光學微操縱過程的軸平面顯微成像技術(shù)?

安莎1)2) 彭彤1)2) 周興1)2) 韓國霞1) 黃張翔1) 于湘華1) 蔡亞楠1)2)姚保利1)? 張鵬1)?

1)(中國科學院西安光學精密機械研究所,瞬態(tài)光學與光子技術(shù)國家重點實驗室,西安 710119)2)(中國科學院大學,北京 100049)(2016年7月21日收到;2016年9月6日收到修改稿)

光學微操縱過程的軸平面顯微成像技術(shù)?

安莎1)2) 彭彤1)2) 周興1)2) 韓國霞1) 黃張翔1) 于湘華1) 蔡亞楠1)2)姚保利1)? 張鵬1)?

1)(中國科學院西安光學精密機械研究所,瞬態(tài)光學與光子技術(shù)國家重點實驗室,西安 710119)2)(中國科學院大學,北京 100049)(2016年7月21日收到;2016年9月6日收到修改稿)

光學俘獲技術(shù)利用光與物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的光勢阱效應(yīng)來實現(xiàn)對微粒的操控,已經(jīng)成功應(yīng)用于生物醫(yī)學、材料科學等交叉領(lǐng)域.在對微粒進行三維俘獲時,傳統(tǒng)的寬場光學顯微技術(shù)只能觀測到某一平面內(nèi)微粒的橫向運動,對微粒沿軸向運動的觀測受到很大限制.本文將軸平面顯微成像技術(shù)引入光學微粒操控研究中,利用45?傾斜的反射鏡把微粒的軸向運動信息轉(zhuǎn)換到橫向平面進行觀測,與傳統(tǒng)寬場顯微成像技術(shù)相結(jié)合,實現(xiàn)了對二氧化硅小球俘獲過程橫向和軸向運動的同步觀測.該成像方法無需掃描和數(shù)據(jù)重構(gòu),具有實時快速等優(yōu)點,在新型光束光鑷、厚樣品三維觀測和成像等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值.

軸平面成像,光學微操縱,光學俘獲,光學顯微成像

1引 言

光鑷利用光與物質(zhì)間動量傳遞的力學效應(yīng)形成的三維梯度光學勢阱實現(xiàn)對微粒的操控.自1986年Ashkin等[1]首次提出并實現(xiàn)利用光強梯度力俘獲和操縱微粒的光鑷概念以來,經(jīng)歷了30年的積累和發(fā)展,光學微操縱技術(shù)憑借其非接觸、無機械損傷、精確操作定位等獨特優(yōu)勢,在物理化學、生物醫(yī)學、材料科學等眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,并逐漸成為相關(guān)學科研究者們不可或缺的研究工具.

近年來,隨著光場調(diào)控技術(shù)的不斷進步,基于貝塞爾光束[2,3]、艾里光束[4?6]等具有無衍射、自愈合特性的新型光束[7?10]的相關(guān)技術(shù)也不斷發(fā)展,將自加速光束引入光學俘獲成為新的研究方向,其獨特優(yōu)勢是能夠?qū)崿F(xiàn)沿特定彎曲軌跡對微粒的操控.2013年,Zhang等[11]利用多個艾里光束的疊加產(chǎn)生了光學瓶子光束,并以此實現(xiàn)了對多個微粒的穩(wěn)定俘獲,其軸向信息的獲取由一系列垂直于光軸的二維圖像重構(gòu)完成,精度和速度受到限制;2014年,Schley等[12]設(shè)計的抗損耗自加速光束可以在吸收介質(zhì)中傳播任意距離,且保持光束主瓣輪廓及強度不變,并首次利用該光束實現(xiàn)了對微粒的非傍軸微操縱,但微粒沿軸向運動的觀測需要借助垂直于光軸的顯微物鏡,這使得該技術(shù)在大數(shù)值孔徑物鏡系統(tǒng)中的應(yīng)用受到限制.傳統(tǒng)的寬場光學顯微技術(shù)可以對物鏡焦平面附近垂直于光軸的樣品截面成像[13,14],但人們同樣對平行于光軸的樣品截面信息感興趣,這就需要發(fā)展能夠直接獲取樣品軸向信息的顯微成像技術(shù).2008年,Dunsby[15]提出了一種斜平面顯微成像技術(shù),該技術(shù)能夠?qū)悠返碾x焦面成像,但受光學結(jié)構(gòu)等因素限制,對樣品軸向信息的獲取能力有限,從而影響了該技術(shù)的應(yīng)用和推廣.此外,激光掃描共聚焦顯微[16,17]、寬場熒光層析顯微[18]等技術(shù)均可實現(xiàn)對樣品的三維成像,但需要依托掃描系統(tǒng),限制了成像速度.2014年,Li等[19,20]提出了軸平面光學顯微成像技術(shù),該技術(shù)利用一個45°傾斜的反射鏡把樣品的軸向信息轉(zhuǎn)換到橫向進行觀測.該方法已成功應(yīng)用到生物組織顯微觀察中,實現(xiàn)了對小鼠大腦切片的成像.

本文將軸平面光學顯微成像技術(shù)與光學微操縱技術(shù)相結(jié)合,以實現(xiàn)對光學俘獲過程的三維實時觀測.以橫向重疊無法分辨的兩個微粒作為觀察目標,根據(jù)45°傾斜反射鏡對樣品兩個正交截面信息的轉(zhuǎn)換原理,以軸向可分辨這兩個微粒作為實現(xiàn)軸平面成像的判斷標準.理論模擬擴束準直透鏡位置對聚焦光斑軸向調(diào)控距離的影響,并利用軸平面光學成像技術(shù)對此進行實驗驗證,實驗結(jié)果表明軸向可調(diào)控范圍約為20μm,與模擬結(jié)果相符.利用寬場顯微成像技術(shù)對微粒的橫向俘獲過程進行觀測,同時利用軸平面顯微成像技術(shù)觀測俘獲微粒的軸向運動過程,實時、快速地實現(xiàn)了對俘獲過程中微粒橫向和軸向運動的同步觀測,并達到了約30μm的軸向動態(tài)觀測范圍.該方法無需掃描和數(shù)據(jù)重構(gòu)即可獲取物體的軸平面信息.

2實驗方法

為實現(xiàn)軸平面成像系統(tǒng)對微粒軸向俘獲的觀測,我們設(shè)計并搭建了如圖1(a)所示的光路.半導體激光器(λ=650nm)出射的激光通過透鏡L1(f1=50mm)、L2(f2=100mm)組成的擴束準直系統(tǒng)后,經(jīng)過分束鏡BS1后到達物鏡Obj1(南京英星公司,100×,NA=1.25,油鏡),在其焦平面會聚并俘獲微粒.藍光LED(中心波長λ=480nm)用于系統(tǒng)照明,其發(fā)出的光經(jīng)物鏡Obj1收集后由BS1反射,通過透鏡L3,L4(f3=f4=200mm)組成的4f系統(tǒng)后到達另一分束鏡BS2.經(jīng)過該分束鏡后光被分為兩部分,一部分經(jīng)成像透鏡L5(f5=75mm)后,在CCD1上對樣品橫向(x-y平面)信息成像,另一部分經(jīng)過與Obj1完全相同的物鏡Obj2后在其焦平面成像.物鏡Obj2焦平面附近放置一個45°傾斜的反射鏡M,該反射鏡將樣品軸向(x-z平面)信息轉(zhuǎn)換到橫向(x-y平面)并通過透鏡L6(f6=75mm)成像在CCD2上,從而直接觀測到樣品的軸向信息.實驗中使用的兩個CCD(德國Imaging Source公司,DMK23G445)均為1280×960像素,幀速率最高30幀/s.此外,F為截止波長500nm的短波通濾光片,能夠保證在照明光通過的前提下濾掉俘獲激光,L2的另一作用是通過調(diào)節(jié)其軸向位置來改變激光經(jīng)過Obj1后的光場聚焦位置,從而操控微粒沿軸向移動.

圖1(b)所示為軸平面成像的原理,Obj1焦平面附近不同軸向深度的三個點1,2,3經(jīng)過系統(tǒng)后成像于Obj2焦平面附近,該像經(jīng)45°傾斜的反射鏡M反射后轉(zhuǎn)換為橫向鏡像的1′,2′,3′三個點,再經(jīng)Obj2及透鏡L6組成的成像系統(tǒng)后將軸向信息轉(zhuǎn)換為橫向并成像于CCD2的探測面上.

圖1 (網(wǎng)刊彩色)光學俘獲軸平面顯微成像系統(tǒng)裝置 (a)實驗光路圖;(b)軸平面成像原理圖;不同顏色的1,2,3點代表不同軸向深度的位置;L1—L6,透鏡;BS1,BS2,分束鏡;Obj1,Obj2,顯微物鏡100×/NA1.25;F,短波通濾光片(截止波長500nm);M,反射鏡Fig.1.(color online).Optical system for observing particle trapping with the axial plane optical microscopy(APOM).(a)Experimental setup;(b)schematics showing the principle of the APOM.Points 1,2,3in di ff erent colors represent corresponding positions at di ff erent axial depths.L1–L6,lens;BS1,BS2,beam splitter;Obj1,Obj2,objective lens 100×/NA1.25;F,short-pass fi lter(cut-o ffwavelength 500nm);M,mirror.

為實現(xiàn)軸平面成像,需要將反射鏡M傾斜45°,這就對顯微物鏡的數(shù)值孔徑NA提出了一定要求.如圖2所示,紅色線條代表入射光線,綠色線條代表反射光線,α為物鏡的半孔徑角,θ為反射鏡M與光軸的夾角.圖2(a)中,當α＜θ時,所有入射光線經(jīng)M反射后偏離光軸,無法被Obj收集參與成像;圖2(b)中,當α＞θ時,部分入射光線經(jīng)M反射后進入Obj參與成像,此時反射鏡M可將樣品軸向信息轉(zhuǎn)換為橫向進行觀測,從而實現(xiàn)軸平面成像.

圖2 (網(wǎng)刊彩色)物鏡數(shù)值孔徑和成像關(guān)系示意圖(a)α ＜ θ;(b)α ＞ θ;Obj,顯微物鏡;M,反射鏡;α,半孔徑角;θ,M傾角;紅色代表入射光線,綠色代表反射光線Fig.2.(color online).Diagrams showing the e ff ect of Objective NA on the imaging process:(a)α ＜ θ;(b)α ＞ θ.M,mirror;α,half aperture angle;θ,tilted angle of M.The red and green lines represent the incident rays and re fl ected rays,respectively.

根據(jù)圖2所示,為實現(xiàn)軸平面成像,顯微物鏡的NA以及反射鏡傾角需滿足以下關(guān)系:

式中n為介質(zhì)折射率,α為物鏡的半孔徑角,θ為反射鏡M與光軸的夾角.實驗中,我們采用油浸物鏡,其n=1.52,θ=45°,為滿足成像關(guān)系,需要NA＞1.07.我們采用的顯微物鏡NA=1.25,大于臨界值,滿足(1)式關(guān)系.理論上物鏡數(shù)值孔徑越大,參與成像的有效光線越多,成像質(zhì)量越好.但是,一般而言,物鏡的NA越大,相應(yīng)的工作距離越短,所以實驗中要根據(jù)實際情況權(quán)衡物鏡NA與工作距離這兩個因素.

為實現(xiàn)對微粒軸向運動的觀測,我們通過沿光軸移動透鏡L2來調(diào)控俘獲位置,從而達到軸向移動微粒的目的.為了驗證該調(diào)控方法的可行性,我們采用Zemax光學設(shè)計軟件進行了模擬,如圖3(a)所示.為了獲得較大的聚焦點軸向移動距離,我們選L2為f2=50mm的透鏡(若選f2=100mm,L2移動10mm,則聚焦點軸向移動距離只有約5μm),即模型采用兩個焦距均為50mm的透鏡和一個數(shù)值孔徑NA=1.25的油浸顯微物鏡組成,其中,d為透鏡L2和物鏡Obj1入瞳之間的距離,u為物鏡Obj1前表面到光束聚焦點(俘獲位置)的距離.L1,L2的初始距離為100mm,L2與Obj1的初始距離為50mm,沿光軸方向移動L2,觀測俘獲位置的變化,模擬結(jié)果如圖3(b)所示.可以看出,在d=50mm±5mm范圍內(nèi),透鏡L2的移動距離與俘獲位置的移動距離之間近似為線性關(guān)系,L2移動10mm,相應(yīng)俘獲位置移動約20μm,模擬結(jié)果證明可以通過透鏡L2調(diào)控俘獲位置.

圖3 俘獲位置調(diào)控模擬結(jié)果 (a)Zemax光學設(shè)計軟件中的模型,d為透鏡L2到顯微物鏡Obj1入瞳的距離,u為物鏡前表面到光束聚焦點的距離;(b)u與d的關(guān)系曲線Fig.3.Simulation results of the optical trapping position:(a)Zemax model,d is the distance between L2and the pupil plane of Obj1,and u is the distance between the front surface of Obj1and beam focus;(b)the relationship between u and d.

3結(jié)果與討論

為驗證軸平面成像結(jié)果,采用如圖1(a)所示的實驗光路,我們首先沿光軸方向同時俘獲兩個微粒,然后通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)中45°傾斜的反射鏡M,在CCD1和CCD2上同時觀測俘獲微粒.圖4為軸向同時俘獲兩個SiO2小球時的成像結(jié)果.從x-y平面觀測時,1,2兩個小球相互重疊不可分辨(圖4(a)).利用軸平面成像系統(tǒng),可以直接對其軸向進行成像,結(jié)果如圖4(b)所示,可以看出在橫向兩個無法分辨的小球在軸向可清晰分辨,該結(jié)果可以作為實現(xiàn)軸平面成像的判斷標準.

在實現(xiàn)軸平面顯微成像后,我們利用該系統(tǒng)觀測了光鑷對微粒的俘獲過程.圖5為光俘獲微粒的軸向運動過程.其中,圖5(a)—(e)為微粒不同時刻的x-y平面成像結(jié)果,圖5(f)—(j)為相應(yīng)的軸平面成像結(jié)果(x-z平面).從圖中可看出,當微粒沿光軸方向運動時,沿橫向(x-y平面)觀測,其成像結(jié)果表現(xiàn)為微粒在同一位置上清晰程度的變化,而用軸平面成像方法觀測微粒軸向(x-z平面)運動時,成像結(jié)果表現(xiàn)為微粒的橫向運動,且沿這一方向運動的范圍約為30μm.將該技術(shù)可以應(yīng)用于光學負向力[21?24]的研究,通過軸平面成像結(jié)果中微粒的運動方向就可以判斷光對微粒作用力的方向.

圖4 軸平面顯微成像實驗結(jié)果 (a)軸向同時俘獲兩個微粒(1和2)的x-y平面成像結(jié)果;(b)利用軸平面系統(tǒng)觀測的對應(yīng)(a)的x-z平面成像結(jié)果;微粒為5μm直徑的SiO2小球,標尺10μmFig.4.Experimental demonstration of the APOM in optical trapping:(a)The x-y plane image of two overlapping particles(1and 2);(b)the x-z plane image of the two particles.Particles:SiO2beads(5μm in diameter);scale bar:10μm.

圖5 光學俘獲微粒動態(tài)過程的軸平面顯微成像實驗結(jié)果 (a)—(e)x-y平面觀測的光俘獲單個微粒的運動過程;(f)—(j)x-z平面觀測的分別對應(yīng)(a)—(e)的俘獲微粒運動過程;微粒為5μm直徑的SiO2小球,標尺 10μmFig.5.Experimental observation of particle trapping dynamics along beam trajectories with the APOM:(a)–(e)The x-y plane images of a single trapped particle at di ff erent time;(f)–(j)the x-z plane images corresponding to Figs.(a)–(e).Particles:SiO2beads(5 μm in diameter);scale bar:10 μm.

為實現(xiàn)軸平面成像技術(shù)下對微粒軸向操控的觀測,在圖1(a)的光路中,將L2換為f2=50mm的透鏡,通過軸向調(diào)節(jié)透鏡L2來改變俘獲位置.實驗結(jié)果如圖6所示,其中圖6(a)—(c)為通過軸向移動透鏡L2得到的三個不同位置處微粒x-y平面的成像結(jié)果,圖6(d)—(f)為分別對應(yīng)圖6(a)—(c)微粒的x-z平面成像結(jié)果.從圖中可以看出,當微粒沿軸向運動時,在x-y平面直接觀測的成像結(jié)果表現(xiàn)為微粒由模糊變清晰再變模糊,而利用軸平面成像技術(shù),其x-z平面成像結(jié)果表現(xiàn)為微粒的橫向移動.實驗中,沿不同方向移動透鏡L2,相應(yīng)的軸平面結(jié)果顯示微粒也隨之改變運動方向.

本實驗中,我們通過移動透鏡L2來調(diào)節(jié)俘獲光場的位置,但這一方法可以調(diào)節(jié)的范圍有限.當L2的位置改變10mm時,俘獲焦點的位置變化約為20μm,這與模擬結(jié)果以及文獻[25]中的理論分析相符.實驗中,為了達到穩(wěn)定俘獲效果,需要保證入射光斑充滿物鏡入瞳,但若想要進一步增大俘獲位置的軸向移動,則需在較大范圍內(nèi)改變透鏡L2的軸向位置,這又會使物鏡入瞳處光斑半徑發(fā)生變化,影響光場分布,從而導致光鑷的俘獲能力下降.

圖6 不同俘獲位置的軸平面顯微成像實驗結(jié)果 (a)—(c)不同俘獲位置的x-y平面成像結(jié)果;(d)—(f)對應(yīng)圖(a)—(c)的軸平面(x-z平面)成像結(jié)果;微粒為5μm直徑的SiO2小球,標尺 10μmFig.6.APOM imaging of particle trapped at di ff erent axial positions:(a)–(c)The x-y plane images of a single particle trapped at di ff erent axial positions;(d)–(f)the x-z plane images corresponding to Figs.(a)–(c);Particles:SiO2beads(5 μm in diameter);scale bar 10μm.

4結(jié) 論

本文將光學俘獲、寬場顯微成像系統(tǒng)和軸平面顯微成像技術(shù)相結(jié)合,實現(xiàn)了對光學微操縱過程的三維實時觀測.利用Zemax光學設(shè)計軟件模擬了俘獲光場焦點位置變化對微粒操控的影響.通過軸平面成像技術(shù),成功實現(xiàn)了光學俘獲過程中對微粒橫向和軸向運動的同步觀測.該方法無需掃描和數(shù)據(jù)重構(gòu),具有實時快速等優(yōu)點,在新型光束光鑷、厚樣品三維觀測和成像等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值.

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PACS:07.60.–j,42.65.Jx,87.64.M–,87.80.CcDOI:10.7498/aps.66.010702

*Project supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.11574389,81427802).

?Corresponding author.E-mail:yaobl@opt.ac.cn

?Corresponding author.E-mail:pengzhang@opt.ac.cn

Observation of particle manipulation with axial plane optical microscopy?

An Sha1)2)Peng Tong1)2)Zhou Xing1)2)Han Guo-Xia1)Huang Zhang-Xiang1)Yu Xiang-Hua1)Cai Ya-Nan1)2)Yao Bao-Li1)?Zhang Peng1)?

1)(State Key Laboratory of Transient Optics and Photonics,Xi’an Institute of Optics and Precision Mechanics,Chinese Academy of Sciences,Xi’an 710119,China)2)(University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)(Received 21 July 2016;revised manuscript received 6 September 2016)

Optical micromanipulation of particles based on the optical trapping e ff ect induced by the interaction between light and particles has been successfully applied to many interdisciplinary fi elds including biomedicine and material sciences.When particles are trapped in three dimensions,the conventional wide- fi eld optical microscopy can only monitor the movement of the trapped particles in a certain transverse plane.The ability to observe the particle movement along light trajectories is limited.Recently,a novel method named axial plane optical microscopy(APOM)has been developed to directly image the axial plane that is parallel to the optical axis of an objective lens.The APOM observes the axial plane by converting the axial information of a sample into that of a transverse plane by using a 45?-tilted mirror.In this paper,we propose and demonstrate that the APOM serves as an e ff ective tool for observing the axial movement of particles in optical tweezers.By combining with a conventional wide- fi eld optical microscopy,we show that both transverse and axial information can be acquired simultaneously for the optical micromanipulation.As in our fi rst experimental demonstration,we observe two particles which are trapped and aligned along the optical axis.From the transverse image,only one particle is observable,and it is difficult to obtain the information along the axial direction.However,in the axial plane imaging,the longitudinal dipolar structure formed by the two particles is clearly visible.This clearly demonstrates the APOM imaging capability along the axial axis.The numerically simulations on the trapping focal spot against the position of a collimating lens agree well with our experimental APOM results.Furthermore,we directly observe the dynamic capture process of a single trapped particle in transverse plane by conventional wide- fi eld optical microscopy as well in axial plane by the APOM,and can obtain the 3D information rapidly and simultaneously.We point out that the observable axial dynamic range is about 30μm.Taking advantages of no requirement of scanning and data reconstruction,the APOM has potential applications in many fi elds,including optical trapping with novel beams and 3D imaging of thick biological specimens.

axial plane imaging,optical micromanipulation,optical trapping,optical microscopy

10.7498/aps.66.010702

?國家自然科學基金(批準號:11574389,81427802)資助的課題.

?通信作者.E-mail:yaobl@opt.ac.cn

?通信作者.E-mail:pengzhang@opt.ac.cn