礦區(qū)排土場復(fù)墾區(qū)玉米根際土壤真菌遺傳多樣性研究

劉寶勇 王麗莎 常敬華

摘要 [目的]研究礦區(qū)排土場復(fù)墾區(qū)和普通種植區(qū)土壤真菌多樣性的差異。[方法]以阜新海州露天礦排土場復(fù)墾區(qū)玉米田土壤（K1區(qū)）、阜新市太平區(qū)下洼子村玉米田土壤（F1區(qū)）為研究對象，分析土壤的理化性質(zhì)并利用基因組測序分析復(fù)墾區(qū)和對照區(qū)真菌多樣性的差異。在此基礎(chǔ)上，對復(fù)墾區(qū)和對照區(qū)樣本中的真菌進(jìn)行分離、純化和分子鑒定，并分析可培養(yǎng)真菌的多樣性。[結(jié)果]K1區(qū)和F1區(qū)土壤有效磷、速效鉀、pH呈顯著性差異，堿解氮和有機(jī)質(zhì)呈非顯著性差異;K1區(qū)的物種豐富度和均勻度均低于F1區(qū)，K1區(qū)鑒定出19個真菌屬，而F1區(qū)共鑒定出52個真菌屬，真菌的預(yù)測功能K1區(qū)比F1區(qū)少11種;K1區(qū)分離鑒定的真菌以青霉屬（Penicillium sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌為主，F(xiàn)1區(qū)分離鑒定的真菌以青霉屬（Penicillium sp.）和木霉屬（Trichoderma sp.）真菌為主。[結(jié)論]該研究為礦區(qū)生態(tài)修復(fù)、土壤改良提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 排土場復(fù)墾區(qū);理化性質(zhì);真菌多樣性;土壤改良

中圖分類號 S154.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）21-0063-07

Abstract [Objective]To study the differences in soil fungal diversity in the mining areas wasteland reclamation area and ordinary planting area.[Method]Taking the cornfield soil （K1 area） in the reclamation area of Fuxin Haizhou openpit mine dumping field and the cornfield soil （F1 area） in Xiawazi Village，Taiping District，F(xiàn)uxin City as the research objects，the physical and chemical properties of the soil were analyzed and the differences in fungal diversity in the reclamation and control areas were analyzed using genomic sequencing.Based on this，the fungi in the samples from the reclamation area and the control area were isolated，purified and molecularly identified and the diversity of culturable fungi was analyzed.[Result]The soil available phosphorus，available potassium and pH in the K1 and F1 areas showed significant differences，while the alkaline hydrolysis nitrogen and organic matter showed nonsignificant differences;the species richness and uniformity in K1 area were lower than those in F1 area.19 fungal genera were identified in K1 area，and 52 fungal genera were identified in F1 area.The predictive function of fungi in K1 area was 11 less than that in F1 area.Penicillium sp.and Fusarium sp.were the main fungi isolated and identified in K1 area，while Penicillium sp.and Trichoderma sp.were the main fungi isolated and identified in F1 area.[Conclusion]The study provides theoretical basis and practical guidance for ecological restoration and soil improvement in mining areas.

Key words Reclaimed area of mining dump;Physical and chemical properties;Fungal diversity;Soil improvement

基金項(xiàng)目

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃“重大自然災(zāi)害監(jiān)測預(yù)警與防范”重點(diǎn)專項(xiàng)（2017YFC1503100）;科技部基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2013FY113400）。

作者簡介 劉寶勇（1975—），男，遼寧葫蘆島人，副教授，博士，從事水土保持與礦山環(huán)境工程方面的教學(xué)與科學(xué)研究;王麗莎（1992—），女，遼寧丹東人，碩士研究生，研究方向：生態(tài)修復(fù)理論與技術(shù)。劉寶勇和王麗莎是共同第一作者。*通信作者，講師，博士，從事真菌及真菌毒素控制技術(shù)研究。

收稿日期 2020-03-30;修回日期 2020-04-21

阜新露天礦是亞洲第一大露天煤礦，已因資源枯竭而關(guān)閉，但由于長期的開采造成生態(tài)環(huán)境破壞嚴(yán)重，礦區(qū)周邊排土場土壤重金屬含量升高，土壤養(yǎng)分流失，嚴(yán)重影響了排土場復(fù)墾區(qū)作物的生長[1-2]。對礦區(qū)排土場的生態(tài)重建工作一直是近年來國內(nèi)眾多專家和學(xué)者所關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)復(fù)墾是對排土場綜合治理的重要手段之一。目前我國大部分農(nóng)業(yè)復(fù)墾以傳統(tǒng)土木工程復(fù)墾為主，但傳統(tǒng)復(fù)墾方式使地表的土壤經(jīng)過了機(jī)械壓實(shí)，從而使土壤的孔隙度變小，團(tuán)粒結(jié)構(gòu)也受到了破壞，嚴(yán)重影響了植物根系在復(fù)墾地表土壤中的生長和延伸;利用生物復(fù)墾能高效恢復(fù)和提高土壤的質(zhì)量和肥力、改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)、促進(jìn)土壤生物多樣性，從而實(shí)現(xiàn)礦區(qū)排土場生態(tài)修復(fù)與土地可持續(xù)利用[3]。目前，微生物復(fù)墾技術(shù)已成為國內(nèi)外研究的前沿和熱點(diǎn)。微生物復(fù)墾技術(shù)與傳統(tǒng)復(fù)墾方式相比具有技術(shù)費(fèi)用低、復(fù)墾效果好、不會造成二次污染、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[4]。土壤真菌生物多樣性是影響土壤品質(zhì)和作物生長的重要因素。Bacon等[5]研究發(fā)現(xiàn)，感染了木霉菌（Trichoderma sp.）的植物和玉米種子被人食用后，可以有效減輕體內(nèi)的鐮刀菌毒素對人及其動物和牲畜的健康危害。曲霉屬（Aspergillus sp.）和鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌是玉米整個生命周期中最主要的致病菌，單格孢屬（Ulocladium sp.）、鏈格孢屬（Alternaria sp.）、木霉屬（Trichoderma sp.）在我國玉米的生長初期較為多見[6]。枝頂孢屬真菌（Acremonium zeae）可以在土壤中產(chǎn)生多種抗生素，對玉米病原菌串珠鐮刀菌（Fusaraum verticillioides）和黃曲霉（Aspergillus flavus）的繁殖和生長起到抑制作用[7]。農(nóng)業(yè)產(chǎn)中，有害植物真菌的大量積累會直接引起農(nóng)作物產(chǎn)量的降低，有益植物真菌具有促進(jìn)農(nóng)作物植株生長、防治有害真菌及吸附土壤中重金屬的作用[8]。

因此，對阜新礦區(qū)排土場復(fù)墾區(qū)和普通種植區(qū)玉米根際土壤中真菌遺傳多樣性進(jìn)行分析，探討相同的氣候和不同土壤條件下真菌遺傳多樣性的關(guān)系和差異，并對2個類型土壤中的真菌進(jìn)行分離、純化和鑒定。研究結(jié)果有利于完善阜新礦區(qū)農(nóng)業(yè)廢棄地復(fù)墾的方法，有助于降低采礦過程帶來的環(huán)境微生物污染和促進(jìn)礦區(qū)土地微生物資源的合理利用，同時為同類型的礦區(qū)復(fù)墾區(qū)的土壤改良與治理提供參考，也為阜新礦區(qū)農(nóng)業(yè)廢棄地土壤生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)與治理的研究提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況 阜新市海州露天礦排土場復(fù)墾區(qū)地處遼寧省西北部低山丘陵區(qū)（121°40′12″E，41°57′36″N），總面積約為 13 km2，排土場區(qū)域呈階梯狀，溝壑縱橫，陡坎坡平均坡度45°，盤面海拔平均為270 m，相對高差為3～60 m，最高處接近325 m，最低處不低于240 m，年均氣溫6.5～7.5 ℃，年均降水量420～540 mm，年均無霜期154 d，≥0 ℃活動積溫3 647 ℃·d，≥10 ℃活動積溫3 377 ℃·d。復(fù)墾區(qū)種植的玉米植株矮化，不結(jié)穗或畸形穗，幾乎顆粒無收。

阜新市太平區(qū)下洼子村距海州露天礦排土場復(fù)墾區(qū)5 km，與露天礦排土場復(fù)墾區(qū)氣候相同，玉米長勢良好，籽粒飽滿。

1.2 土壤樣品采集與分析

于2018年8月分別對阜新海州露天礦排土場復(fù)墾區(qū)（K1區(qū)）和太平區(qū)下洼子村對照區(qū)（F1區(qū)）的玉米種植地的土壤多點(diǎn)取樣。K1區(qū)和F1區(qū)分別設(shè)計5個采樣點(diǎn)，每個采樣點(diǎn)在10 m×10 m的范圍內(nèi)按對角線法取5個子樣品（2 cm寬、5 cm深的土壤），混合為1個樣品，土壤樣本用冰盒保鮮帶回。帶回的樣品過 1 mm 篩，一部分置于-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆茫徊糠址庞? ℃冰箱中保存以便近期試驗(yàn)使用，其余樣品自然風(fēng)干，用于土壤理化性狀分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤性質(zhì)測定方法。K1區(qū)和F1區(qū)的土壤pH采用pH計法測定（LY/T 1239—1999）;堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測定;速效鉀采用酸溶法測定;K1區(qū)酸性土壤有效磷采用氟化銨-鹽酸浸提法測定，F(xiàn)1區(qū)的中性土壤有效磷采用碳酸氫鈉浸提法測定（LY/T 1228—2015）;有機(jī)質(zhì)采用容量分析法測定（LY/T 1237—1999）。

1.3.2 土壤真菌DNA提取及高通量測序。

采用SDS方法對土壤樣本的基因組DNA進(jìn)行提取并檢測純度和濃度，隨后對目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物回收純化，之后使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建及熒光定量，由北京諾禾致源生物信息技術(shù)有限公司利用Illumina NovaSeq 測序平臺對該文庫進(jìn)行雙末端測序（Paired_End）分析。PCR擴(kuò)增所用的引物為ITS5-1737F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS2-2043R：5′-CAACTCTTAGCGGTGGAT-3′。

1.3.3 土壤真菌的分離、純化與分子鑒定。

采用稀釋平板法對土壤真菌進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為添加鏈霉素的PDA培養(yǎng)基，利用無菌接種環(huán)挑取菌落邊緣菌絲接種于新的平板中進(jìn)行分離，培養(yǎng)3～5代，確保獲得純化菌株。

將純化菌株接種于PDA平板上，28 ℃避光培養(yǎng)5～7 d。挑取菌絲體置于無菌研缽，液氮研磨。參照真菌基因組DNA小量提取試劑盒步驟進(jìn)行操作，得到提取出的DNA溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增引物為ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGC）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）;PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)，72 ℃最后延伸7 min。由青島派森諾生物科技有限公司利用 Illumina Mi Seq 測序平臺進(jìn)行雙端測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010對土壤理化指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性差異分析。

測序數(shù)據(jù)分析首先對原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進(jìn)行拼接、過濾，得到Clean Tags，Clean Tags經(jīng)過嵌合體的去除得到有效數(shù)據(jù)（Effective Tags），然后利用Uparse軟件對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（identity）將序列聚類成為OTUs（operational taxonomic units），同時會選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0），獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE軟件進(jìn)行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods_coverage、PD_whole_tree 指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、等級聚類曲線，并使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化分析

土壤的理化性質(zhì)是影響微生物多樣性和作物生長的重要因素。因此，分別對復(fù)墾區(qū)（K1區(qū)）和對照區(qū)（F1區(qū)）的5個土壤樣品進(jìn)行理化指標(biāo)分析，結(jié)果見表1。從表1可以看出，K1區(qū)和F1區(qū)的堿解氮和有機(jī)質(zhì)差異不顯著，F(xiàn)1區(qū)的有效磷顯著高于K1區(qū)，速效鉀遠(yuǎn)低于K1區(qū)，且K1區(qū)土壤呈酸性，pH為5.75±0.14。研究認(rèn)為，酸性土壤嚴(yán)重影響作物對土壤營養(yǎng)的吸收，其中堿解氮、速效鉀在pH為6～8時有效性最高，有效磷在土壤pH為5.5～7.5時有效性最大，玉米生長最適的土壤pH為6.0～7.5[9]。因此，復(fù)墾區(qū)土壤pH偏低可能是影響微生物多樣性和玉米生長狀況及產(chǎn)量的重要因素。

2.2 土壤真菌遺傳多樣性分析

2.2.1 土壤真菌α多樣性指數(shù)和物種多樣性曲線。

對樣本在97%一致性閾值下的α多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Goods_coverage、PD_whole_tree）進(jìn)行統(tǒng)計，見表2。從表2可以看出，F(xiàn)1區(qū)土壤樣品中真菌群落的α多樣性指數(shù)Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD_whole_tree均顯著高于K1區(qū)。

從樣本中隨機(jī)抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計它們所代表物種數(shù)目（即OTUs數(shù)目），以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建稀釋曲線，見圖1。K1區(qū)樣本的真菌物種稀釋曲線OUT數(shù)量在100～200逐漸趨向平坦，F(xiàn)1區(qū)樣本的真菌物種稀釋曲線OUT數(shù)量在500以上逐漸趨向平坦，說明兩區(qū)測序樣本數(shù)量合理并且數(shù)量充足，測序數(shù)量逐漸趨于飽和，且F1區(qū)真菌物種數(shù)量比K1區(qū)更豐富。將樣本中OTUs的排序編號和OTUs中的相對豐度繪制成Rank Abundance曲線，見圖2。K1區(qū)樣本的真菌等級聚類曲線的跨度較小，總OTUs數(shù)量接近200;F1區(qū)樣本的真菌等級聚類曲線的跨度較大，總OTUs數(shù)量在500～600，說明F1區(qū)的物種豐富度和均勻度均高于K1區(qū)。

2.2.2 真菌群落共有及特有OTUs分析。

將稀有的、豐度值低于全體樣本總測序量1/100 000（0.001%）的OTU去除，在全部樣本中共檢測出OTU的數(shù)量為602個，把去除稀有OTU豐度的矩陣用于后續(xù)研究。根據(jù)聚類得到OTUs結(jié)果，分析不同樣本（組）之間共有、特有的OTUs，繪制成韋恩（Venn）圖（圖3）。K1區(qū)與F1區(qū)經(jīng)研究分別檢測到185和554個OTU，其中共有OUT數(shù)為137個，K1區(qū)與F1區(qū)特有的OTU數(shù)分別為48和417個。

2.2.3 真菌物種門水平相對豐度分析。

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣本或分組在各分類水平（Phylum、Class、Order、Family、Genus）上最大豐度排名在前的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣本在不同分類水平上相對豐度較高的物種及其比例。以門水平物種相對豐度柱形圖為例展示如下（圖4），其中F1區(qū)除未知菌門（47.6%）外，依次為子囊菌門（Ascomycota）38.5%、被孢菌門（Mortierellomycota）6.8%、擔(dān)子菌門（Basidomycota）5.9%、球囊菌門（Glomeromycota）0.7%、壺菌門（Chytridiomycota）0.3%、被孢霉門（Mucoromycota）0.1%、捕蟲霉門（Zoopagomycota）0.1%;K1區(qū)以擔(dān)子菌門（Basidomycota）為主（72.2%），其次為未知菌門22.8%、子囊菌門（Ascomycota）4.1%、被孢菌門（Mortierellomycota）0.5%、壺菌門（Chytridiomycota）0.3%、捕蟲霉門（Zoopagomycota）0.1%。 K1區(qū)與F1區(qū)相比，缺少了球囊菌門和被孢霉門。

2.2.4 真菌物種屬水平豐富度分析。

為了進(jìn)一步研究屬水平物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，通過多序列比對得到top100屬的代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系（圖5）。其中，K1區(qū)鑒定出19個屬，除未知種屬24.2%外，主要為糞傘科（Bolbitiaceae）未知屬72.0%、煤炱目（Capnodiales）未知屬0.8%、毛球殼科（Lasiosphaeriaceae）Echria sp.屬0.7%、毛殼菌屬（Chaetomium sp.）0.5%、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）0.4%、青霉屬（Penicillium sp.）0.4%、被孢霉科（Mortierellaceae）未知屬0.4%、赤霉屬（Gibberella sp.）0.3%、Rhizophlyctis sp.屬0.3%;而F1區(qū)共鑒定出52個屬，除未知菌屬61.8%外，主要為赤霉屬（Gibberella sp.）8.0%、綠僵菌屬（Metarhizium sp.）6.2%、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）5.5%、青霉屬（Penicillium sp.）4.7%、被孢霉科（Mortierellaceae）未知屬3.9%、毛殼菌屬（Chaetomium sp.）3.1%、被孢霉屬（Mortierella sp.）2.8%、格孢菌目（Pleosporales）未知屬2.7%、Solicoccozyma屬1.3%。其中，煤炱目（Capnodiales）未知屬、毛球殼科（Lasiosphaeriaceae）Echria sp.屬為K1區(qū)特有菌屬，F(xiàn)1區(qū)除上述主要菌屬外，另外還包括屬于叢枝菌根的無梗囊霉屬（Acaulospora sp.）0.7%和木霉屬（Trichoderma sp.）真菌0.6%等益生菌。從以上結(jié)果可以看出，K1區(qū)和F1區(qū)群落在屬水平上差異顯著。

2.2.5 土壤真菌功能預(yù)測。

利用FunGuild真菌環(huán)境功能數(shù)據(jù)庫，基于擴(kuò)增子分析得到的物種信息，分析K1區(qū)和F1區(qū)真菌物種在環(huán)境中的生態(tài)功能，見圖6。K1區(qū)依次主要為未定功能（97.6%）、未定義腐生物（1.1%）、糞腐-未定義腐生物-木腐生物（0.5%）、植物病原-土壤-木腐生物（0.4%）、植物病原（0.3%）、動物病原（0.1%）。F1區(qū)真菌依次主要為未定功能（64.1%）、未定義腐生物（11.7%）、植物病原（8.8%）、動物病原（6.4%）、植物-病原-土壤-木腐生物（5.4%）、糞腐-未定義腐生物-木腐生物（3.0%）、叢枝菌根（0.6%）。K1區(qū)真菌功能范圍與F1區(qū)相比，K1區(qū)比F1區(qū)少11種功能，其中更是缺少了具有重要生態(tài)學(xué)功能的叢枝菌根。

2.3 土壤真菌的分離純化和分子鑒定

2.3.1 土壤真菌的分離純化。

在對土壤真菌多樣性分析的基礎(chǔ)上，對土壤中的真菌進(jìn)行分離和純化，進(jìn)一步分析土壤中可培養(yǎng)菌種的多樣性。K1區(qū)分離純化出真菌菌株97株，F(xiàn)1區(qū)分離純化出真菌菌株124株。分離所得的部分不同形態(tài)的真菌如圖7所示。

2.3.2 DNA提取、測序。

對分離的土壤真菌進(jìn)行DNA提取，部分土壤真菌rDNA ITS序列電泳圖見圖8。取各個菌種純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序。用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息。其中，K1區(qū)測序成功的菌種共78株，F(xiàn)1區(qū)測序成功的菌株98株，部分菌種序列比對結(jié)果如表3所示。

K1區(qū)測序成功菌株分屬6個種屬，分別為青霉屬（Penicillium sp.）真菌32株（42%），依次為草酸青霉（P.oxalicum）9株、微紫青霉（P.janthinellum）7株、波羅尼卡青霉（P.polonicum）5株、匍匐莖青霉（P.stoloniferum）4株、黃連青霉（P.chrysogenum）3株、拜萊青霉（P.bilaiae）2株、魯本斯青霉菌（P.rubens）1株、橘灰青霉（P.aurantiocandidum）1株;鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌22株（28%），分別為三線鐮刀菌（F.tricinctum）5株、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）4株、串珠鐮刀菌（F.verticillioides/G.moniliformis）13株;鏈格孢霉（Alternaria sp.）鏈格孢菌（A.alternata）真菌8株（10%）;曲霉屬（Aspergillus sp.）菌核曲霉（A.sclerotioniger）真菌8株（10%）;毛霉菌屬（Mucor sp.）真菌4株（5%），分別為總狀毛霉（M.racemosus）2株、脆弱毛霉（M.fragilis）2株;木霉菌屬（Trichoderma sp.）真菌4株（5%），分別為棘孢木霉（T.asperellum）2株、擬康寧木霉（T.koningiopsis）1株、哈茨木霉（T.harzianum）1株。F1區(qū)測序成功的菌株分屬6個種屬，依次為青霉菌屬（Penicillium sp.）真菌56株（57%），分別為草酸青霉（P.oxalicum）34株、黃連青霉（P.chrysogenum）12株、臥青霉（P.decumbens）5株、二毒霉青霉（P.dipodomyicola）5株;哈茨木霉（T.harzianum）真菌28株（29%）;鐮刀菌屬（Fusarium sp.）藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi）真菌5株（5%）;枝孢菌屬（Cladosporium sp.）真菌4株（4%），分別為C.Perangustum 2株、枝狀枝孢菌屬（C.cladosporioides）2株;曲霉屬（Aspergillus sp.）霉白曲霉屬（A.niveus）真菌2株（2%）;鏈格孢霉屬（Alternaria sp.）鏈格孢菌（A.alternata）真菌2株（2%）;毛孢子菌屬（Trichosporon sp.）阿薩希毛孢子菌屬（T.asahii）真菌1株（1%）。從測序結(jié)果來看，K1區(qū)和F1區(qū)分離的菌株在種類和數(shù)量上存在一定的差別。

3 討論

3.1 土壤理化性質(zhì)對真菌多樣性的影響

土壤真菌群落是

有機(jī)物質(zhì)分解和提高土壤生物質(zhì)含量的主要來源和組成部分[10]，是土壤健康的重要生物學(xué)指標(biāo)。同時，土壤中有機(jī)微

生物真菌群落的多樣性又受到了土壤有機(jī)質(zhì)、pH、C、N、P及養(yǎng)分有效性等土壤環(huán)境因素的直接影響[11]。該研究中發(fā)現(xiàn)，雖然樣品采集地具有相同的自然氣候和土壤條件，但復(fù)墾區(qū)的土壤受阜新排土場的影響，其土壤速效鉀、有效磷、pH與對照區(qū)具有顯著的差別，使其真菌的組成、數(shù)量、群落生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能也與對照區(qū)相差較大。該研究中對土壤真菌多樣性的研究及對真菌的分離純化同樣發(fā)現(xiàn)，復(fù)墾區(qū)土壤中的有益菌種類和數(shù)量均遠(yuǎn)低于對照區(qū)，而土壤中致病菌的數(shù)量和比例卻遠(yuǎn)高于對照區(qū)。因此，研究認(rèn)為復(fù)墾區(qū)土壤pH偏低等環(huán)境因素是造成土壤有益微生物真菌數(shù)量減少，有機(jī)質(zhì)分解及N、P、K、S等多種營養(yǎng)元素的生態(tài)循環(huán)能力降低，植物有害真菌滋生的重要原因，從而造成了復(fù)墾區(qū)玉米植株矮化和不結(jié)穗。因此，阜新礦區(qū)復(fù)墾區(qū)的土壤改良和生態(tài)恢復(fù)初期，還是應(yīng)該充分結(jié)合傳統(tǒng)改良和其他化學(xué)改良的方法，如適當(dāng)增施農(nóng)家肥、種植耐酸作物（主要如豆類、蕎麥等）以及適當(dāng)增加噴施石灰調(diào)節(jié)土壤的耐酸性，從而有利于改善土壤的通透性，促進(jìn)微生物的多樣性。

此外，重金屬的污染與土壤真菌的多樣性密切相關(guān)，土壤中的重金屬積累到一定程度，會嚴(yán)重影響微生物的種類和數(shù)量，進(jìn)而影響土壤的呼吸作用[12]。但某些微生物在重金屬污染的土壤中能夠生長且對重金屬具有一定的解毒作用[13]。煤礦的開采，使得礦區(qū)及周邊地區(qū)土壤重金屬污染普遍較為嚴(yán)重[14-16]，該研究從K1區(qū)分離的真菌也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。K1區(qū)分離出的紫微青霉、草酸青霉、拜萊青霉以及鏈格孢霉等都是具有土壤重金屬吸附作用的典型土壤微生物[17-18]。

3.2 復(fù)墾區(qū)與對照區(qū)真菌多樣性差異

從復(fù)墾區(qū)與對照區(qū)土壤真菌α多樣性指數(shù)和土壤真菌物種均勻度多樣性指數(shù)的曲線可以看出，F(xiàn)1區(qū)的土壤真菌物種豐富度和均勻度均明顯高于K1區(qū)。從真菌物種門水平和屬水平相對豐度分析來看，在門水平上，F(xiàn)1區(qū)真菌門數(shù)比K1區(qū)多2個門。在屬水平上，F(xiàn)1區(qū)比K1區(qū)多32個屬，F(xiàn)1區(qū)屬的分布比例相對均勻，而K1區(qū)則嚴(yán)重不平衡。其中K1區(qū)優(yōu)勢菌為糞傘科未知屬72.0%，除去未知種屬24.2%，其余種屬比例均小于1.0%。同時，K1區(qū)缺少了叢枝菌根的無梗囊霉屬和木霉屬等益生菌屬。從真菌的分離情況看，F(xiàn)1區(qū)真菌以青霉屬和木霉屬真菌為優(yōu)勢菌，K1區(qū)以青霉屬和鐮刀菌屬真菌為優(yōu)勢菌，大多數(shù)木霉菌和青霉菌為作物益生菌，而鐮刀菌是重要的致病菌。因此，K1區(qū)真菌種類少和比例的不平衡嚴(yán)重影響土壤性能和作物的生長，在利用真菌對土壤進(jìn)行改良和生態(tài)修復(fù)時應(yīng)關(guān)注增加真菌多樣性的方法和益生菌的利用。