病蛋白的三維結(jié)構(gòu)被解析，對(duì)于Eh致病機(jī)制的理解不斷深入，并為抗蟲藥物和潛在疫苗的研發(fā)提供了必要條件。但目前Eh中還有很多重要蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)尚待研究，如與阿米巴對(duì)宿主組織和細(xì)胞黏附相關(guān)的Gal/GalNAc 凝集素等。另一方面，冷凍電鏡技術(shù)尚未在Eh研究領(lǐng)域得到成功的運(yùn)用。隨著技術(shù)的進(jìn)步，特別是冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法將更加深入地運(yùn)用到Eh致病機(jī)制的研究當(dāng)中。