華法林抗凝之外作用的研究進展△

彭曉鵬，黃勁松，周成斌，吳 敏

［1.廣東省心血管病研究所廣東省華南結(jié)構(gòu)性心臟病重點實驗室廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080；2.東莞康華醫(yī)院心血管中心心外科，廣東東莞 523000）

提要：華法林是目前世界上使用最廣泛的抗凝血藥物。其抗凝血活性基于對正常血液凝固所必需的多種維生素K 依賴性（vitamin K-dependent，VKD）凝血因子合成的抑制作用。華法林還可影響與止血無關(guān)的VKD 蛋白的合成，其中包括某些促進骨骼生長和血管鈣化的蛋白。華法林抗腫瘤的作用部分源于其抗血栓的能力，另一部分則源于其對非止血性VKD 蛋白以及與VKD 蛋白無關(guān)的其他蛋白質(zhì)功能的影響。華法林的炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用表明了該藥物在疾病的生理和病理過程中具有更廣泛的前景。本文根據(jù)已發(fā)表的數(shù)據(jù)概述了華法林除抗凝血之外的生物學(xué)作用。

華法林上市60 多年來，因其具有抗凝和溶栓雙重調(diào)節(jié)作用、療效顯著、服用方便、價格低廉等特點而廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療和預(yù)防，盡管新型抗凝藥物研發(fā)取得了重要的進展，并已經(jīng)或即將上市，但是華法林作為最早的口服抗凝藥物之一仍是需要長期抗凝治療患者的最常用藥物之一。但在此藥的既往使用中，人們發(fā)現(xiàn)其不僅僅擁有抗凝血的能力，更有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等其他鮮為人知的藥理作用。本文通過華法林的抗凝血作用及最新對華法林病理、生理作用的研究進展，向讀者介紹華法林促進骨骼生長和血管鈣化、抗腫瘤、炎癥/免疫調(diào)節(jié)作用，表明華法林在多種疾病的生理和病理過程中具有更廣泛的應(yīng)用前景。

1 華法林的抗凝血作用

華法林是香豆素類抗凝劑的一種，在肝臟微粒體內(nèi)通過抑制維生素K 環(huán)氧化物還原酶的活性從而阻斷還原型維生素K（維生素KH2）的生成，進而抑制維生素K 依賴性（vitamin K-dependent，VKD）凝血因子的γ-羧基化作用。VKD 凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的氨基末端谷氨酸可在維生素K 的促使下羧基化轉(zhuǎn)變成γ-羧基谷氨酸，從而促進VKD 凝血因子結(jié)合到磷脂表面，加速血液凝固。因此，華法林僅能在體內(nèi)有活性的凝血因子消耗后才能有效，起效后作用和維持時間亦較長。

華法林已使用60 余年，至今仍是世界上最廣泛使用的抗凝藥物［1］。據(jù)估計，美國有3 000 多萬處方使用華法林［2］，英國超過1%的人口使用華法林［1］。由于華法林具有抗凝作用并能在腸道中有效（完全和快速）吸收，它被證明是預(yù)防和治療靜脈血栓、肺動脈和全身栓塞最廣泛使用的藥物［3］。華法林治療窗窄、劑量變異性大、易與其他藥物及食物相互作用、需要實驗室監(jiān)測等特點促使研究人員尋找副作用范圍更窄、治療范圍更廣的替代藥物［4］。由于大多數(shù)瓣膜手術(shù)患者術(shù)后不需要長期口服抗凝治療，對伴隨心房顫動的患者使用新型抗凝藥來管理是十分合理的選擇。但對于因風(fēng)濕性二尖瓣狹窄而進行生物二尖瓣置換并伴有心房顫動的患者是一個例外。雖然患者二尖瓣血流在二尖瓣置換術(shù)后正常化，但其心房仍很大且嚴重病變。因此，這些患者中維生素K 依賴性VKD 可能是優(yōu)于新型抗凝藥的選擇，但這需要更多臨床數(shù)據(jù)證實［41］。

2 華法林和非止血維生素K 依賴性蛋白的關(guān)系

除了阻斷VKD 蛋白在肝臟中的羧基化外，華法林還影響外周血的羧基化。以這種方式，這種維生素K 拮抗劑對調(diào)節(jié)骨生長和鈣化的過程所需的VKD 蛋白［胃泌素釋放肽重組蛋白（recombinant gastrin releasing peptide，GRP）、骨鈣素（bone glaprotein，BGP）、骨鈣素重組蛋白（recombinant osteocalcin，OC）、基質(zhì)Gla 蛋白（matrix Gla protein，MGP）］的外周（肝外）生產(chǎn)的催化速率產(chǎn)生影響［5］；Hara 等［6］研究數(shù)據(jù)顯示抑制華法林的醛羧化作用對肝臟的代謝過程沒有影響，提示外周和肝臟VKD 蛋白的敏感性與前VKD 蛋白的敏感性不同。

大劑量華法林（7.7 mg·100 g-1·d-1）的攝入可導(dǎo)致骨礦化減少［7］。60～80 歲原發(fā)性高血壓（高血壓）患者長期（至少12 個月）使用華法林對骨代謝指標影響的測量顯示，低羧化骨鈣素（ucOC）及核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）受體激活物水平顯著升高［8］，提示這些患者的鈣化和骨質(zhì)疏松增加。雖然也有研究表明，這種香豆素衍生物的使用和骨骼的不良發(fā)育之間沒有關(guān)系，但長時間服用華法林對成年人和兒童骨骼的均有負面影響（某些骨骼部位的骨密度的損失）［9］。妊娠期服用華法林而出現(xiàn)相關(guān)的發(fā)育缺陷（“華法林胚胎病”）、骨骼異常被認為是由于華法林對在軟骨內(nèi)骨化前存在的功能性MGP 的生成的影響［10］。華法林所致的胚胎病也歸因于其對骨鈣素的作用［11］。

MGP 是血管鈣化的主要抑制劑之一，當(dāng)羧化成cMGP時，它通過與鈣晶體直接結(jié)合抑制晶體生長的方式抑制抗礦物質(zhì)活性，因此，華法林抑制MGP 羧化的途徑被認為是動脈鈣化的基礎(chǔ)機制之一。長期（5～12 周）暴露于高劑量華法林（100 mg/kg）的大鼠在多個組織中發(fā)現(xiàn)動脈鈣化，而給予高劑量維生素K 則減輕血管鈣化［12］。大劑量華法林（15 mg/100 g）對大鼠血管鈣化的影響是呈年齡/生長依賴性［13］。對已建立的動脈粥樣硬化的ApoE-/-小鼠模型施用華法林還表明，華法林治療可加速血管鈣化以及斑塊不穩(wěn)定［14］。維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1（vitamin K epoxide reductase complex 1，VKORC1）基因多態(tài)性不僅對華法林治療反應(yīng)的變異性有貢獻，而且對血管疾病風(fēng)險的差異也有貢獻；使用華法林治療要注意血管鈣化的風(fēng)險與出血風(fēng)險并存的問題［15］。

除了通過抑制MGP 介導(dǎo)的血管鈣化外，目前Beazley等［16］研究還提示谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶2（transglutaminase，TG2）/catenin 通路的激活是華法林誘導(dǎo)血管鈣化的新機制。體外培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞標明TG2/-連環(huán)素軸參與華法林所致的鈣化。TG2 活性是華法林誘導(dǎo)-連環(huán)素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化以及鈣礦物沉積所必需的。低濃度的華法林（10 mol/L）與該藥的治療血漿濃度相對應(yīng)，對VSMCs 中羧基（Gla）MGP 表達沒有影響，而高劑量華法林（100 mol/L）則抑制了GlaMGP 的形成。因此推測華法林激活VSMC 中的連環(huán)蛋白是通過增強的血管骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號（此通常被羧化MGP 蛋白抑制）實現(xiàn)的。

3 華法林的抗腫瘤活性

Edwards 等［17］研究表明香豆素并沒有遺傳毒性。包括華法林在內(nèi)的抗凝藥物是通過多方面影響腫瘤細胞生理功能而實現(xiàn)其抗腫瘤能力的。O′Rorke 等［18］研究表明，華法林與肺、乳腺、結(jié)直腸和前列腺腫瘤患者的病死率之間缺乏關(guān)聯(lián)的薄弱環(huán)節(jié)。華法林的使用（診斷前或診斷后使用）、治療持續(xù)時間、癌癥類型和階段的不同可能是造成上述研究數(shù)據(jù)差異的原因。華法林和聯(lián)合化療使得無法手術(shù)的胰腺癌患者中位生存時間延長［19］。這種作用在高危疾病患者中最明顯，且無明顯的轉(zhuǎn)移證據(jù)，提示華法林可能具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。華法林誘導(dǎo)的活性氧被認為是細胞毒性的主要原因，但某些腫瘤的轉(zhuǎn)移能力的降低不能歸因于華法林的細胞毒性作用。體外實驗證明［20］，大劑量華法林（5×10-4mol/L 和1×10-3mol/L）可抑制生長，促進紅白血病K562 細胞和HL-60 細胞的輻射毒性；小劑量華法林（0.5～1 mg/L）也能抑制AXL 依賴性腫瘤細胞遷移和侵襲，增加腫瘤細胞凋亡和對化療的敏感性。

最近的研究顯示蛋白S 參與口腔鱗癌細胞（oral squamous cell，OSCC）的體外存活、增殖和遷移、小鼠腫瘤生長以及腫瘤細胞表達AXL［21］。由于華法林抑制蛋白S 的羧化，推測華法林的抗腫瘤作用可能與抑制該止血蛋白的非止血活性有關(guān)。在華法林治療肺癌細胞系的體外和動物模型中，來自肺癌患者的自然殺傷細胞活性的增加表明華法林具有免疫刺激作用。Paolino 等［22-23］最近研究揭示了自然殺傷細胞介導(dǎo)的華法林抗腫瘤作用的可能分子機制：對荷黑色素瘤小鼠給予華法林后，自然殺傷細胞的活性增強，肺部和遠端器官的腫瘤轉(zhuǎn)移減少。華法林抗腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)是消除自然殺傷細胞的活性的抑制（通常由TAM 受體和E3 泛素連接酶Cbl-b 介導(dǎo)）。華法林通過TAM/Cbl-b 途徑促進了自然殺傷細胞細胞的釋放，并增強了它們對原型靶細胞的細胞毒性。因為這兩種作用均是在低濃度的華法林（不產(chǎn)生抗凝作用）被注意到的，所以作者認為這與華法林的抗凝機制無關(guān)。大量體外和體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)表明，其他抗凝藥物，特別是低分子量肝素（low-molecular-weight heparins，LMWHs）同樣具有減少腫瘤負擔(dān)和轉(zhuǎn)移潛能的能力，在改善癌癥患者生存方面可能更安全有效［24］。Peltier 等［25］最近研究表明，華法林的糖基化降低了抗VKOR 活性，同時增加了體外對幾種癌細胞系的細胞毒性。

4 華法林在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中的作用

Saminathan 等［26］研究顯示大劑量華法林治療的患者中IL-6 的濃度增加。在華法林相關(guān)性腎病（Warfarinrelated nephropathy，WRN）的急性腎損傷研究中也同樣發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象［27］。血紅素毒性和血紅素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認為是急性腎損傷的主要機制，這其中就包括抗凝劑相關(guān)的急性腎損傷［28］。血紅蛋白和血紅素在腎小管細胞中積累可導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生、細胞損傷、促炎性因子和促纖維化細胞因子釋放。使用大鼠腎單位減少（5/6 腎切除術(shù)）和華法林過度抗凝模型作為華法林相關(guān)腎病模型的研究發(fā)現(xiàn)［29］，可通過使用抗氧劑N-乙酰半胱氨酸（antioxidant in N-acetylcysteine，NAC）實現(xiàn)對急性腎損傷的預(yù)防［30］。氧化應(yīng)激還被認為在華法林誘導(dǎo)的高血壓中起作用［31］，因為用華法林聯(lián)合NAC 治療的大鼠收縮壓增加較慢，盡管這種作用僅在華法林誘導(dǎo)的高血壓的早期（一周）可見。然而，通過補充維生素K 預(yù)防華法林誘導(dǎo)的大鼠收縮壓升高意味著血管內(nèi)皮細胞（骨鈣素、MGP 或GAS6）上有表達的VKD 蛋白的參與?？鼓嚓P(guān)腎病的另一個機制是止血蛋白凝血酶和蛋白C 的減少［32］。華法林誘導(dǎo)的凝血酶耗竭致使內(nèi)皮屏障遭到破壞，導(dǎo)致腎小球出血。因此蛋白C 的減少和通過內(nèi)皮蛋白C 受體的信號傳導(dǎo)，也是抗凝劑誘導(dǎo)的急性腎損傷的另一機制。

華法林治療所產(chǎn)生的并發(fā)癥與嗜酸性粒細胞炎［33］、嗜酸性胸膜炎［34］和過敏性間質(zhì)腎炎、真細胞碎屑性血管炎、伴有血管改變和中性粒細胞白細胞和單核細胞浸潤［35］等有關(guān)，表明華法林具有誘發(fā)過敏性炎癥反應(yīng)的潛能。在動物實驗和體外實驗中也觀察到華法林的免疫刺激和免疫抑制作用。使大鼠口服30 d 與人類治療期間的平均劑量相同的華法林劑量，大鼠表現(xiàn)出腸道炎癥，其特點是白細胞浸潤、組織損傷和促炎細胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）的濃度增加［36］。從腸勻漿中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的下降和丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度的升高來判斷，氧化應(yīng)激可能是腸道組織損傷的原因?？诜A法林對兩種大鼠菌株的腸道免疫反應(yīng)性具有不同的影響，表明了華法林的免疫調(diào)節(jié)作用中基于遺傳的差異的重要性［37］。大鼠口服華法林30 d后，觀察到皮膚炎性反應(yīng)細胞因子（TNF、IL-1 和IL-6）和表皮細胞對接觸性過敏原的反應(yīng)［38］，表明口服華法林具有調(diào)節(jié)皮膚天然免疫的潛力。這些數(shù)據(jù)證實了華法林的局部應(yīng)用具有免疫調(diào)節(jié)潛力，其表現(xiàn)為肥大細胞的激活、刺激表皮細胞增殖和皮膚組織炎性細胞因子增多（TNF 和IL-1）［39］。給大鼠口服與人治療期間劑量相當(dāng)?shù)娜A法林30 d 后，觀察到期間全身炎癥反應(yīng)增加（血漿IL-6濃度以及主要大鼠急性期蛋白、觸珠蛋白濃度增加）［40］，這可能是由于華法林局部（腸、肝和皮膚）促炎作用伴隨有全身水平的炎癥改變。

5 結(jié)論

盡管存在明顯的副作用，但華法林仍是目前使用最廣泛的口服抗凝劑之一［41］。通過抑制與凝血無關(guān)的VKD 蛋白的生成，這種維生素K 拮抗劑還影響除止血以外的生理過程，這表明該藥物在組織和細胞生物學(xué)方面仍有較大的作用潛力。不參與止血的VKD 蛋白在生理和病理過程中的作用尚待進一步研究，預(yù)期還可能發(fā)現(xiàn)新的功能。因此，應(yīng)時刻保持對華法林病理生理的密切關(guān)注。