自噬在胰腺星狀細(xì)胞激活及纖維化中的作用

李丹，崔立華，李彩霞，張淑坤

(1.天津市南開醫(yī)院胃腸外科，天津 300100；2.天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所，天津 300100)

胰腺纖維化是指胰腺組織彌漫性纖維組織增生，呈進(jìn)行性、不可逆發(fā)展，最終導(dǎo)致胰腺內(nèi)、外分泌功能喪失。這種纖維化與病程進(jìn)展相伴隨，常見于慢性胰腺炎、胰腺癌及胰腺囊性纖維化等疾病。胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSCs)，激活是觸發(fā)胰腺纖維化的扳機(jī)，膠原代謝動態(tài)失衡即膠原合成增多和(或)降解減少是胰腺實(shí)質(zhì)纖維化的主要病理生理過程。適時終止纖維化進(jìn)程是臨床治療慢性胰腺炎的難點(diǎn)。自噬是細(xì)胞內(nèi)清除受損、衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要方式，同時為細(xì)胞重建、再生和修復(fù)提供原料。近年有研究發(fā)現(xiàn)，PSCs自噬參與其激活過程，抑制自噬能同時抑制PSCs激活。深入研究PSCs自噬及其調(diào)控機(jī)制可能為胰腺纖維化的治療提供新靶點(diǎn)和新策略。

一、PSCs激活與胰腺纖維化

1.胰腺纖維化 以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)成分代謝失衡，并沉積在細(xì)胞外將導(dǎo)致胰腺組織纖維化。在正常胰腺組織的基底膜、間質(zhì)纖維、導(dǎo)管壁和血管壁均可檢測到膠原表達(dá)，這些膠原是胰腺組織結(jié)構(gòu)的一部分，還參與胰腺細(xì)胞與血漿之間的物質(zhì)交換和信息傳遞[1-2]。胰腺纖維化時，利用飽和苦味酸-天狼星紅染色，在偏振光顯微鏡下可清晰地觀察到Ⅰ型膠原纖維呈亮紅色或橙紅色，Ⅲ型膠原纖維呈綠色。Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維交織成網(wǎng)絡(luò)，呈彌漫性分布，致使腺泡萎縮變形。以膠原合成增多和(或)降解減少膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)代謝動態(tài)失衡是胰腺纖維化的主要病生理過程。膠原合成受轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)等細(xì)胞因子調(diào)控[3-4]，膠原的降解主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)調(diào)控。目前已發(fā)現(xiàn) MMPs 有26種家族成員，其中屬于間質(zhì)膠原酶類的 MMP1(人)、MMP13(鼠)和 MMP8 主要負(fù)責(zé)降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，屬于明膠酶類的MMP2和MMP9主要降解Ⅳ型膠原，均與胰腺纖維化關(guān)系密切[5-6]?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)是組織中 MMPs 的內(nèi)源性特異性抑制因子。目前已發(fā)現(xiàn)的 TIMPs 包括 TIMP1、2、3、4 四種，它們分別與 MMPs 形成二元或三元復(fù)合物，在時間和空間上共同抑制 MMPs 的活性，阻止膠原降解，促進(jìn)胰腺纖維化[7]。

2.PSCs PSCs有靜息態(tài)和激活態(tài)兩種表型。在正常胰腺組織中，PSCs約占胰腺細(xì)胞總數(shù)的4.0%，呈靜止?fàn)顟B(tài)，位于腺泡基底部和胰腺小葉間，胞質(zhì)內(nèi)儲存豐富脂滴，中間絲蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白表達(dá)陽性[8]。當(dāng)胰腺壞死、炎癥發(fā)生時，原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的PSCs被激活，轉(zhuǎn)化為類肌成纖維樣細(xì)胞，其形態(tài)和功能均發(fā)生明顯變化:胞質(zhì)內(nèi)脂滴消失，體積變大，增殖活躍，合成并分泌大量的炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分(如Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，纖維連接蛋白，層黏連蛋白等)，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)陽性，具有收縮和移行能力[9]。PSCs除了在胰腺修復(fù)損傷中發(fā)揮間質(zhì)支持作用外，近年還被發(fā)現(xiàn)具備干細(xì)胞的一些特性，例如，在大鼠的胰腺組織中可分離出表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物(如CD133、PITX2)的PSCs，提示PSCs還參與胰腺組織再生過程[10-11]。

3.PSCs激活與胰腺纖維化 激活PSCs是觸發(fā)胰腺纖維化的扳機(jī)。盡管胰腺纖維化的發(fā)病機(jī)制還沒有完全闡明，但研究者普遍認(rèn)為胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷、壞死、炎細(xì)胞浸潤是激活PSCs的必需和先決條件[12-14]。激活PSCs旨在修復(fù)受損胰腺組織，但同時也啟動了胰腺纖維化。處于激活狀態(tài)的PSCs如果繼續(xù)保持旺盛的增殖能力，持續(xù)合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)成分，就會干擾膠原代謝動態(tài)平衡，即膠原合成增多和(或)降解減少，將導(dǎo)致胰腺纖維化，破壞正常組織結(jié)構(gòu)，影響胰腺功能。已有研究證實(shí)，TGF-β1、血小板衍生生長因子BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)、乙醇及其代謝物等細(xì)胞外刺激因素能通過MAPK、Smads及Wnt等信號通路，參與PSCs激活過程，上調(diào)Ⅰ型膠原等靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯[15-17]。這些信號通路在胰腺纖維化過程中被證實(shí)處于失調(diào)控狀態(tài)，進(jìn)一步導(dǎo)致激活態(tài)PSCs合成、分泌大量的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)纖維化進(jìn)程。還有研究從膠原降解角度研究胰腺纖維化，發(fā)現(xiàn)MMP13和TIMP1 在二丁基二氯化物誘導(dǎo)的慢性胰腺炎纖維化大鼠表達(dá)升高[18]。

二、PSCs自噬與激活

1.自噬 自噬是一種細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典代謝過程,是降解、清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、衰老的細(xì)胞器以及不再需要的生物大分子物質(zhì)的主要方式，同時也為細(xì)胞重建、再生和修復(fù)提供氨基酸、脂肪酸等原料,實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用。自噬過程是由一套自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene, Atg)編碼的蛋白所調(diào)控的動態(tài)過程。在酵母中已發(fā)現(xiàn)的Atg已超過30種，其中15種核心Atg(Atg1～Atg10,Atg12～Atg14, Atg16 和Atg18)在哺乳動物也相繼被發(fā)現(xiàn)。自噬過程可分為3個步驟：①起始：Atgl3與ULK、FIP200形成復(fù)合物，啟動自噬，在胞質(zhì)的某處形成一個小的扁平的雙層膜結(jié)構(gòu)——吞噬泡；②延伸：在Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)等參與下，吞噬泡不斷延伸，將胞質(zhì)中成分?jǐn)埲肫渲校缓笫湛诔蔀槊荛]的自噬體；③融合和降解:自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，兩者的內(nèi)容物合為一體，自噬體中的“貨物”也被降解，產(chǎn)物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞質(zhì)中，供細(xì)胞重新利用，而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞質(zhì)中[19-20]。

2.PSCs自噬與激活 Endo等[21]從手術(shù)切取的胰腺癌和慢性胰腺炎組織中分離、培養(yǎng)病人的PSCs，發(fā)現(xiàn)激活態(tài)的PSCs存在自噬現(xiàn)象，且來源于胰腺癌組織PSCs的自噬水平比來源于慢性胰腺炎組織的高；接著在二丁基二氯化物誘導(dǎo)的慢性胰腺炎動物模型也觀察到PSCs自噬水平升高[22]，這些研究提示自噬在PSCs激活以及胰腺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。還有研究表明PSCs通過自噬產(chǎn)生的丙氨酸可以作為一種替代碳源，為胰腺癌細(xì)胞提供原料，有助于在其相對貧瘠的微環(huán)境中獲得能量，快速生長[23]。Li等[22]用透射電鏡在體外原代培養(yǎng)的大鼠PSCs觀察到胞質(zhì)內(nèi)具有典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，并發(fā)現(xiàn)隨著原代培養(yǎng)時間的延長,自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B和激活標(biāo)志物α-SMA在PSCs表達(dá)同步增強(qiáng)；為進(jìn)一步探討PSCs自噬和激活的關(guān)系，用含3-甲基腺嘌呤(3-MA)的培養(yǎng)液孵育原代PSCs，發(fā)現(xiàn)LC3、Atg 5和α-SMA 的mRNA 和蛋白表達(dá)同時降低，這一研究首次證實(shí)自噬參與PSCs激活過程，抑制PSCs自噬能同時抑制其激活。但對于自噬在PSCs由靜息態(tài)轉(zhuǎn)變成激活態(tài)過程中所起的作用還沒有定論。有研究推測，PSCs可能通過自噬降解儲存在胞質(zhì)內(nèi)的脂滴，為靜息態(tài)PSCs提供原料和能量，促進(jìn)PSCs激活[23]。

三、自噬的調(diào)控與PSCs激活及胰腺纖維化

1.PSCs自噬相關(guān)信號通路 哺乳動物雷帕霉素作用靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,mTOR)在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞增殖及凋亡等多個方面發(fā)揮重要作用,同時也是調(diào)控細(xì)胞自噬活性高低的“樞紐”。當(dāng)mTOR被抑制時，Atg13與ULK、FIP200結(jié)合，誘導(dǎo)自噬發(fā)生；反之當(dāng)mTOR被活化后，抑制自噬啟動[24]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR通路在慢性胰腺炎大鼠被抑制，而TGF-β1/Smads通路被激活，同時伴有胰腺組織自噬活性增高和纖維化；利用體外培養(yǎng)的PSCs進(jìn)行深入的機(jī)制探討，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路抑制劑LY294002能進(jìn)一步促進(jìn)TGF-β1表達(dá)、PSCs自噬和激活[25]。這一研究提示PI3K/Akt/mTOR和TGF-β1/Smads兩條通路之間存在相互作用，抑制PI3K/Akt/mTOR通路除了能直接促進(jìn)PSCs自噬，還能通過促進(jìn)TGF-β1/Smads通路促進(jìn)PSCs激活，加速胰腺纖維化進(jìn)程。除此之外，TGF-β1對ULK1磷酸化有抑制作用，使之易于與FIP200、Atgl3結(jié)合，誘導(dǎo)PSCs自噬發(fā)生[26]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)/mTOR是調(diào)控細(xì)胞能量代謝的主要通路，也參與了PSCs的自噬過程的調(diào)控[27]。還有研究表明，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤卷曲螺旋蛋白1(retinoblastoma coiled coil protein 1，RB1CC1)在慢性胰腺炎纖維化病人表達(dá)升高，沉默RB1CC1基因能抑制ULK1的表達(dá)及其激酶活性，進(jìn)而抑制激活態(tài)PSCs的自噬作用，減少膠原分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RB1CC1能與ULK1 mRNA啟動子區(qū)域結(jié)合并相互作用，上調(diào)其mRNA和蛋白表達(dá)，這可能是RB1CC1促進(jìn)PSCs自噬發(fā)生的分子機(jī)制[26]。

2.PSCs自噬的調(diào)控 最近有研究發(fā)現(xiàn)一些藥物對PSCs自噬有調(diào)控作用。柴胡皂苷d是中藥柴胡的主要有效成分之一，Cui 等[28]探討了胡皂苷d對PSCs自噬和活化的影響，發(fā)現(xiàn)SSd對PSCs自噬和活化有抑制作用，其抗胰腺纖維化的作用機(jī)制是通過激活PI3K/Akt/mTOR途徑抑制PSCs自噬，從而抑制其激活、減少膠原生成實(shí)現(xiàn)的。還有研究[29]發(fā)現(xiàn)輔酶Q10也能激活PI3K/Akt/mTOR通路，阻止胰腺纖維化進(jìn)程。FTY720是由冬蟲夏草提取物中多球殼菌素進(jìn)行化學(xué)修飾而成的免疫抑制劑，有研究發(fā)現(xiàn)FTY720能抑制PSCs自噬和激活，使其細(xì)胞活力、增殖和遷移能力降低；AMPK激動劑phenformin能激活A(yù)MPK/mTOR通路，上調(diào)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B蛋白表達(dá)，而FTY720能對抗phenformin的激活作用，下調(diào)LC3B表達(dá)。這些結(jié)果表明FTY720通過抑制AMPK/mTOR通路來抑制PSCs自噬，進(jìn)而抑制其激活和減輕胰腺纖維化程度[27]。

四、小結(jié)與展望

綜上所述，適度抑制PSCs的激活程度，使之合成的膠原既能修復(fù)損傷組織，又不在細(xì)胞外沉積，是阻止胰腺纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵。自噬在PSCs激活過程中起重要作用，可能與降解脂滴、提供能量有關(guān)，抑制PSCs自噬能同時抑制PSCs激活。目前研究表明PI3K/Akt/mTOR和AMPK/mTOR通路、自噬啟動復(fù)合物的形成是調(diào)控PSCs自噬活性的關(guān)鍵，深入研究PSCs自噬及其藥物調(diào)控機(jī)制可能為胰腺纖維化的治療提供新靶點(diǎn)和新策略。