新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)及其進(jìn)展*

李晨希，趙呈雪，鮑金鳳，康海全，馬萍,，顧兵,(. 徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，徐州市實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 004；. 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州 006)

冠狀病毒(coronaviruse, CoV)是一類嚴(yán)重危害人類健康的病原微生物，目前發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒有十幾種。該類病毒在進(jìn)化過程中極易發(fā)生基因重組和變異，呈現(xiàn)遺傳多樣性，新亞型及新的冠狀病毒在此過程中不斷出現(xiàn)。21世紀(jì)以來，冠狀病毒在全球共引起3次疫情：2002年在中國廣東省首次暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndromes, SARS)，2012年在沙特阿拉伯暴發(fā)的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)以及2019年在中國湖北武漢暴發(fā)的新型冠狀病毒導(dǎo)致的嚴(yán)重急性呼吸感染，都對人類健康造成了很大的威脅。目前，國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)將新型冠狀病毒正式命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。世界衛(wèi)生組織(WHO)同時宣布由這一病毒導(dǎo)致的疾病英文名稱為coronavirus disease 2019(COVID-19)。SARS-CoV-2快速精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室檢測是控制COVID-19疫情的關(guān)鍵。該文擬對目前出現(xiàn)的SARS-CoV-2檢測方法及存在問題進(jìn)行綜述。

1 血清免疫學(xué)試驗(yàn)

病毒培養(yǎng)的限制條件較多，免疫學(xué)方法操作簡便易行，適用于高危人群的早期篩查，但其敏感性及特異性還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和評估。病毒感染人體后約5～7 d可產(chǎn)生IgM抗體，10～15 d可產(chǎn)生IgG抗體[1]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》[2]新增加了抗體血清學(xué)檢測作為疑似病例診斷病毒感染的另一關(guān)鍵證據(jù)：血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性；血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高。目前臨床應(yīng)用的抗原、抗體檢測方法主要包括免疫層析法(immunochromatography assay，ICA)、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法等。

1.1ICA ICA具有操作快速、簡單、成本低的優(yōu)勢。Jia等[3]采用ICA對SARS-CoV-2 IgM和IgG的診斷價值進(jìn)行了評估，在57例疑似COVID-19患者中24例核酸檢測陽性患者IgM和IgG單次檢測陽性率分別為79.17%和66.67%；33例核酸檢測陰性患者IgM和IgG單次檢測陽性率分別為60.61%和45.45%；核酸陽性和核酸陰性患者的IgM與IgG聯(lián)合檢測的陽性率分別為87.50 %和72.73%，明顯高于核酸檢測或IgM、IgG單次檢測。Li等[4]開發(fā)了一種快速、簡便的側(cè)向流免疫分析法(lateral flow immunoassay, LFIA)，能在15 min內(nèi)檢出人體血液中抗SARS-CoV-2的IgM和IgG抗體。該研究對397例經(jīng)PCR證實(shí)的SARS-CoV-2感染患者和128例核酸陰性患者的血標(biāo)本進(jìn)行分析，IgG、IgM聯(lián)合抗體檢測的敏感性和特異性分別為88.66%和90.63%。此外，該方法可采用指尖血進(jìn)行IgG/IgM抗體篩查，有望實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2的床旁檢測(point-of-care testing，POCT)。

1.2化學(xué)發(fā)光法 化學(xué)發(fā)光法特異性高、線性范圍寬、速度快，已廣泛應(yīng)用于呼吸道病原體的檢測。徐萬洲等[5]用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)對205例COVID-19病例組(包括186例SARS-CoV-2核酸檢測陽性患者以及19例核酸檢測陰性但臨床癥狀和 CT 檢測結(jié)果符合《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第五版)》的患者)和79例對照組進(jìn)行血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 IgM和SARS-CoV-2 IgG的敏感性分別為70.24%(144/205)和96.10%(197/205)，特異性分別為96.20%(76/79)和92.41%(73/79)；在SARS-CoV-2核酸陽性的COVID-19患者中絕大多數(shù)患者IgG陽性，且IgG的陽性率明顯高于IgM的陽性率，表明患者處于感染中期或恢復(fù)期，預(yù)示患者對SARS-CoV-2逐漸產(chǎn)生了免疫力。因此，IgM和IgG聯(lián)合檢測在COVID-19早期檢測、治療監(jiān)測及病程轉(zhuǎn)歸方面有重要價值。此外，李萍等[6]采用全自動化學(xué)發(fā)光儀對COVID-19患者的IgM和IgG抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)核酸轉(zhuǎn)陰后血清IgM抗體濃度顯著低于核酸轉(zhuǎn)陰前IgM抗體濃度，而轉(zhuǎn)陰后的IgG抗體濃度與核酸轉(zhuǎn)陰前的IgG抗體濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) ELISA可用于冠狀病毒抗原和抗體的檢測，其特異性強(qiáng)，對操作人員要求低，不要求很復(fù)雜的設(shè)備，無放射性核素的危險，是目前應(yīng)用較廣的一種冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)。Wang等[7]在大腸埃希菌中表達(dá)并純化了帶有His標(biāo)記的與SARS-CoV-2核衣殼蛋白同源性為 92%的核衣殼蛋白片段SARSr-CoV Rp3，該研究團(tuán)隊(duì)Zhang等[8]以SARSr-CoV Rp3作為抗原開發(fā)了SARS-CoV-2 IgM和IgG ELISA檢測方法，進(jìn)一步用該方法對接受了10 d左右治療的患者血清進(jìn)行抗體檢測，結(jié)果顯示IgM和IgG滴度在首次采樣當(dāng)天都相對較低或無法檢出，在采樣第5天IgM陽性率從50%(8/16)增加到81%(13/16)，而IgG陽性率從81%(13/16)增加到100%(16/16)。

1.4中和試驗(yàn)(neutralization assay, NA) NA是病毒或毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對易感動物的致病力的試驗(yàn)方法。Zhou等[1]通過Vero E6和Huh7細(xì)胞從武漢地區(qū)1名COVID-19危重癥患者的支氣管肺泡灌洗液中分離出SARS-CoV-2，并在Vero E6細(xì)胞中對5名經(jīng)PCR證實(shí)的SARS-CoV-2 IgG陽性患者的血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果表明，5名患者血清在1∶40～1∶80的稀釋度下，均能中和100 TCID50(50%組織培養(yǎng)感染劑量)。NA是一項(xiàng)耗時且費(fèi)力的免疫測定法，不能用于大規(guī)模篩查，但其具有很高的特異性。

1.5抗體檢測的影響因素 抗體檢測的干擾因素主要有類風(fēng)濕因子(RF)、嗜異性抗體、補(bǔ)體以及免疫交叉反應(yīng)[9-10]?；颊唧w內(nèi)存在的RF能顯著干擾許多免疫學(xué)檢測方法，其中IgM、IgG類RF可以與免疫檢測系統(tǒng)中的捕獲抗體及標(biāo)記二抗的Fc段直接結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果[8]。嗜異性抗體通常是指能與其他種類動物的免疫球蛋白產(chǎn)生反應(yīng)的人類抗體，具有廣泛的種特異性。免疫檢測系統(tǒng)中使用單克隆抗體，嗜異性抗體可與嚙齒類動物IgG的Fc段結(jié)合，這樣嗜異性抗體既可與檢測系統(tǒng)中的捕獲抗體結(jié)合，又可與標(biāo)記抗體結(jié)合，從而造成檢測結(jié)果假陽性[9]。

在固相免疫測定中，來自哺乳動物的固相特異抗體和標(biāo)記二抗均可以激活人補(bǔ)體系統(tǒng)。因?yàn)槠湓诠滔辔郊敖Y(jié)合過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c段的補(bǔ)體C1q結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，這樣C1q就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果[8]。不同種冠狀病毒N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反應(yīng)，鄒明園等[10]用DNAStar軟件對7種冠狀病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，N蛋白和S蛋白同源性分析結(jié)果均顯示與SARS-CoV-2相似性最高的是SARS-CoV，提示基于N或S蛋白的抗體血清學(xué)檢測，可能受其他冠狀病毒感染影響出現(xiàn)交叉反應(yīng)而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

2 核酸擴(kuò)增

國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》指出，對于疑似病例如果具備SARS-CoV-2核酸陽性或者基因測序與已知的SARS-CoV-2基因組高度同源即可確診為COVID-19[2]。目前SARS-CoV-2的全基因組序列信息已經(jīng)被上傳到GSAID數(shù)據(jù)庫，根據(jù)數(shù)據(jù)庫公開的基因組信息，針對SARS-CoV-2的靶基因設(shè)計(jì)特定的熒光探針可實(shí)現(xiàn)病毒核酸檢測。SARS-CoV-2的核酸檢測技術(shù)主要包括實(shí)時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)[11]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[12]、基于納米顆粒的PCR(nanoparticles-based PCR)[13]和數(shù)字PCR (digital PCR, dPCR)[14]等。

2.1實(shí)時熒光RT-PCR技術(shù) 熒光RT-PCR具有快速簡便、成本較低、不依賴抗原抗體制備的優(yōu)勢，是SARS-CoV-2檢測的主流方法。但RT-PCR檢測結(jié)果為陰性時不能排除COVID-19，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的各種因素，包括標(biāo)本采集、標(biāo)本病毒含量和實(shí)驗(yàn)技術(shù)本身原因等。

SARS-CoV-2實(shí)時熒光RT-PCR法試劑盒檢測主要分為開放閱讀框1ab(open reading frame 1ab, ORF1ab)基因、核殼蛋白基因N片段和包膜蛋白基因E片段3個靶點(diǎn)或ORF1ab 和N 片段2個靶點(diǎn)。Corman等[11]針對SARS-CoV-2的RdRp基因、E基因和N基因分別設(shè)計(jì)了3種不同的探針，同時擴(kuò)增呼吸道和糞便標(biāo)本中SARS-CoV-2的3個靶基因。其中針對RdRp基因設(shè)計(jì)了2種探針，一種探針在檢測不同的冠狀病毒之間無特異性，而另一種探針只特異地識別SARS-CoV-2的RdRp基因，該方法具有較高的敏感性和特異性，可區(qū)分SARS-CoV-2與SARS-CoV等其他冠狀病毒。盡管實(shí)時熒光RT-PCR檢測方案是針對病毒基因組保守區(qū)域而言，但是由于RNA病毒表現(xiàn)出大量的遺傳變異，引物、探針和目標(biāo)序列之間的不匹配可能導(dǎo)致檢測性能下降，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

2.2LAMP LAMP只需一個溫度進(jìn)行擴(kuò)增，不會因?yàn)闊嵫h(huán)而損失檢測時間，通常在1 h內(nèi)即可完成病毒核酸的檢測，具有擴(kuò)增迅速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。Yu等[12]針對ORF1ab基因開發(fā)了一種基于等溫LAMP的檢測方法(isothermal LAMP based method for COVID-19, iLACO)，通過對11種呼吸道病毒(包括7種相似的冠狀病毒、2種流感病毒和2種正常的冠狀病毒)的序列比較發(fā)現(xiàn)，iLACO具有較好的種特異性。此外，iLACO的敏感性可與基于Taqman探針的RT-PCR相媲美，能夠檢測出低至10個拷貝的SARS-CoV-2。由于LAMP技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、可視化等優(yōu)點(diǎn)，在分子診斷領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。

2.3基于納米顆粒的PCR 相比于傳統(tǒng)的核酸檢測方法，將納米顆粒引入PCR體系，可以提高病原體檢測的敏感性和特異性。Zhao等[13]研發(fā)了一種基于羧基包覆磁性納米顆粒[a carboxyl groups (PC)-coated magnetic nanoparticles, pcMNPs]的方法，該方法將裂解和結(jié)合步驟合二為一，將pcMNPs-RNA復(fù)合物直接引入后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)，通過對SARS-CoV-2的2個靶片段(ORFlab和N基因)的檢測分析，可以靈敏地檢測到10拷貝的病毒RNA。該方法檢測效果好，周轉(zhuǎn)時間短，對COVID-19的早期臨床診斷具有重要意義。

2.4dPCR dPCR具有絕對定量的優(yōu)點(diǎn)，在HBV和HIV檢測中已被證實(shí)比RT-PCR更敏感[16-17]。Yu等[14]從76例COVID-19確診患者中收集鼻咽拭子、痰、血和尿液共323份臨床標(biāo)本，分別采用微滴式數(shù)字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)和RT-PCR對2個靶基因(ORF1ab和N)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示95份經(jīng)RT-PCR檢測呈雙靶基因陽性的標(biāo)本ddPCR結(jié)果也呈陽性，且ddPCR的拷貝數(shù)與RT-PCR測定的Ct值高度相關(guān)(ORF1ab：R2=0.83; N：R2=0.87)； 67份RT-PCR檢測呈單靶點(diǎn)陽性的標(biāo)本中，41(61.2%)份標(biāo)本ddPCR檢測呈陽性，病毒載量為11.1～123.2 copies/test；在161份RT-PCR檢測陰性的標(biāo)本中，ddPCR檢出4個標(biāo)本呈陽性，病毒載量為11.3～20.7 copies/test。該研究表明，RT-PCR和ddPCR檢測病毒載量高的標(biāo)本和SARS-CoV-2為陰性的標(biāo)本均準(zhǔn)確可靠，但是ddPCR更適用于檢測病毒載量低的標(biāo)本。

2.5核酸檢測的影響因素 SARS-CoV-2核酸檢測的樣本類型包含呼吸道樣本、消化道樣本和血液樣本，對不同的患者需要采集不同類型的樣本。臨床上對于多數(shù)患者采集的樣本類型為咽拭子，但是咽拭子采集不易得到足量的合格標(biāo)本，可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。對于已出現(xiàn)明顯癥狀的患者來說，下呼吸道樣本如深咳痰液為核酸檢測的首選。最近，陳煒等[18]研究發(fā)現(xiàn)痰標(biāo)本中的病毒RNA載量高于咽拭子標(biāo)本，可能與SARS-CoV-2侵襲下呼吸道和肺有關(guān)。

段秀枝等[19]分析了不同的病毒滅活方式對SARS-CoV-2核酸檢測的影響，分別比較了不滅活處理和56 ℃水浴30 min、56 ℃干浴60 min及60 ℃干浴30 min對3例COVID-19患者咽拭子核酸檢測弱陽性結(jié)果的影響。研究發(fā)現(xiàn)滅活后SARS-CoV-2核酸檢測陽性率降低，56 ℃水浴30 min的陽性檢出率較56 ℃干浴60 min及60 ℃干浴30 min高，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陳培松等[20]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過56 ℃ 30 min和75%乙醇處理的咽拭子標(biāo)本對2例COVID-19患者后續(xù)SARS-CoV-2核酸檢測均無明顯影響。但這些研究的標(biāo)本數(shù)量較少，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

不同核酸提取方法的提取濃度、純度及對 RNA 的保護(hù)程度存在差別，在一定程度上也影響病毒核酸檢測的陽性率。磁珠法具有高效、簡便、提取濃度和純度較高等優(yōu)點(diǎn)，是RT-PCR中常用的核酸提取方法。離心柱法、一步裂解釋放法、煮沸裂解法等也被臨床實(shí)驗(yàn)室大量應(yīng)用，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身?xiàng)l件以及各核酸檢測試劑盒的要求選擇合適的提取方法。此外，很多核酸檢測試劑盒尚缺乏大量臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，對病毒核酸的檢測可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3 基因測序

病毒全基因組測序(whole-genome sequencing, WGS)是開發(fā)新的治療方法和研制疫苗、研究病毒進(jìn)化或阻止傳染病暴發(fā)的有力工具，也為識別與公共衛(wèi)生相關(guān)的流行病和控制感染提供了良好的數(shù)據(jù)。

宏基因組測序是一種簡單、低成本的方法，也是唯一一種不要求參考序列的方法，可以對新的病原體或序列變體作出快速分析。Chen等[21]用一種低輸入的宏基因組測序方法對從支氣管肺泡灌洗液中提取的病毒RNA進(jìn)行測序，快速鑒定出SARS-CoV-2。宏基因組測序的局限性是需要很高的測序深度才能獲得足夠的病毒[22]，而且獲得足夠數(shù)據(jù)的測序成本很高，對目標(biāo)病原體的敏感度相對較低。納米孔測序(nanopore target sequencing, NTS)結(jié)合了靶標(biāo)擴(kuò)增和長時實(shí)時納米孔測序的優(yōu)勢，可在6～10 h內(nèi)同時完成對SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒的鑒定。Wang等[23]同時使用RT-PCR和NTS對61份疑似COVID-19病例的核酸樣品進(jìn)行了平行測試，發(fā)現(xiàn)NTS可以識別出更多SARS-CoV-2感染的患者，并且可以同時鑒定出合并感染的其他病原體。此外，NTS可以監(jiān)測突變的核酸序列，提高了SARS-CoV-2鑒定的準(zhǔn)確性。

Xiao等[24]用宏基因組測序、探針捕獲測序和多重PCR擴(kuò)增子測序3種方法分別對8例梯度稀釋的SARS-CoV-2培養(yǎng)物(Ct值17.3～39.9)和8例COVID-19臨床標(biāo)本(Ct值18～32，包括咽拭子、喉拭子、鼻拭子、肛拭子和唾液標(biāo)本)基于DNBSEQ平臺進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)病毒載量≥105copies/mL或Ct值≤24.5時，推薦宏基因組測序方法；當(dāng)病毒載量<105copies/mL或Ct值>24.5時，如果關(guān)注次要堿基突變和堿基頻率，則推薦探針捕獲測序方法，如果關(guān)注主要堿基突變，則推薦多重PCR擴(kuò)增子測序方法。此外，當(dāng)病毒載量低至102copies/mL或Ct值高至35，推薦多重PCR擴(kuò)增子測序方法。因此，各實(shí)驗(yàn)室需要根據(jù)自身?xiàng)l件選擇合適的測序方法。

4 小結(jié)與展望

目前，SARS-CoV-2的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有限，對COVID-19及時、準(zhǔn)確的診斷可以對感染進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂啤；趯?shí)時熒光RT-PCR法的SARS-CoV-2核酸檢測已經(jīng)廣泛應(yīng)用并作為實(shí)驗(yàn)室確診方法；WGS對基因組序列的研究可以揭示SARS-CoV-2的遺傳進(jìn)化關(guān)系，是未來呼吸道病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)；通過檢測病毒特異性抗原或抗體來實(shí)現(xiàn)呼吸道病毒的POCT快速診斷是目前實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)發(fā)展的趨勢。這些技術(shù)的聯(lián)合使用將會提高SARS-CoV-2的檢出率。此外，COVID-19臨床實(shí)驗(yàn)室診斷應(yīng)還要結(jié)合影像學(xué)檢查，有助于不典型病例的診斷與鑒別診斷。COVID-19的暴發(fā)對各臨床實(shí)驗(yàn)室和科研機(jī)構(gòu)也提出了更高的要求，實(shí)驗(yàn)室操作人員應(yīng)做好生物安全防護(hù)工作，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程實(shí)施SARS-CoV-2檢測工作，做好標(biāo)本檢測的分析前、檢測中及檢測后的質(zhì)量控制工作。各技術(shù)廠家應(yīng)對所研發(fā)的SARS-CoV-2檢測產(chǎn)品進(jìn)行充分的性能評價，對研發(fā)人員進(jìn)行嚴(yán)格的培訓(xùn)與考核。相信在不同群體的共同努力下，將會實(shí)現(xiàn)COVID-19以及未來新發(fā)呼吸道疾病的精準(zhǔn)診療。