胃癌組織中LncRNA SNHG3的表達及意義

谷建斌 張國欣 張玉斌 薛菲 王冬冬 耿蘊峰

胃癌是嚴重威脅人類健康的全球性疾病之一[1]，而我國每年胃癌新發(fā)病例占世界新發(fā)病例>40%，死亡率居于第2位[2]。胃癌的病因涉及遺傳因素、表觀遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素及環(huán)節(jié)，具體機制尚未完全闡明。早期胃癌的治療效果較好，在進展期胃癌的治療中，手術(shù)、放療、化療是治療的主要方法，但是易于局部淋巴結(jié)、肝臟、腹腔轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5 年生存率低于30%[3,4]。因此，人們在不斷尋找能夠作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物和相關(guān)的治療靶點。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,IncRNA)指長度>200個核苷酸的非編碼RNA，近年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織和正常組織中存在差異表達的lncRNA[5,6]，在多種腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)過程中的重要作用也得到了證實[7-11]。高通量轉(zhuǎn)錄本測序顯示，在胃癌中，與癌旁組織比較，在胃腺癌組織中存在表達差異達2倍以上的74條lncRNA，其中上調(diào)的有43條，下調(diào)的有31條，提示在胃癌生物學(xué)過程中，lncRNA發(fā)揮了重要作用[12]。在發(fā)現(xiàn)的74條差異表達的lncRNA中，經(jīng)檢索文獻，發(fā)現(xiàn)核仁小分子RNA宿主基因3(SNHG3)在肝癌、結(jié)直腸癌中異常高表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13,14]。lncRNA SNHG3位于1p35.3，在肝細胞肝癌中表達水平顯著增高，與腫瘤大小、門靜脈瘤栓、復(fù)發(fā)顯著相關(guān)， SNHG3可以作為肝細胞肝癌不良預(yù)后的指標(biāo)[13]。在結(jié)直腸癌中，SNHG3表達顯著上調(diào)，功能獲得和功能缺失試驗顯示SNHG3能夠促進結(jié)直腸癌細胞的增殖，進一步研究發(fā)現(xiàn)SNHG3是通過作為內(nèi)源性競爭性RNA(ceRNA)與miR-182-5p相互競爭，導(dǎo)致c-Myc表達升高并作用于c-Myc的目的基因，從而促進了結(jié)直腸癌進展，可以得到SNHG3異常高表達是結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的指標(biāo)[14]。在胃癌中，lncRNA SNHG5的表達中顯著降低，其可抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，可以作為胃癌治療的藥物作用靶點[15]。而在胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的表達及臨床意義的報道少見，因此，本研究將lncRNA SNHG3作為研究對象，對其在胃癌組織中的表達情況進行檢測，并結(jié)合臨床資料進行分析，為進一步探討其作用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年2～7月手術(shù)切除的42例胃癌標(biāo)本及5 cm處胃黏膜組織標(biāo)本，病例均經(jīng)病理診斷證實為胃腺癌，除外合并其他惡性腫瘤，以及術(shù)前接受放療、化療和其他針對胃癌治療的患者。其中男32例，女10例;年齡26～77歲，平均年齡(59.8±11.3)歲；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例；TNM分期Ⅰ期2例，Ⅱ期10例，Ⅲ期27例，Ⅳ期3例。該實驗所用標(biāo)本通過醫(yī)院倫理委員會討論通過，并征得患者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器 lncRNA SNHG3、β-Actin引物使用primer primer 5軟件設(shè)計，由上海生工公司合成。TRIzol試劑,美國Invitrogen公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國promega公司；焦碳酸二乙醋(DEPC),美國sigma公司;SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，全式金公司； Roter gene 3000，澳大利亞Corbett公司；NanoDrop ND-2000分光光度計，美國NanoDrop公司。

1.3 LncRNA SNHG3的表達檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法對胃癌組織及癌旁(距離癌組織>5 cm)正常胃黏膜組織中l(wèi)ncRNA SNHG3表達進行檢測。收集術(shù)中新鮮獲取的癌組織及癌旁組織，凍存管內(nèi)液氮速凍，轉(zhuǎn)運至實驗室后置于-80℃冰箱保存。分別取約100 mg組織，將組織冰上研磨后加入2 ml的TRIzol試劑，應(yīng)用TRIzol 法提取組織中總RNA，以總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，分光光度計鑒定cDNA 純度，使A260/A280=1.8～2.2，-20℃冰箱保存待測。實驗步驟嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。2×SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒檢測lncRNA SNHG3的表達。lncRNA SNHG3上游:5’AGACAGATTCGCAGTGGTCG3’下游:5’GTCTCCATGGCCCACTTCTG3’。β-Actin 上游引物 5’- CACCCCAGCCATGTACGTTG-3’，下游引物 5’- AATGTCACGCACGATTTCCC-3’。熒光定量PCR 反應(yīng)體系:2 ×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，模板2 μl，加RNAase-free 的雙蒸水7 μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 30 s，95℃ 變性10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸20 s共40個循 環(huán)。所有反應(yīng)于Roter gene 3 000實時定量PCR 儀上完成，每個樣本重復(fù)3 次。采用相對CT 值方法進行數(shù)據(jù)分析，計算組織中目的基因 lncRNA SNHG3 表達量，△CT=CTlncRNA-CTβ-Actin；△△CT=(CTlncRNA-CTβ-Actin)實驗組-(CTlncRNA-CTβ-Actin)對照組；癌組織和癌旁組織的表達量統(tǒng)計時，各樣本的相對表達量=2-△CT，2-△△CT表示癌組織lncRNA SNHG3表達量相對于癌旁組織的變化倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 qRT- PCR的熔解曲線與擴增曲線 qRT- PCR結(jié)束后，測定熔解曲線，β-Actin及LncRNA SNHG3產(chǎn)物熔解曲線均為單一曲線，說明反應(yīng)未出現(xiàn)非特異性擴增。qRT- PCR產(chǎn)物擴增曲線顯示結(jié)果重復(fù)性好，實驗精確度高。見圖1、2。

圖1 胃癌與癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG3及β-Actin的熔解曲線

圖2 胃癌與癌旁組織lncRNA SNHG3及β-Actin的擴增曲線

2.2 LncRNA SNHG3在胃癌組織和癌旁組織中的表達情況 胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3△CT值為4.87±1.38,癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG3△CT值為5.66±1.22,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.01,P=0.0002 )。胃癌組織、癌旁組織的lncRNA SNHG3相對表達量(2-△CT)分別是0.0358(0.0208～0.0860)、0.0215(0.0140～0.0330)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.85,P=0.0043)。42對樣本中，有30對(71.4%，30/42)的胃癌組織的lncRNA SNHG3表達量高于癌旁組織，其中20對(47.6%，20/42)的胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3表達量占癌旁組織≥2倍。見表1，圖3、4。

表1 LncRNA SNHG3在胃癌組織和癌旁組織中的表達

圖3 LncRNA SNHG3在胃癌組織和癌旁組織中的△CT

圖4 LncRNA SNHG3在胃癌組織中的相對表達

2.3 LncRNA SNHG3與胃癌臨床病理的關(guān)系 根據(jù)lncRNA SNHG3在42例胃腺癌組織中的相對表達量是否≥2倍，分為高表達組和低表達組。60.6%的胃癌T3+T4期患者lncRNA SNHG3為高表達，而在T1+T2期胃癌患者均為低表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.1252，P=0.0044)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中有57.6%的患者lncRNA SNHG3高表達，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組有11.1%患者高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.399，P=0.039)。TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者63.3%的lncRNA SNHG3高表達，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者的8.3%(χ2=10.395，P=0.0013)。見表2。

2.4 LncRNA SNHG3表達水平與胃癌血管、神經(jīng)侵犯的關(guān)系 LncRNA SNHG3的表達水平與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、分化程度無關(guān),與血管侵犯、神經(jīng)侵犯無關(guān)。見表3。

3 討論

在人類基因組序列中,僅有1.5%的核酸序列用于蛋白質(zhì)編碼,而占據(jù)人類基因組98.5%的是非蛋白編碼序列,非編碼RNA 是一大類不具有蛋白編碼潛能的RNA 轉(zhuǎn)錄本[16],不具有開放閱讀框，無蛋白翻譯功能。其幾乎能參與整個生命周期基因調(diào)控的每一步：包括染色體劑量補償，印跡，表觀遺傳調(diào)控，轉(zhuǎn)錄，mRNA 剪接和翻譯[17]等。按照lncRNA分子功能的不同,研究人員將lncRNA分為4 種：(1)信號分子; (2)誘餌分子; (3)引導(dǎo)分子; (4)支架分子[18]。lncRNA可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白的表達[19]。有的lncRNA可具有致癌作用，如HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcriptantisense RNA,HOTAIR)，它是第1個被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的lncRNA，作為分子支架發(fā)揮作用。HOTAIR在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜播散的患者高表達，提示預(yù)后不良[20]。有的lncRNA則具有抑癌作用，如在胰腺癌和乳腺癌中，MEG3可以抑制MDM2蛋白的表達從而活化p53通路達到抑癌作用[21,22]；有的lncRNA兼具有致癌及抑癌的雙重作用[23,24]。因此對lncRNA進行深入研究，能夠為腫瘤的診斷和治療提供重要的科學(xué)依據(jù)。

表2 LncRNA SNHG3表達水平與胃癌臨床病理資料關(guān)系 n=42，例(%)

表3 LncRNA SNHG3表達水平與胃癌血管、神經(jīng)侵犯的關(guān)系 n=42，例(%)

核仁小分子RNA(snoRNAs)以及snoRNAs的失調(diào)在癌癥的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其宿主基因3 (SNHG3)是一種lncRNA，也稱為核仁小分子RNA U17的宿主基因(U17HG)，位于1p35.3。基因內(nèi)的U17核仁小分子RNA宿主基因最初由Pelczar P發(fā)現(xiàn)，這位學(xué)者將人類和老鼠的U17HG進行對比，發(fā)現(xiàn)在兩個物種間核仁小分子RNA僅編碼內(nèi)含子，并且沒有蛋白編碼特性[25]。近期研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌、肝內(nèi)膽管細胞癌[26,27]中l(wèi)ncRNA SNHG3的表達顯著增高，提示SNHG3有可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。

本實驗中，應(yīng)用qRT-PCR 方法，檢測了42例胃癌組織樣本和癌旁組織中的lncRNA SNHG3的表達情況，發(fā)現(xiàn)胃癌組織的lncRNA SNHG3相對表達量顯著高于癌旁組織(Z=2.85,P=0.0043)，這與前期的高通量測序及qRT-PCR驗證的結(jié)果提示lncRNA SNHG3在胃癌組織中高表達[10]，二者結(jié)果一致。42對樣本中，有20對(47.6%，20/42)的胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3表達量是癌旁組織的2倍及以上。提示了SNHG3可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著類似癌基因的作用。張子龍等[28]利用癌癥基因圖集(TCGA)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，SNHG3在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中的表達均顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，并且高表達lncRNA SNHG3的胃癌患者的生存時間顯著低于低表達的胃癌患者。在其他的消化道腫瘤中也有類似結(jié)果。Wen等[26]發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中，lncRNA SNHG3的表達較癌旁組織顯著增高，而且在四株結(jié)腸癌細胞HCT116,LoVo,SW480,and SW620中的表達較正常結(jié)腸細胞株NCM460中的表達顯著增高。Tian等[27]發(fā)現(xiàn)，在52例肝內(nèi)膽管細胞癌中，lncRNA SNHG3的表達較癌旁組織顯著增高，并且與TNM分期相關(guān)，lncRNA SNHG3可以作為肝內(nèi)膽管細胞癌預(yù)后的獨立危險因素。

將lncRNA SNHG3的表達水平與胃癌患者臨床病理資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，60.6%的胃癌T3、T4期患者lncRNA SNHG3高表達，而在T1、T2期胃癌患者無1例lncRNA SNHG3高表達(χ2=8.1252，P=0.0044)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中有57.6%的患者lncRNA SNHG3高表達，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組有11.1%患者lncRNA SNHG3高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.399，P=0.039)。Xuan等[29]在60例胃癌樣本的研究中也發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌患者較陰性的患者lncRNA SNHG3，高表達lncRNA SNHG3的患者在總生存率和無轉(zhuǎn)移生存率預(yù)后不佳。本研究中，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者63.3%的lncRNA SNHG3高表達，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者的8.3%(χ2=10.395，P=0.0013)。近期研究也發(fā)現(xiàn)，SNHG3能夠較好地指示胃癌的臨床分期，在高分期胃癌中的表達水平呈現(xiàn)顯著上升的趨勢[28]，與我們的結(jié)果相一致。在大腸癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，癌組織中SNHG3的表達顯著增高，與臨床分期、遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，總體生存率低。功能實驗表明下調(diào)SNHG3表達在體內(nèi)外均能顯著降低大腸癌的生長和轉(zhuǎn)移，提示SNHG3可能作為潛在的治療大腸癌的靶點[26]。本研究結(jié)果顯示胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的表達水平與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，提示lncRNA SNHG3在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中有可能起到了致癌基因樣作用。

綜上所述，胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG3表達顯著增高，表達水平與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)。提示lncRNA SNHG3可能作為潛在的治療胃癌的目標(biāo)靶點。但lncRNA SNHG3調(diào)控胃癌進展、轉(zhuǎn)移的具體機制需要以后進一步的細胞實驗、動物實驗去證實和明確。