EBAG9/RCAS1與腫瘤的關(guān)系及其免疫逃避機(jī)制的研究進(jìn)展

景敏潔，蘭麗珍

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 030001)

雖然機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視、防御、清除的作用，但腫瘤仍會對人類機(jī)體造成嚴(yán)重破壞。研究證明，腫瘤不僅是癌基因、抑癌基因突變以及異常細(xì)胞過度增生的結(jié)果，也是一種系統(tǒng)性疾病，機(jī)體免疫系統(tǒng)及其微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程中有著不容忽視的作用[1-3]。腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，包括腫瘤抗原識別分子機(jī)制、腫瘤抵抗凋亡機(jī)制以及腫瘤抑制性分子機(jī)制等。目前腫瘤患者主要接受手術(shù)、放療、化療等多學(xué)科治療，但對晚期或復(fù)發(fā)性腫瘤的抗癌治療具有一定局限性，迫切需要開發(fā)新的治療方法以改善患者的生活質(zhì)量，而腫瘤的免疫治療在腫瘤臨床治療中具有很大潛能。腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)雌激素受體結(jié)合片段相關(guān)抗原9(estrogen receptor-binding fragment-associated antigen 9，EBAG9)/SiSo細(xì)胞上表達(dá)的受體結(jié)合型腫瘤相關(guān)抗原(receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells，RCAS1)與表達(dá)相應(yīng)受體(即EBAG9/RCAS1受體)的免疫細(xì)胞結(jié)合，使免疫細(xì)胞無法監(jiān)視和清除腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)就EBAG9/RCAS1與腫瘤的關(guān)系及其免疫逃避機(jī)制的研究進(jìn)展予以綜述。

1 EBAG9和RCAS1

RCAS1最初被小鼠單克隆抗體22-1-1識別，該單克隆抗體是通過利用人子宮頸腺癌細(xì)胞系SiSo免疫小鼠產(chǎn)生，因此又可稱為22-1-1抗原[4]。EBAG9由Watanabe等[5]從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的互補(bǔ)DNA文庫中分離得到，位于染色體8q23，其啟動子上游區(qū)域包含雌激素反應(yīng)元件，而雌激素可增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。Nakashima等[6]發(fā)現(xiàn)，RCAS1和EBAG9是同一種蛋白質(zhì)，且RCAS1是一種Ⅱ型跨膜蛋白，其C端的第179～206個氨基酸構(gòu)成了螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)，位于細(xì)胞膜外，N端的第8～27個氨基酸構(gòu)成了跨膜結(jié)構(gòu)，位于細(xì)胞質(zhì)。Maeyama等[7]研究了過表達(dá)全長EBAG9或截斷EBAG9(即缺失35個C端最末端的氨基酸)在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠體內(nèi)腫瘤的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)全長EBAG9組中，所有接種小鼠的腫瘤生長均顯著加速，而在截斷EBAG9組中，腫瘤未見生長?？梢?，EBAG9的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)在促進(jìn)腫瘤生長中具有重要作用。

2 EBAG9/RCAS1與腫瘤的關(guān)系

2.1腫瘤細(xì)胞中EBAG9/RCAS1的表達(dá) EBAG9/RCAS1可表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞中，如乳腺癌[8]、卵巢癌[9]、宮頸癌[10]、膽管癌[11]、膀胱癌[12]、甲狀腺癌[13]等。王逸君等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與正常膽管組織相比，膽管癌組織中EBAG9/RCAS1的表達(dá)增加，且與不良的病理特征(如TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)相關(guān)。在食管鱗狀細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)了EBAG9/RCAS1的表達(dá)較正常食管黏膜組織增加，提示EBAG9/RCAS1與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，并與癌細(xì)胞的低分化性、侵襲性以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。Ito等[15]發(fā)現(xiàn)，未分化型甲狀腺癌組織中RCAS1的表達(dá)水平顯著高于分化型甲狀腺癌(乳頭狀癌和濾泡狀癌)組織，故認(rèn)為RCAS1的表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān)。魯笑欽等[10]發(fā)現(xiàn)，與宮頸良性病變組織相比，宮頸癌組織中RCAS1的表達(dá)顯著增加，且低分化宮頸癌組織中RCAS1的表達(dá)水平顯著高于中分化及高分化宮頸癌組織，表明RCAS1的表達(dá)與腫瘤的惡性程度及分化程度相關(guān)。Miyazaki等[16]將MB-49細(xì)胞(膀胱癌細(xì)胞)接種在EBAG9基因敲除小鼠和EBAG9陽性小鼠中發(fā)現(xiàn)，EBAG9基因敲除小鼠的膀胱癌灶體積顯著小于對照小鼠，且肺轉(zhuǎn)移灶顯著少于對照小鼠，表明EBAG9參與了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Giaginis等[17]研究表明，胃癌組織中RCAS1的高表達(dá)與組織病理分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，且高表達(dá)RCAS1胃癌患者的生存期顯著短于低表達(dá)RCAS1的患者。另有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中EBAG9/RCAS1的高表達(dá)與生存期縮短及不良預(yù)后相關(guān)[18-19]?？梢?，EBAG9/RCAS1不僅與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，還與腫瘤的惡性程度及侵襲性特征相關(guān)，如臨床分期、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，同時也與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。但有研究者認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞中EBAG9/RCAS1的高表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)[8]。

EBAG9/RCAS1是一種跨膜蛋白，在腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中均有表達(dá)。Ito等[15]發(fā)現(xiàn)，未分化型甲狀腺癌中RCAS1的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜上，而高分化型乳頭狀癌主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，推測RCAS1的表達(dá)模式與腫瘤的惡性程度相關(guān)。Szubert等[9]采用免疫組織化學(xué)方法分析卵巢癌細(xì)胞RCAS1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞質(zhì)中RCAS1高表達(dá)的患者較RCAS1低表達(dá)患者的總生存期縮短2倍以上，且癌細(xì)胞中的膜狀RCAS1不會影響患者的生存。可見，EBAG9/RCAS1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)模式不同，生物學(xué)功能也不相同。

2.2可溶性EBAG9/RCAS1的表達(dá) EBAG9/RCAS1還存在一種可溶性形式，可以在血清及胸腔積液中檢測到。Dong等[20]研究發(fā)現(xiàn)，惡性胸腔積液中RCAS1的水平顯著高于良性胸腔積液，且在最佳臨界值為7.326 U/mL時，胸腔積液RCAS1診斷的靈敏度和特異度分別為67.92%和81.63%；而Xu等[21]認(rèn)為，當(dāng)可溶性RCAS1的臨界值為9.7 U/mL時，鑒別良惡性胸腔積液的靈敏度為83.3%，特異度為91.4%，且聯(lián)合檢測胸腔積液RCAS1和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)可以提高診斷的特異度和靈敏度。王雷和郝炯[22]發(fā)現(xiàn)，與結(jié)核性胸腔積液相比，惡性胸腔積液中RCAS1的表達(dá)顯著增加，且RCAS1的表達(dá)量與癌細(xì)胞增殖活性相關(guān)基因以及侵襲性相關(guān)基因的表達(dá)量直接相關(guān)，故認(rèn)為RCAS1可作為鑒別胸腔積液惡性程度的可靠指標(biāo)。因此，胸腔積液RCAS1可用于鑒別胸腔積液的良惡性，聯(lián)合CEA將提高診斷的特異度和靈敏度。

Han等[23]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者中血清RCAS1的陽性率為82.1%，高于CEA；在CEA陰性病例中，RCAS1的靈敏度為88.2%；隨訪結(jié)直腸癌治療后的患者發(fā)現(xiàn)，血清RCAS1水平顯著降低，而復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌患者的血清RCAS1水平顯著升高。故認(rèn)為，血清RCAS1不僅可用于診斷，還可用于監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)。Szubert等[24]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者手術(shù)治療后血清可溶性RCAS1水平顯著低于治療前；通過單因素分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)前和術(shù)后可溶性RCAS1水平與子宮內(nèi)膜癌患者總生存期有關(guān)，多因素分析顯示，術(shù)后高可溶性RCAS1水平是子宮內(nèi)膜癌總生存期縮短的獨(dú)立預(yù)后因素，但術(shù)前與術(shù)后可溶性RCAS1水平的差異并不影響患者的總生存期，因此血清RCAS1可用于評估治療效果，且術(shù)后可溶性RCAS1水平與不良預(yù)后相關(guān)。Xu等[25]認(rèn)為，對于非小細(xì)胞肺癌患者，當(dāng)血清RCAS1的臨界值為19.8 U/mL時，靈敏度為87.6%，特異度為82.5%，準(zhǔn)確率為86.1%；單因素分析顯示，血清RCAS1水平升高的非小細(xì)胞肺癌患者總生存期顯著短于良性肺疾病及健康者；而多因素分析認(rèn)為，可溶性RCAS1是獨(dú)立的預(yù)后因素，表明可溶性EBAG9/RCAS1是癌癥有價值的生物標(biāo)志物，可用于協(xié)助診斷、評估治療效果、監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)以及預(yù)測不良預(yù)后。因此，作為臨床指標(biāo)，可溶性EBAG9/RCAS1較膜分子EBAG9/RCAS1更為有價值，因為血液及胸腔積液在臨床上很容易采樣。

2.3腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中EBAG9/RCAS1的表達(dá) 腫瘤微環(huán)境不僅包括腫瘤細(xì)胞本身，還包括腫瘤基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子等，與腫瘤發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[26]。然而，在許多浸潤腫瘤基質(zhì)的非癌細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)了EBAG9/RCAS1的表達(dá)，如腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[27]。EBAG9/RCAS1可通過巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對腫瘤基質(zhì)浸潤的影響，參與腫瘤微環(huán)境的重塑[9]。Józ＇wicki等[12]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌細(xì)胞中RCAS1的表達(dá)與腫瘤分期和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，與腫瘤分級、組織侵襲類型及非經(jīng)典分化數(shù)無顯著相關(guān)，但腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的RCAS1表達(dá)與腫瘤分級、組織侵襲類型及非經(jīng)典分化數(shù)均顯著相關(guān)。另有研究表明，在具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢腫瘤中，巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中RCAS1高表達(dá)[28]。可見，腫瘤的侵襲性特征不僅與腫瘤細(xì)胞中RCAS1的表達(dá)相關(guān)，還可能與腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞中RCAS1的過表達(dá)相關(guān)。然而，Galazka等[29]證明，RCAS1在宮頸癌基質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤分級無關(guān)，不會影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Szubert等[9]研究表明，癌細(xì)胞質(zhì)中RCAS1高表達(dá)對患者的生存期有影響，但腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的RCAS1表達(dá)對患者的生存期無影響。因此，EBAG9/RCAS1在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)的臨床意義仍需進(jìn)一步研究。

3 EBAG9/RCAS1逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視和清除的機(jī)制

腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一[30]，而EBAG9/RCAS1與腫瘤免疫逃避相關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)，EBAG9/RCAS1過表達(dá)可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞)凋亡[6,31-32]，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除。另外，EBAG9/RCAS1還可通過抑制T細(xì)胞的細(xì)胞毒性來實現(xiàn)腫瘤免疫逃避。

3.1膜分子形式EBAG9/RCAS1誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制 以往研究表明，免疫細(xì)胞(如T、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)表達(dá)RCAS1受體，特別是當(dāng)這些免疫細(xì)胞被激活時，腫瘤細(xì)胞中RCAS1與表達(dá)相應(yīng)受體的免疫細(xì)胞結(jié)合，通過激活白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶樣蛋白酶來抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡性死亡，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視而不斷發(fā)展，且RCAS1通過細(xì)胞表面的卷曲螺旋區(qū)域與表達(dá)RCAS1受體的免疫細(xì)胞結(jié)合[6]。而Maeyama等[7]發(fā)現(xiàn)，EBAG9的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)在促進(jìn)腫瘤生長中有重要作用。由此推測，EBAG9/RCAS1可能通過卷曲螺旋結(jié)構(gòu)與表達(dá)相應(yīng)受體的免疫細(xì)胞結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清掃，促使腫瘤不斷生長。此后，不斷有學(xué)者研究RCAS1誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)受體以及誘導(dǎo)受體細(xì)胞凋亡和生長抑制的可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，RCAS1過表達(dá)可誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞、白血病細(xì)胞系衍生的免疫細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步使用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-RCAS1融合蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，在K562細(xì)胞、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激后的Jurkat細(xì)胞中表達(dá)RCAS1受體，同時發(fā)現(xiàn)RCAS1可在體外抑制K562細(xì)胞及PHA刺激后的Jurkat細(xì)胞的生長，提示RCAS1可能通過與RCAS1受體結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；另外，RCAS1抑制細(xì)胞生長的機(jī)制可能與糖原合酶激酶3β的下調(diào)有關(guān)[32]。Nishinakagawa等[33]研究發(fā)現(xiàn)，RCAS1通過特異性下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D3誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期生長停滯；同時，RCAS1可誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放并激活胱天蛋白酶(caspase)3，而caspase-8(與死亡受體途徑相關(guān))未被激活，由此得出RCAS1通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.2EBAG9/RCAS1通過脫落形式誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制 已知，EBAG9/RCAS1存在一種可溶性形式，即膜分子形式的EBAG9/RCAS1經(jīng)過蛋白水解后胞外域脫落轉(zhuǎn)換成可溶性蛋白，可溶性EBAG9/RCAS1也參與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡[34]。Sonoda和Kato[35]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)相比，解整合素金屬蛋白酶9(recombinant A disintegrin and metalloprotease 9，ADAM9)在SiSo細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高，且沒有發(fā)現(xiàn)其他強(qiáng)表達(dá)信號的蛋白酶在SiSo細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞之間呈現(xiàn)顯著差異；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用ADAM9小干擾RNA轉(zhuǎn)染的SiSo細(xì)胞表面顯示出ADAM9表達(dá)受到抑制，并顯示出RCAS1表達(dá)增加，而培養(yǎng)的上清液中RCAS1的表達(dá)量顯著降低；另一方面，用ADAM9互補(bǔ)DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面顯示出ADAM9表達(dá)上調(diào)，而RCAS1表達(dá)顯著減少，故認(rèn)為ADAM9加速了RCAS1的脫落；同時發(fā)現(xiàn)，47例宮頸癌和48例子宮內(nèi)膜癌患者的血清RCAS1水平均以依賴RCAS1和ADAM9表達(dá)的方式而升高或降低，這些結(jié)果進(jìn)一步支持ADAM9參與人宮頸癌中RCAS1脫落，且脫落的RCAS1誘導(dǎo)了K562細(xì)胞的凋亡。綜上可知，RCAS1主要通過脫落形式誘導(dǎo)表達(dá)RCAS1受體的細(xì)胞凋亡，而ADAM9參與了RCAS1胞外域的脫落。

3.3EBAG9/RCAS1抑制免疫細(xì)胞毒性的可能機(jī)制 T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性對于免疫監(jiān)測和體內(nèi)平衡至關(guān)重要，通過與靶細(xì)胞接觸產(chǎn)生脫顆粒，使包括穿孔素和顆粒酶在內(nèi)的顆粒成分進(jìn)入靶細(xì)胞導(dǎo)致其死亡。Miyazaki等[16]發(fā)現(xiàn)，與EBAG9陽性膀胱癌小鼠相比，EBAG9基因敲除膀胱癌小鼠中浸潤的CD8+、CD3+和CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而將EBAG9基因敲除小鼠的CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至野生型膀胱癌小鼠后，顯著抑制了腫瘤的生長，由此認(rèn)為EBAG9通過參與抑制CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，從而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除；成熟CD8+T細(xì)胞的脫粒是穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)的靶細(xì)胞殺傷的必要過程，EBAG9的缺失增加了CD8+T細(xì)胞中脫粒標(biāo)志物CD107(一種與細(xì)胞脫粒相關(guān)的蛋白)的表達(dá)，這表明EBAG9參與腫瘤浸潤性T細(xì)胞中溶解顆粒內(nèi)體運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)；同時他們還發(fā)現(xiàn)，EBAG9基因敲除組小鼠中白細(xì)胞介素-10受體的表達(dá)水平高于對照組。而白細(xì)胞介素-10可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性，發(fā)揮抗腫瘤的作用[36]。這些結(jié)果表明，EBAG9可負(fù)調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而EBAG9功能的喪失激活了白細(xì)胞介素-10/白細(xì)胞介素-10受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

EBAG9過表達(dá)可能通過產(chǎn)生與腫瘤相關(guān)的O-連接的聚糖Tn抗原(如22.1.1抗原)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的抗原性[37]。研究表明，腫瘤細(xì)胞通常會分泌大量細(xì)胞外囊泡(包括外泌體)到其微環(huán)境中，起細(xì)胞間通訊及分子轉(zhuǎn)移的介質(zhì)作用，在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中有重要作用[38-39]。Miyazaki等[40]研究發(fā)現(xiàn)，EBAG9過表達(dá)的前列腺癌來源的細(xì)胞外囊泡中含有EBAG9蛋白，而EBAG9蛋白抑制了T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并下調(diào)了免疫相關(guān)基因(如γ干擾素、白細(xì)胞介素-10受體、顆粒酶B以及CXC趨化因子受體3)的表達(dá)，從而達(dá)到腫瘤免疫逃避的目的。此外，核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤來源的細(xì)胞外囊泡調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中也起重要作用[41]。

4 小 結(jié)

目前，有幾種治療策略可抑制EBAG9/RCAS1的表達(dá)和功能。第一種治療策略是使用小干擾RNA干擾RCAS1的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性小干擾RNA可減少T淋巴細(xì)胞凋亡，使腫瘤消退[42-43]；第二種治療策略是阻斷EBAG9/RCAS1誘導(dǎo)免疫細(xì)胞生長抑制或凋亡所參與的可能信號通路，即干預(yù)細(xì)胞周期D3蛋白的表達(dá)或采用caspase抑制劑阻斷線粒體通路，從而抑制EBAG9/RCAS1誘導(dǎo)免疫細(xì)胞生長抑制或凋亡；第三種治療策略是阻斷ADAM9介導(dǎo)的EBAG9/RCAS1胞外域脫落，但這一機(jī)制尚需進(jìn)一步證實。因此，研究EBAG9/RCAS1參與逃避免疫系統(tǒng)的具體機(jī)制對癌癥治療的新策略有重要作用，但目前確切機(jī)制尚不明確需進(jìn)一步研究。