CAPN3基因突變導致的Calpainopathy的發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)和實驗室檢測研究進展

張慧卿，路延朋，宋學琴

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

Calpainopathy是由Calpain 3基因(CAPN3)突變導致的calpain3蛋白缺失、減少或功能喪失，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)的遺傳性肌病。calpain3蛋白是骨骼肌特有的鈣依賴非溶酶體蛋白酶，其缺失減少或功能喪失可導致肩帶肌、盆帶肌和四肢近端肌肉進行性肌無力和肌萎縮，屬于肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(Limbgirdle muscular dystrophy, LGMD)范疇。根據(jù)遺傳方式LGMD可分為LGMD1型(呈常染色體顯性遺傳方式)和LGMD2型(呈常染色體隱性遺傳方式)，根據(jù)累及突變基因類型再分為多種亞型，迄今已發(fā)現(xiàn)超過40種基因突變。CAPN3基因突變導致的Calpainopathy 為LGMD2A和LGMD1I, 其遺傳方式既有常染色體顯性遺傳，也有隱性遺傳；臨床表現(xiàn)輕重不一，輕者僅表現(xiàn)為高肌酸激酶血癥，重者嚴重影響運動能力需坐輪椅；病理改變可為正常、嗜酸粒細胞浸潤到肌營養(yǎng)不良樣改變等各不相同。本文就Calpainopathy的發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)和實驗室檢測進行綜述。

1 發(fā)病機制

Calpainopathy是由CAPN3基因突變所致，其發(fā)病機制尚不完全清楚，但目前研究使得我們在基因和蛋白水平有一定的了解。CAPN3基因于1989年被克隆，位于15q15-q21，包含24個外顯子，全長40 kb，編碼由821個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為94 k的calpain3蛋白[1]。calpain3蛋白屬于calpains家族，Calpains蛋白是細胞內(nèi)一種鈣依賴非溶酶體的中性半胱氨酸蛋白酶。Calpains家族中研究較多的是calpain1和calpain2，又稱為μ-calpain和m-calpain，均為異二聚體，由兩個亞基組成：一個大亞基(80 kDa)和一個小亞基(28 kDa)[1-2]，這些蛋白廣泛存在于身體的各個組織中。Calpain3主要是在肌肉中表達，雖然也可在晶狀體、肝臟、大腦和心肌中檢測到，但濃度非常低。Calpain3與caplain1、caplain2的大亞基分別有54%和51%的同源序列，三者均具有共同的特性，即鈣依賴的酶活性和中性pH中最大酶活性等。Calpain3蛋白可分為4個結構域(Ⅰ-Ⅳ區(qū))，其中Ⅱ和Ⅳ區(qū)為具有重要功能的半胱氨酸蛋白酶和鈣離子結合區(qū)，而且這兩區(qū)與其他calpain蛋白具有同源序列。Calpain3蛋白的Ⅱ區(qū)為保守的鈣蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶(Calpain-type cysteine Protease conserved, CysPc)結構域，包括兩個蛋白酶核心結構域(Protease Core subdomains)PC1和PC2，Ⅱ區(qū)與蛋白酶的活性有關。Ⅳ區(qū)為PEF(Penta EF hand)結構域，主要為與鈣離子結合區(qū)域，并幫助calpain3同源二聚化。Ⅲ區(qū)為鈣蛋白酶型β夾層(Calpain-type Beta-Sandwich, CBSW)功能域，對calpain3激活時所需要的結構改變很重要。除此之外，calpain3還具備3個特有的插入序列：N末端有20～30個氨基酸(N-terminus NS)；位于PC2的插入序列1(insertion sequence 1, IS1)；位于CBSW和PEF之間的插入序列2(insertion sequence2, IS2)，這幾個插入序列賦予calpain3蛋白獨特的自我催化作用[3-6]。

Calpain3蛋白是骨骼肌細胞內(nèi)的鈣依賴非溶酶體的中性半胱氨酸蛋白酶，其激活需要鈣離子釋放[7]，需要的鈣離子濃度相比calpain1和calpain2要低。Calpain3蛋白作為蛋白酶通過自我溶解而激活，在肌細胞內(nèi)的肌聯(lián)蛋白(肌聯(lián)蛋白在M線和I帶具有幾個calpain3結合位點)之間發(fā)揮作用，其功能包括組裝和重塑肌節(jié)中的收縮蛋白、調(diào)控肌漿網(wǎng)中的鈣離子外流、肌膜修復和肌肉再生等[1]。

Calpainopathy的發(fā)病機制尚不完全清楚，但推測有幾種可能：① Calpain3蛋白是骨骼肌三聯(lián)管的組成成分之一，其活性下降可導致鈣離子的釋放異常；②Calpain3蛋白參與組成dysferlin蛋白復合體，在部分LGMD2B(dysferlinopathy)患者中可見繼發(fā)的calpain3蛋白缺失也證實了這一點，Calpain3蛋白可能會影響肌膜的修復[8]；③CAPN3基因錯義突變不僅可以影響calpain3蛋白的酶活性，還可影響蛋白分子之間的結合，從而影響蛋白的完整性；④ Calpain3蛋白在體內(nèi)結合到肌聯(lián)蛋白上，肌聯(lián)蛋白具有調(diào)節(jié)calpain3蛋白活性和抑制其出現(xiàn)自我降解的作用[1, 9]。CAPN3基因突變(比如R448H或D705G)并沒有影響Calpain3的酶活性，但影響了該蛋白與肌聯(lián)蛋白的結合。和其他大部分肢帶型肌營養(yǎng)不良(致病基因編碼細胞結構蛋白)不同的是CAPN3基因編碼的是一種蛋白水解酶，因此對于任何影響到該酶活性、數(shù)量和酶結構完整性的因素都可能致病。

2 臨床表現(xiàn)

Calpainopathy可導致肩帶肌、盆帶肌和四肢近端肌肉進行性肌無力和肌萎縮，屬于肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(LGMD)范疇。LGMD為常見的遺傳性肌營養(yǎng)不良類型，發(fā)病率為4/100 000～7/100 000，LGMD呈常染色體顯性遺傳者稱為1型, 呈常染色體隱性遺傳方式者稱為2型，再根據(jù)突變基因分為多種亞型，迄今已發(fā)現(xiàn)超過40種基因突變。CAPN3基因突變導致的Calpainopathy包括LGMD2A和LGMD1I, 前者為常染色體隱性遺傳，后者為常染色體顯性遺傳方式。除遺傳方式不同、LGMD1 I癥狀較輕且少見之外，二者臨床表現(xiàn)類似。LGMD2A相對常見，有關它的報道相比LGMD1I較多，一般文獻中提及的Calpainopathy多為LGMD2A亞型。2018年歐洲神經(jīng)肌病中心建議新的LGMD分類和命名，如LGMD2A被稱為LGMD R1 calpain3-related[10]。

LGMD2A為常染色體隱性遺傳，其發(fā)病率有地理區(qū)域差異，不同國家報道LGMD2A占LGMD的比率從10%～80%不等，在歐洲為最常見的LGMD類型，但在亞洲特別是我國病例數(shù)相對較少見。臨床表現(xiàn)與其他LGMD類型相類似，主要為肩帶肌、盆帶肌和四肢近端肌肉進行性肌無力和肌萎縮，但有臨床異質(zhì)性，臨床表現(xiàn)多樣且輕重不一，輕者僅表現(xiàn)為高肌酸激酶血癥或假性代謝性肌病，重者嚴重影響運動能力需坐輪椅。常染色體顯性遺傳者(LGMD1I)的臨床表現(xiàn)與LGMD2A相似，但發(fā)病年齡可延遲20年左右，無力癥狀相對較輕。

肢帶型肌營養(yǎng)不良2A(LGMD2A)的發(fā)病率大約為1/100000。典型的臨床表現(xiàn)為選擇性、對稱性的近端肢體(骨盆帶肌、肩胛帶肌、軀干肌)無力和萎縮，常有關節(jié)攣縮和翼狀肩等。患者發(fā)病年齡2～55歲，平均18歲左右，初起為步態(tài)的異常，上樓困難，舉物費力，病情緩慢進展，逐漸出現(xiàn)行走費力，多在發(fā)病后20年左右失去行走能力。腓腸肌肥大少見，面肌和頸肌通常不受累，這有助于LGMD2A與面肩肱型肌營養(yǎng)不良的鑒別?？沙霈F(xiàn)關節(jié)攣縮，尤其是跟腱攣縮，也可出現(xiàn)髖關節(jié)、膝關節(jié)和肘關節(jié)攣縮，常出現(xiàn)在疾病的早期。心肌受累少見[11]；膈肌受累往往出現(xiàn)在疾病的后期，偶見報道疾病早期即出現(xiàn)呼吸功能衰竭，需要無創(chuàng)呼吸機輔助通氣[12]。有幾個臨床線索提示該病[13]：①早期伸膝、屈髖和大腿內(nèi)收肌群容易出現(xiàn)無力，肌肉核磁顯示大腿內(nèi)收肌群和股后肌群易受累；②腓腸肌早期出現(xiàn)脂肪浸潤；③20%出現(xiàn)翼狀肩胛；④50%出現(xiàn)關節(jié)攣縮，踝關節(jié)、髖關節(jié)、膝關節(jié)和肘關節(jié)易受累；⑤肺功能和心臟常不受累。

該病臨床異質(zhì)性較大，不同患者發(fā)病年齡、病情嚴重程度和疾病進展等存在差異。部分患者缺乏明顯的肌無力肌萎縮癥狀，僅表現(xiàn)為無癥狀的高肌酸激酶血癥(Asymptomatic hyperCKemia)、假性代謝性肌病(Pseudometabolic myopathy)或嗜酸性粒細胞肌炎(Eosinophilic myositis)[14-15]等。

高肌酸激酶血癥是指無任何臨床癥狀，僅在查體時發(fā)現(xiàn)血清肌酸激酶升高，多為正常參考區(qū)間的5～80倍，肌酸激酶水平可有波動起伏。無癥狀的高肌酸激酶血癥也可見于其他遺傳性肌病中如dysferlinopathy，因此對于臨床上出現(xiàn)無癥狀的高肌酸激酶血癥應給予重視。

假性代謝性肌病通常出現(xiàn)在兒童和年輕患者中，患者可能一直保持無癥狀階段很長時間，也可表現(xiàn)為無力、肌痛、運動不耐受或輕微的近端肌無力，實驗室檢查可見血乳酸增高及肌酶增高。

嗜酸性粒細胞肌炎主要發(fā)生在年輕人，伴或不伴肢體無力，肌酶升高，可見外周血嗜酸粒細胞增高，肌肉病理可見嗜酸性粒細胞浸潤；嗜酸粒細胞浸潤可能是LGMD2A臨床前階段，因此在肌肉活檢顯示嗜酸性細胞浸潤的病人中應該考慮到該病的可能。

該病臨床異質(zhì)性較大，但與基因突變位點和突變類型缺乏明確的相關性，相比錯義突變，無義突變似乎更易出現(xiàn)肌無力，臨床表型較嚴重[16-17]。即使相同的基因突變在同一個家系，其臨床表型可差異較大；錯義突變引起的臨床表現(xiàn)難以預測。部分患者在懷孕過程中可病情惡化[18]。

3 肌肉病理

因臨床表型不同，病理表現(xiàn)也輕重不一，經(jīng)基因證實的Calpainopathy患者的肌肉病理可表現(xiàn)為正常的病理、只有個別局灶壞死、明顯的肌營養(yǎng)不良樣改變或嗜酸性粒細胞浸潤的肌源性損害等。

LGMD2A的肌肉組織病理檢查中，大多數(shù)患者骨骼肌呈肌營養(yǎng)不良樣病理改變，即肌纖維肥大、萎縮、不同程度壞死再生伴結締組織增生。除此之外可見核內(nèi)移現(xiàn)象、高收縮纖維、旋渦狀纖維和分葉纖維。分葉纖維為calpainopathy最顯著或典型的病理改變，約見于67%的LGMD2A患者，但分葉纖維還可見于杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)、LGMD2D(又稱為α-sarcoglycanopathy)和面肩肱型肌營養(yǎng)不良患者中，但他們的存在與這些疾病的嚴重程度并不相關；分葉纖維更易在兒科患者中觀察到，提示早期的病理變化。Fanin等[19]發(fā)現(xiàn)男性肌纖維較女性明顯減少；肌纖維的再生在LGMD2A病人的病理中相對于其他類型的LGMD較少出現(xiàn)，比例平均小于3%，分析原因可能為calpain3蛋白的丟失影響了肌纖維的再生過程[20]。

4 蛋白印跡

通過免疫印跡分析肌肉組織中calpain3蛋白減少或缺失是診斷calpainopathy的重要實驗室依據(jù)，但這種方法會產(chǎn)生假陰性和假陽性結果[21]，需結合基因檢測。在20%的LGMD2A患者中，蛋白印跡檢查發(fā)現(xiàn)caplain3蛋白量表達正常，但其功能喪失或減弱，這會導致假陰性結果。caplain3是一種細胞蛋白酶，它在體外因自溶作用極易降解，且降解速度較快[1]，因此對其檢測難度較大；另外其他類型的LGMD中由于相應的蛋白缺失，例如LGMD2B型的dysferlin蛋白[21]、LGMD2J型的肌聯(lián)蛋白(titin)[22]、LGMD2I型的fukutin相關蛋白等可能會導致caplain3蛋白的繼發(fā)性減少或缺失，從而導致假陽性結果[7]。免疫印跡分析結果顯示的caplain3蛋白數(shù)量和該病的嚴重程度沒有關聯(lián)。

5 基因檢測

LGMD2A是第一個明確基因及其分子生物學特征的肢帶型肌營養(yǎng)不良，迄今在萊頓肌營養(yǎng)不良數(shù)據(jù)庫(leiden muscular dystrophy database, http://www.dmd.nl/capn3_home.html)中，關于calpainopathy的基因突變已經(jīng)超過500多種[23]，包括錯義突變、無義突變、移碼突變、小的缺失、大的缺失等多種突變類型，其中LGMD2A中最常見的突變類型是錯義突變(60%左右)且多為復合雜合突變。攜帶兩種無義突變患者常發(fā)病年齡早，進展快，有嚴重的臨床表型。攜帶錯義突變患者的臨床表型不可預測，可能與突變位點處于蛋白不同重要程度的功能區(qū)有關[24]。錯義突變中外顯子11可能是突變熱點；若不論突變類型，外顯子21可能是一個突變熱點[25]。文獻報道的熱點突變分布多位于Calpain3的II區(qū)和Ⅳ區(qū)，這兩個區(qū)分別為半胱氨酸蛋白酶和鈣離子集合區(qū)結構域，在鈣離子依賴的酶活化過程中起關鍵作用。導致功能缺失的錯義突變?nèi)鏿.Thr184Met and p.Gly222Arg，p.Arg489Gln, p.Arg490Gln and p.Arg490Trp，p.Gly496Arg and p.Ser606Leu等位于蛋白酶功能域II區(qū)和Ⅳ區(qū)[26]。最近Martinez-Thompson等[27]報道了CAPN3基因突變可能與顯性遺傳性肌病有關。要注意calpainopathy臨床表型具有高度異質(zhì)性，即使有相同基因突變的同胞兄弟姐妹亦可能有不同的臨床表現(xiàn)，所以不能通過基因突變類型和位點判斷患者病情嚴重程度和預后。雖然目前基因檢測是診斷遺傳性肌病的“金標準”，且檢測方法也取得顯著的進步，但這不是絕對的，因為某些區(qū)域的突變?nèi)鐔幼?、?nèi)含子和大的缺失等不能被檢測到，目前發(fā)現(xiàn)有10%的calpainopathy患者基因檢測僅發(fā)現(xiàn)一個等位基因突變，推測可能存在一些目前技術尚不能檢測到的突變。

6 小結

本文針對CAPN3基因突變引起Calpainopathy的發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)與實驗室檢測進行綜述。Calpainopathy的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性大，發(fā)病機制復雜，尚不完全清楚。目前診斷方法中基因檢測費用昂貴，蛋白印跡缺乏一定的敏感性及特異性。但隨著研究的深入，相信不久的將來能提高Calpainopathy的診斷率；深入了解其發(fā)病機制，精準基因治療會有更廣闊的前景。