外泌體microRNAs：動脈粥樣硬化疾病診斷和治療的新型生物標(biāo)志物*

閆宇涵，王占黎，于 慧

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科)

動脈粥樣硬化是一種緩慢的進行性疾病，是冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)、腦梗死等疾病的根本原因[1]，心肌梗塞和中風(fēng)仍然是全世界死亡的主要原因。目前已知多種因素都可以導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展，如：吸煙、糖尿病、遺傳因素等。動脈粥樣硬化是血管壁脂質(zhì)積聚周圍的亞急性免疫介導(dǎo)的炎癥，是造成動脈粥樣硬化的原因。動脈粥樣硬化的主要特征是單核細(xì)胞和T細(xì)胞對血管壁的浸潤?；静±碜兓侵|(zhì)進入動脈的內(nèi)皮細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外都有脂質(zhì)集聚，隨著脂質(zhì)不斷的集聚和結(jié)締組織的大量增生形成了外觀為黃顏色的粥樣斑塊，所以叫做動脈粥樣硬化。本文對外泌體miRNAs對動脈粥樣硬化中作用的研究進展進行綜述。

1 外泌體的概述

1987年Johnstone等人首次從體外培養(yǎng)的網(wǎng)織紅細(xì)胞中分離獲得外泌體，并將其命名為 Exosomes[2]。當(dāng)時他們認(rèn)為這些生物囊泡是細(xì)胞主動向外排泄的一種廢物。后來研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的動物細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放外泌體，包括：血小板、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肝細(xì)胞等[3]。Hawari等人首次使用超速離心和蔗糖密度梯度法從人的血清和支氣管肺泡灌洗液中分離外泌體，之后從唾液、尿液、母乳、腹水和腦脊液等體液中分離獲得外泌體[4]。外泌體是粒徑一般為30～100 nm、密度約為1.13～1.21 kg / L的微小囊泡狀結(jié)構(gòu)，其膜表面表達一種四次跨膜蛋白。已知CD63與CD9是外泌體的分子標(biāo)志物[5]。外泌體包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA及miRNAs等信使分子。研究表明，外泌體分泌到細(xì)胞外以后，經(jīng)由血液、尿液和唾液等體液被相鄰或遠(yuǎn)離的靶細(xì)胞吸收，在細(xì)胞間的信息傳遞中起到載體的作用[6]。

2 外泌體中的miRNAs

MiRNAs是一類廣泛存在于人體組織的非編碼小分子單鏈RNA，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡等生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[7]。MiRNAs在物種間有著高度保守性、細(xì)胞組織特異性、時序性和位相性等特性[8]。MiRNAs生成過程中，首先在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即pri-miRNAs[9]，經(jīng)RNaseⅢ酶剪切，形成65～75個核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即pre-miRNAs，經(jīng)Dicer進一步加工處理，剪切成大小為22個核苷酸的雙鏈RNA，其中一條鏈形成成熟miRNA，另一條互補鏈被降解。成熟miRNA通過與靶基因3非編碼區(qū)互補配對來抑制蛋白質(zhì)生成，參與調(diào)節(jié)基因表達。2007 年，Valadi 等人從鼠肥大細(xì)胞來源外泌體中首次檢測到miRNAs[10]。后來，外泌體中的多種miRNAs陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[11]。到目前為止已有700 多種miRNAs被證實在人體中排序[12,13]。

3 外泌體miRNAs與動脈粥樣硬化

近些年來，外泌體miRNAs對動脈粥樣硬化的諸多作用已成為臨床所關(guān)注的熱點。對其開展研究，將為動脈粥樣硬化的診斷、治療、預(yù)防等方面提供了新思路。本文將對外泌體miRNAs在動脈粥樣硬化中部分病理環(huán)節(jié)中的作用展開綜述，主要包括外泌體miRNAs在炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能、平滑肌細(xì)胞功能、膽固醇的穩(wěn)態(tài)、斑塊及血管新生等方面的調(diào)節(jié)作用。

3.1炎癥和內(nèi)皮功能調(diào)節(jié) 血管壁的組成成分中包括了內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，它們都參與維持血管穩(wěn)態(tài)。動脈粥樣硬化主要是血管在各種不同危險因子作用下的炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-10a可調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)分子的表達，如：白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)和E-選擇蛋白等[13]，通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞表型變化來推動動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，而且，在主動脈發(fā)生了動脈粥樣硬化的區(qū)域中miR-10a表達下調(diào)[14]。外泌體miR-21是第一個從哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的miRNA[15]，成熟miR-21具有高度保守性，其編碼基因位于17號染色體短臂2區(qū)3帶2亞帶 (17q23.2)，與蛋白編碼基因VMP1(TMEM49)的位置重疊。miR-21的靶基因為多種抑癌基因[16]。血流剪切力改變可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-21的表達[17]。作為miR-21的靶基因，過氧化物酶體增殖物激活受體α(血管壁中的一種重要抗炎介質(zhì))的表達受miR-21的調(diào)節(jié)，進而影響VCAM-1和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達[13]，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞間的黏附，從而影響炎癥及動脈粥樣硬化[18]。Harris發(fā)現(xiàn)了miRNAs對內(nèi)皮的功能具有調(diào)節(jié)作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中miR-126可以作用于VCAM-1基因3非翻譯區(qū)來抑制VCAM-1的表達，從而減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞間的黏附，發(fā)揮了抗動脈粥樣硬化作用[20]。另外，miR-143/miR-145的外泌體也是內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的，它們通過調(diào)節(jié)靶細(xì)胞血管平滑肌細(xì)胞中的基因選擇性表達，從而調(diào)節(jié)了動脈粥樣硬化[21]。Zheng等證實，miR-210可明顯上調(diào)血管通透因子(VPF)的表達，且下調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(RUNX3)的表達，進而影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、再生、遷移[22]。研究還發(fā)現(xiàn)，抑制miR-503的表達抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進其凋亡[23]。

3.2血管平滑肌細(xì)胞功能調(diào)節(jié) 在血管平滑肌細(xì)胞中，外泌體miRNAs對動脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)也發(fā)揮著不可忽略的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)血小板源生長因子可調(diào)控外泌體miR-26a在血管平滑肌細(xì)胞中的表達，且 miR-26a 還能調(diào)節(jié)α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)基因和平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)基因的表達，從而促進了血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變以及動脈粥樣硬化的發(fā)生[24]。斑塊的形成是動脈粥樣硬化斑塊的明顯特征，miRNAs可以調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化、增殖、遷移。研究表明，血管平滑肌細(xì)胞在動脈粥樣硬化斑塊中大約存在兩種表型，一種為收縮型，另一種為合成型。收縮型為平滑肌細(xì)胞在正常生理條件下的表型；在受到超過其所能承受病理刺激因素下，平滑肌細(xì)胞活性會增強，同時它分泌的能力也會增強，表型就會發(fā)生改變，即由原來的收縮型向合成型轉(zhuǎn)化[25]。研究人員發(fā)現(xiàn)，Kruppel樣因子使內(nèi)皮細(xì)胞中miR-143/miR-145的表達上調(diào)，將內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞共同培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體可攜帶miR-143/miR-145等信號分子進入平滑肌細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)基因表達引起平滑肌細(xì)胞表型發(fā)生改變，提示miR-145是血管平滑肌細(xì)胞表型的標(biāo)志物[26]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，將動脈粥樣硬化模型小鼠注射miR-143/miR-145微泡，可以有效的緩解模型小鼠粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展[27]。

3.3膽固醇的穩(wěn)態(tài) 在動脈粥樣硬化中膽固醇發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的每個階段。已知miR-122富集于肝臟中，占肝臟總miRNAs含量的80 %以上[28]。研究表明，抑制肝臟中肝細(xì)胞來源外泌體miR-122水平，導(dǎo)致小鼠血漿中的膽固醇明顯下降[29]。通過Microarray等基因分析技術(shù)研究得出，外泌體miR-122參與調(diào)節(jié)膽固醇合成相關(guān)基因的表達，如：朗德鵝3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 合酶基因(HMGCS1)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因(HMGCoAR)和角鯊烯環(huán)氧酶(SE)等，提示其在調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用[30-32]。另外，膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)是體內(nèi)清除過多膽固醇的重要途徑，是抗動脈粥樣硬化的途徑之一，其維持體內(nèi)膽固醇的平衡具有重要的意義。最近，RCT領(lǐng)域中miRNAs的研究成為熱點。研究表明，輔酶Q10可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞膽固醇發(fā)生逆向轉(zhuǎn)運，并抑制動脈粥樣硬化的進一步發(fā)生和發(fā)展[33]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10抑制外泌體miR-378的表達，進而使靶基因ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 G1(ABCG1)抑制人和鼠的巨噬細(xì)胞中膽固醇流出[34]。因此，miR-378是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中膽固醇流出和抑制動脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物[34]。

3.4斑塊及血管新生的調(diào)節(jié) 血流動力學(xué)改變影響動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，與斑塊的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，血管分叉處易發(fā)生湍流，其產(chǎn)生的低剪切力可誘導(dǎo)血液外泌體中miR-21、miR-92a、miR-663等miRNAs的表達，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生；而高層流剪切力可誘導(dǎo)血液外泌體中miR-10a、miR-23b、miR-101等miRNAs的表達，具有抗動脈粥樣硬化作用[35]。而且，外泌體miR-133等能調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化，進而影響膠原纖維的合成分泌[36]。后者對于動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性具有重要意義。另外，由于動脈粥樣硬化斑塊所處血管的管壁變厚，導(dǎo)致氧供給受到限制，此時需要形成新的血管以增加氧的供給量。血管新生的過程，首先血管基底膜發(fā)生溶解，血管內(nèi)皮細(xì)胞向外游離，形成新生血管，這些微小的新生血管經(jīng)過不斷的重構(gòu)和成熟，形成新的血管，逐漸的加入原有的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從而形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。血管新生早期有助于血管內(nèi)膜養(yǎng)分供給，但是，斑塊的不斷發(fā)展和血管新生增多，往往不利于斑塊的穩(wěn)定性。目前已經(jīng)報道的能夠調(diào)節(jié)血管新生的miRNAs有很多，包括：miR-21b、miR-22、miR-27a、miR-126、miR-155、miR221/222等。例如，miR-155和miR221/222經(jīng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)可抑制血管新生[37]；miR-22和miR-27a/27b分別通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與激活轉(zhuǎn)錄因子5A(STAT5a)和腦信號蛋白6A(SEMA6A)的表達來抑制血管新生[38]。

4 展望

外泌體miRNAs在細(xì)胞間起到傳遞信息的作用，并且參與調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程。目前，越來越多的參與調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的外泌體miRNAs被發(fā)現(xiàn)，越來越多的miRNAs類似物被用于動脈粥樣硬化的治療研究。然而，影響動脈粥樣硬化的更多的外泌體miRNAs有待進一步挖掘，外泌體miRNAs調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的確切分子機制也不完全清楚。隨著對外泌體miRNAs研究的不斷深入，我們會更深入了解其在動脈粥樣硬化中扮演的角色，也將為動脈粥樣硬化治療和預(yù)防等環(huán)節(jié)提供新的思路。