高原地區(qū)宮頸癌患者血清mir-210表達(dá)與HPV感染及Th17/Treg平衡的關(guān)系

白志興

宮頸癌屬于常見婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率、死亡率較高，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。人類乳頭瘤病毒(human papillomaviruses,HPV)長(zhǎng)期潛伏在生殖道，當(dāng)機(jī)體免疫下降后引發(fā)腫瘤，一部分患者持續(xù)感染則會(huì)引發(fā)宮頸癌，已有研究證實(shí)HPV感染是造成宮頸癌的明確致病因素之一[2]。除宮頸癌感染外，還有其他遺傳相關(guān)因子參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。microRNA屬于非編碼RNA，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲等發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，mir-210作為microRNA之一，在多種實(shí)體瘤呈高表達(dá)，然而目前mir-210與宮頸癌HPV感染的關(guān)系尚不明確[3,4]。有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者HPV免疫逃逸與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，免疫細(xì)胞Th17/Treg細(xì)胞失衡在其中具有重要的作用[5]。本研究通過檢測(cè)宮頸癌患者血清mir-210表達(dá)，分析其與HPV感染、免疫功能的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年2月至2019年4月在我院進(jìn)行治療的85例青海高原地區(qū)宮頸癌患者作為研究對(duì)象(宮頸癌組)，年齡37～75歲，平均年齡(55.31±12.25)歲；根據(jù)國(guó)際產(chǎn)婦科聯(lián)盟(FIGO)腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)，其中ⅠA～ⅡA期39例，ⅡB～Ⅳ期46例。鱗癌患者62例，腺癌患者23例。另選擇在我院由于其他良性腫瘤進(jìn)行子宮切除術(shù)的76例正常者作為對(duì)照組，年齡36～72歲，平均年齡(54.26±11.87)歲。2組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)；(2)術(shù)前未接受過化療、放療或其他治療；(3)所有受試者者知情同意；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其它部位惡性腫瘤；(2)自身免疫疾病者；(3)心、肝、腎等重要器官障礙；(4)合并慢性高血壓、糖尿病等；(5)妊娠、哺乳期。

1.3 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(R1200)購自美國(guó)Solarbio 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622)購自美國(guó)Thermo公司；qPCR反應(yīng)試劑盒(RR390B)購于日本Taraka公司；白介素-17(Interleukins-17，IL-17)(ab73202)、白介素-10(Interleukins-10，IL-10)(ab33471)抗體購于英國(guó)Abcam公司；IL-17(JKSJ-1316)、IL-10檢測(cè)試劑盒[JK-(a)-2145]購自上海晶抗生物工程有限公司；HPV核酸擴(kuò)增試劑盒購于廣東凱普生物科技股份有限公司，批號(hào)：20180418；基因自DNA提取試劑盒(K281-50)購于美國(guó)BioVision公司；流式細(xì)胞儀(ALTRA)購自美國(guó)Beckman公司；酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bench Mark Plus)購自美國(guó)Bio-Rad公司；PCR儀器(7500型)購自美國(guó)ABI公司。

1.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)檢測(cè)所有受試者miR-210表達(dá) 所有受試者入院后用抗凝管采集外周靜脈血5 ml，3 000 g離心后收集上層血清置于-80℃保存。血液中總RNA提取參考RNA提取試劑盒說明書操作，核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度及濃度后，將RNA參照試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqII(2×)12.5 μl，上下游引物分別為1 μl，模板 2 μl，dH2O 8.5 μl，總量 25 μl。 PCR 程序設(shè)置：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性 10 s,58℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法定量分析miR-210相對(duì)表達(dá)量。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)檢測(cè)血清中IL-17A、IL-10水平 設(shè)定待測(cè)樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照孔，每孔設(shè)定3個(gè)重復(fù)，空白孔內(nèi)僅添加TMB顯色液及終止液。每個(gè)包被孔中均加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，充分混勻后，37℃孵育2 h，充分洗滌、印干后加入100 μl生物素化的抗人IL-17A、IL-10 抗體工作液，充分混勻后置 37℃ 1 h，清洗、晾干后添加100 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的 Streptavidin抗體工作液 。室溫下孵育0.5 h清洗后加入100 μl TMB工作液， 37℃暗避光條件下進(jìn)行15 min 顯色反應(yīng)，加入100 μl終止液混勻，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)品曲線，根據(jù)所測(cè)吸光值，計(jì)算初始樣品中IL-17A、IL-10水平。

1.7 宮頸HPV篩查 在宮頸癌患者宮頸部位放置宮頸刷，旋轉(zhuǎn)5～10圈后收集宮頸口附近脫落細(xì)胞，在保存液中保存，將收集到的細(xì)胞經(jīng)2 000 g離心后5 min舍棄上清，提取DNA，根據(jù)試劑盒進(jìn)行HPV檢測(cè)，當(dāng)結(jié)果為清晰可見的藍(lán)紫色原點(diǎn)則代表陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 正常、宮頸癌患者血清mir-210表達(dá)、Th17和Treg比率比較 與正常組比較，宮頸癌組患者血清mir-210表達(dá)、Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清mir-210、Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例比較

2.2 宮頸癌HPV感染者血清mir-210表達(dá) 與HPV陰性組比較，HPV陽性組患者血清mir-210表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 宮頸癌HPV感染者Th17/Treg細(xì)胞、IL-17、IL-10水平 與HPV陰性組比較，HPV陽性組患者血清Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例、IL-17、IL-10因子水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 宮頸癌HPV感染、未感染組患者血清mir-210表達(dá)比較

表3 宮頸癌HPV感染、未感染組患者血清Th17/Treg細(xì)胞、IL-17、IL-10水平比較

2.4 mir-210在宮頸癌HPV感染中的診斷價(jià)值 ROC分析顯示，mir-210對(duì)宮頸癌HPV預(yù)測(cè)的ROC曲線AUC值為0.763(95%CI：0.658～0.848)，臨界值為1.808，靈敏度為78.05%，特異度為72.73%，約登指數(shù)為0.507。見圖1。

圖1 ROC分析mir-210對(duì)宮頸癌HPV感染的診斷價(jià)值

2.5 相關(guān)性分析mir-210表達(dá)與Th17/Treg細(xì)胞、IL-17A、IL-10的相關(guān)性 宮頸癌患者mir-210表達(dá)與Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞細(xì)胞比例呈顯著性正相關(guān)(r=0.387，r=0.596，P均<0.05)。mir-210表達(dá)與IL-17A、IL-10呈顯著性正相關(guān)(r=0.425，r=0.403，P均<0.05)。見圖2。

3 討論

miRNA經(jīng)靶向結(jié)合靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)來抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。研究證實(shí)miRNA與細(xì)胞凋亡、分化等發(fā)生相關(guān)[6]。此外miRNA異常表達(dá)、突變與癌癥的發(fā)生相關(guān)，通過調(diào)節(jié)下游靶點(diǎn)，并進(jìn)一步影響致瘤性發(fā)生。因此，miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)可作為診斷和預(yù)后評(píng)估的新靶點(diǎn)。多種miRNA與宮頸癌發(fā)病機(jī)制密切有關(guān)。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)mir-328通過靶向TCF7l2抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。Shishodia等[8]發(fā)現(xiàn)miR-21 與 let-7a結(jié)合后通過調(diào)控STAT3信號(hào)通路參與宮頸癌的發(fā)生。HPV病毒為宮頸感染病毒之一，多項(xiàng)研究顯示HPV病毒感染與多種腫瘤如頭頸部、肺癌、宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[9,10]。HPV病毒感染后可通過特定基因如E6、E7等基因調(diào)控細(xì)胞凋亡，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的增殖等。近期有研究發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)與宮頸癌HPV感染的發(fā)生有關(guān)，Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)hpv16e5基因通過下調(diào)mir196a在宮頸感染時(shí)的表達(dá)，啟動(dòng)正常宮頸細(xì)胞向?qū)m頸癌的轉(zhuǎn)化。Gómez-Gómez等[12]研究發(fā)現(xiàn)E7癌蛋白和17β-雌二醇(e2)通過上調(diào)mir-21和mir-143，進(jìn)而參與宮頸癌HPV發(fā)生。這些研究提示miRNA與宮頸癌及HPV感染密切相關(guān)。

圖2 Pearson相關(guān)性分析宮頸癌患者mir-210表達(dá)與Th17/Treg細(xì)胞、IL-17A、IL-10的關(guān)系

miR-210主要存在缺氧細(xì)胞及組織中，與炎癥、組織缺血、腫瘤等發(fā)生有關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-210能夠抑制TLR4信號(hào)通路，進(jìn)而抑制TNF-α、IL-6有關(guān)炎性因子表達(dá)[13]?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境誘導(dǎo)后miR-210表達(dá)顯著降低，且其能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑，加速細(xì)胞凋亡[14]。在肺癌中發(fā)現(xiàn)肺癌組織中miR-210通過調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生[15]。然而miR-210與宮頸癌HPV的關(guān)系，目前研究較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清中mir-210表達(dá)顯著高于正常者，進(jìn)一步對(duì)HPV感染宮頸癌患者分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌HPV陽性感染者血清中mir-210顯著高于HPV陰性者，這些結(jié)果提示mir-210參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。鑒于miR-210在宮頸癌HPV感染、未感染者之間的差異，推測(cè)mir-210可能對(duì)宮頸癌HPV感染具有一定的鑒別價(jià)值，采用ROC分析發(fā)現(xiàn)mir-210對(duì)宮頸癌HPV預(yù)測(cè)的AUC值為0.763，靈敏度為78.05%，特異度為72.73%，提示miR-210對(duì)宮頸癌HPV感染具有一定的診斷價(jià)值。

Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞均為T淋巴細(xì)胞亞群，Th17細(xì)胞在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，IL-17為Th17細(xì)胞分泌的主要炎性因子，過往研究發(fā)現(xiàn)IL-17在自身免疫疾病及感染疾病的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16]。Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用，可抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)，參與乳腺癌、宮頸癌等癌癥的發(fā)生、發(fā)展，IL-10為Treg細(xì)胞分泌的主要炎性因子。Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡，一旦兩細(xì)胞比例失調(diào)則會(huì)引發(fā)腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清TH17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例均明顯高于正常組，且HPV陽性者三項(xiàng)指標(biāo)明顯高于HPV陰性者，提示Th17/Treg細(xì)胞失衡可能與宮頸癌病變有關(guān)，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步對(duì)兩種細(xì)胞分泌炎性因子分析發(fā)現(xiàn)與HPV陰性組比較，HPV陽性組患者血清IL-17、IL-10因子水平均升高，推測(cè)HPV感染后可能通過影響Th17/Treg細(xì)胞平衡進(jìn)而引發(fā)免疫失衡，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。

綜上所述，mir-210在宮頸癌中上調(diào)表達(dá)，與HPV感染及Th17/Treg細(xì)胞失衡有關(guān)，在HPV感染中具有一定的鑒別價(jià)值。然而本研究也存在不足之處，納入病例樣本數(shù)量不多，未深入分析miR-210與Th17/Treg細(xì)胞失衡間的作用機(jī)制，這還有待后續(xù)深入研究，以提供更充分的依據(jù)。