苦蕎ARF基因家族的鑒定及生長素誘導(dǎo)下的表達模式

郝彥蓉，杜偉，侯思宇，王東航，馮紅梅，韓淵懷，周美亮，張凱旋，劉龍龍，王俊珍，李紅英，孫朝霞

苦蕎ARF基因家族的鑒定及生長素誘導(dǎo)下的表達模式

郝彥蓉1，杜偉1，侯思宇1，王東航1，馮紅梅1，韓淵懷1，周美亮2，張凱旋2，劉龍龍3，王俊珍4，李紅英1，孫朝霞1

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心，太原 030031；4涼山州西昌農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，四川西昌 615000）

【】全基因組水平鑒定苦蕎ARF家族基因，并對其家族基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化、組織表達差異及外源生長素處理下基因表達水平進行分析，為苦蕎ARF的功能研究和利用奠定基礎(chǔ)。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和ARF保守結(jié)構(gòu)域（PF06507）分析，篩選苦蕎ARF家族成員，利用TBtools軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖，利用NCBI及MEME在線預(yù)測苦蕎ARF蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序，利用MEGA X構(gòu)建苦蕎和擬南芥、水稻、甜蕎、甜菜、大豆ARF蛋白系統(tǒng)進化樹。使用根、莖、葉、花、未成熟和成熟籽粒6個組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的FPKM值，通過TBtools HeatMap繪制FtARFs基因表達熱圖，分析FtARFs的組織表達特異性。使用PlantCARE在線網(wǎng)站預(yù)測莖稈特異表達的FtARFs啟動子的順式作用元件。以0.5 mg·L-1IAA處理2份高稈（ZNQ189和PI673849）與2份矮稈（PI658429和PI647612）苦蕎材料，觀察苦蕎下胚軸伸長的特征，于生長素處理不同時間段（0、0.5、1、6、12、24和48 h）取樣，qRT-PCR檢測FtARFs基因在不同苦蕎下胚軸中的表達差異；同時，對生長7 d的4份材料進行石蠟切片，番紅固綠染色后顯微鏡下觀察下胚軸細胞大小。系統(tǒng)分析鑒定了26個苦蕎ARF家族基因，染色體定位分析顯示，除第4染色體外，F(xiàn)tARFs在其余染色體均有分布。理化性質(zhì)分析表明，氨基酸殘基數(shù)目范圍為331—1 083 aa，理論等電點為5.34—8.63。保守基序分析表明，不同組間Motif組成有一定的差異?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，苦蕎ARF基因外顯子數(shù)量為2—15，變異較大。系統(tǒng)進化將其分成4組（GroupⅠ—Group Ⅳ），且苦蕎FtARFs在4個類群中均有分布。組織特異性分析顯示，在各組織中，F(xiàn)tARFs基因FPKM值差異明顯，在根、莖、花中，分別檢測到7個、9個和4個基因表達量較高，在葉、未成熟籽粒和成熟籽粒中，表達值均較低。外源生長素處理4份苦蕎材料，下胚軸伸長趨勢不一，與其細胞大小變化相一致。qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)tARFs基因在生長素處理前期（0.5—1 h）表達較高，在處理后期，基因表達量降低。且處理苦蕎幼苗0.5 h時，大多數(shù)FtARFs基因被顯著誘導(dǎo)表達?？嗍wARF基因結(jié)構(gòu)和蛋白基序具有組間多樣性和組內(nèi)保守性，且具有組織表達特異性，9個莖稈特異表達的FtARFs基因響應(yīng)IAA誘導(dǎo)，暗示其對苦蕎莖稈伸長可能具有調(diào)控作用。

苦蕎；ARF基因家族；生長素；株高；基因表達

0 引言

【研究意義】蕎麥（）是起源于中國的蓼科雙子葉雜糧作物，距今已有2 000多年的栽培史[1]?？嗍w（）是重要的蕎麥栽培種，其適應(yīng)性廣，營養(yǎng)價值高，已成為備受關(guān)注的“藥食同源”作物[2]。苦蕎中氨基酸含量均衡，富含人體必需氨基酸，特別是主糧作物較為缺乏的賴氨酸，特有的黃酮類物質(zhì)——蘆丁，更使其在營養(yǎng)保健方面功效顯著[3]。但由于苦蕎自身的結(jié)構(gòu)特點，植株較高、莖稈中空、脆性強，使得苦蕎在生長發(fā)育過程中容易受到外界自然環(huán)境的影響，發(fā)生莖稈倒伏和彎曲，造成收獲困難，制約苦蕎產(chǎn)量的提升[4-5]。因此，探討苦蕎株高影響因素，可在一定程度上提高苦蕎產(chǎn)量，提升苦蕎收獲指數(shù)，促進農(nóng)民種植積極性?！厩叭搜芯窟M展】苦蕎株高由基因型決定，隨栽培條件（包括水肥、土壤等條件）、地理環(huán)境而變化。植物節(jié)間縮短、節(jié)間數(shù)減少或細胞伸長異常等都與植物激素調(diào)控相關(guān)[6]，研究發(fā)現(xiàn)，GA、BR、SLs、IAA等植物激素的合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都與植物株高有關(guān)[7-10]。生長素（auxin）作為最早被人們發(fā)現(xiàn)的植物激素，具有調(diào)節(jié)莖的生長速率、抑制側(cè)芽、促進生根等作用[11]，參與植物生長調(diào)控的大部分過程。而植物對生長素的反應(yīng)受許多基因的調(diào)控[12]，生長素響應(yīng)因子（auxin response factor，ARF）則是其中一類較為重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠特異地與生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的生長素響應(yīng)元件（auxin response element，AuxRE）TGTCTC結(jié)合，激活或抑制基因的表達，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育[13]。ARF基因已在不同物種的基因組中被鑒定出來，最早是在模式植物擬南芥中被發(fā)現(xiàn)的，目前已有23個ARF成員[14]，隨后在水稻[15]、楊樹[16]、玉米[17]、番茄[18]、大豆[19]、葡萄[20]等植物中也鑒定出ARF基因家族。Wu等[21]研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達芒果抑制了根和下胚軸的生長。Jung等[22]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體葉片變小，生育能力降低，表現(xiàn)出植株矮化，在該突變體中的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。Huang等[23]研究發(fā)現(xiàn)水稻過表達抗性轉(zhuǎn)基因植株的，在生長發(fā)育中表現(xiàn)出多種缺陷，包括植株矮化、葉片卷曲和種子變小等。【本研究切入點】苦蕎基因組測序的完成[24]，更有利于苦蕎基因的鑒定及功能分析，盡管Liu等[25]對苦蕎ARF基因家族已有報道，但其調(diào)控下胚軸伸長的機理尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)入手，鑒定苦蕎ARF基因家族成員并分析其結(jié)構(gòu)特征，分析其在不同組織器官中的表達規(guī)律以及研究其在生長素信號途徑中的作用，將有助于解析該家族基因的作用機制，也為進一步解析苦蕎ARF基因與株高的關(guān)系，解決生產(chǎn)上苦蕎易倒伏、產(chǎn)量降低的問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以黑豐一號苦蕎為試驗材料，2019年種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站。大田種植取生長狀態(tài)良好植株的幼嫩根、莖、新葉、開放花、未成熟籽粒和成熟籽粒于1.5 mL離心管中，液氮速凍后儲存于-80℃?zhèn)溆?。選取4份苦蕎資源PI658429、PI647612、ZNQ189、PI673849進行外源生長素處理（所有材料均來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)）。室內(nèi)試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蕎麥基因資源創(chuàng)新研究組進行。

1.2 苦蕎轉(zhuǎn)錄組測序及FtARFs基因篩選

利用RNA-seq對苦蕎黑豐一號根、莖、葉、花、未成熟籽粒和成熟籽粒6個組織（每個組織3份重復(fù)），共計18個樣品進行轉(zhuǎn)錄組分析。

以“auxin response factor”為關(guān)鍵詞，對上述轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中NR注釋信息進行篩選，挑選出生長素響應(yīng)因子（ARFs）家族成員，結(jié)合pfam注釋信息，篩選含有Auxin_resp結(jié)構(gòu)域的基因。以已公布的pinku基因組為參考基因組（http://www.mbkbase.org/Pinku1），獲得苦蕎ARF基因的序列信息，包括核酸序列、蛋白序列、CDS序列和基因位置信息。

1.3 苦蕎ARF基因的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、染色體定位和啟動子序列分析

使用NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在線預(yù)測苦蕎ARF蛋白結(jié)構(gòu)域，使用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在線預(yù)測蛋白基序。TBtools軟件（https://github. com/CJ-Chen/TBtools）繪制可視化圖片，并對基因結(jié)構(gòu)進行分析。采用ExPasy（https://web.expasy.org/ protparam）在線軟件預(yù)測苦蕎ARF蛋白的等電點（isoelectric point，）和分子量（molecular weight，MW），使用MG2C網(wǎng)站（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）繪制FtARFs染色體分布圖，按照基因在染色體上的排列順序進行命名。利用PlantCARE網(wǎng)站（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在線預(yù)測FtARFs轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp序列的順式作用元件，分析其激素應(yīng)答、環(huán)境脅迫類型。

1.4 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用String網(wǎng)站（https://string-db.org）將苦蕎ARF蛋白與甜菜（）、擬南芥（）進行同源比對，獲取同源基因；在BGDB網(wǎng)站（http://buckwheat.kazusa.or.jp/keyword.html）下載甜蕎（）ARF蛋白序列；PlantTFDB（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn）網(wǎng)站下載水稻（）和大豆（）ARF蛋白序列，利用Muscle對這六個物種的ARF蛋白進行多序列比對，利用MEGA X軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）分別構(gòu)建苦蕎ARF基因家族進化樹及苦蕎、甜蕎、甜菜、擬南芥、水稻和大豆的系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)bootstrap設(shè)置為1 000，其余參數(shù)均為默認值。

1.5 外源激素處理及FtARFs表達量分析

從苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得FtARFs在根、莖、葉、花、未成熟和成熟籽粒中的FPKM值，利用TBtools軟件繪制基因表達熱圖，分析在不同組織中特異表達的基因，為了檢測在苦蕎莖稈發(fā)育過程中，F(xiàn)tARFs的表達是否受到生長素的調(diào)控，對苦蕎幼苗進行外源生長素處理。

田間調(diào)查100份苦蕎資源的株高與主莖節(jié)數(shù)，篩選2017—2019年株高較穩(wěn)定資源4份（高稈2份：ZNQ189與PI673849，矮稈2份：PI658429與PI647612），于MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，取3株長勢一致的無菌苗于液體MS培養(yǎng)基中，室溫震蕩（120 r/min）1 d后，加入0.5 mg·L-1IAA（IAA溶于二甲基亞砜（DMSO）中），于不同時間（0、0.5、1、6、12、24和48 h）對下胚軸取樣，對照組添加同體積的二甲基亞砜。取50—100 mg樣品加液氮充分研磨后，利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取上述樣品的RNA，使用HiScript? III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，保存于-20℃?zhèn)溆?。以為?nèi)參基因，同時設(shè)計FtARFs基因特異引物（表1），以上述cDNA為模板，使用南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司試劑盒進行qRT-PCR檢測，設(shè)置生物學(xué)重復(fù)3次，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.6 苦蕎下胚軸石蠟切片觀察

含有0.5 mg·L-1IAA的MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4份材料7 d后，各取10株無菌苗統(tǒng)計下胚軸長度；同時，取1 cm左右下胚軸鮮樣，用FAA固定液（甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL）固定24 h以上，參照王茜茹等[26]方法進行石蠟切片，經(jīng)番紅固綠染色后，于LEICA DM500光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用excel 2019辦公軟件進行數(shù)據(jù)分析。利用歐氏層次聚類方法，使用TBtools繪制熱圖。使用GraphPad Prism 5（San Diego California USA，www.graphpad.com）進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 FtARFs篩選及蛋白理化性質(zhì)分析

通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中NR注釋信息的篩選，共篩選出41個苦蕎ARF候選基因，對上述候選基因pfam注釋信息進行分析，剔除不含有典型ARF結(jié)構(gòu)域的冗余蛋白后，最終得到26個苦蕎ARF基因，并繪制出FtARFs基因在8條染色體上的分布圖（圖1），結(jié)果顯示，除Chr.4（第4染色體）外，均有ARF基因分布。其中在Chr.3分布最多，包含5個基因，其次為Chr.1、Chr.2、Chr.5和Chr.8上各有4個基因分布，而在Chr.6和Chr.7僅有2—3個基因分布。根據(jù)苦蕎ARF基因在染色體上的物理位置分布，按順序命名為—。理化性質(zhì)分析表明，蛋白長度為331—1 083 aa，CDS長度為720—3 252 bp，分子量為37.18—120.49 kD，理論等電點為5.34—8.63。

2.2 苦蕎ARF系統(tǒng)進化及蛋白結(jié)構(gòu)域、蛋白基序和基因結(jié)構(gòu)分析

系統(tǒng)進化樹分析可將苦蕎ARF蛋白分為4組，ClassⅠ與ClassⅢ蛋白結(jié)構(gòu)域較完整，除FtARF1、FtARF11、FtARF12、FtARF16和FtARF24缺少C端的Aux/IAA結(jié)構(gòu)域外，其余蛋白均包含3個結(jié)構(gòu)域。ClassⅡ中FtARF23蛋白結(jié)構(gòu)域完整，F(xiàn)tARF9和FtARF17含有2個結(jié)構(gòu)域。ClassⅣ中，所有蛋白均只含有B3結(jié)構(gòu)域和Auxin_resp結(jié)構(gòu)域。進一步對苦蕎ARF蛋白保守基序分析，共鑒定了10個motif，其中FtARF19含有6個基序，F(xiàn)tARF11、FtARF12、FtARF16和FtARF22含有7個基序，F(xiàn)tARF9和FtARF15含有8個基序，F(xiàn)tARF24和FtARF26包含9個基序，其余蛋白均含有10個保守基序（圖2）。

基因結(jié)構(gòu)分析顯示，26個FtARFs基因均含有外顯子和內(nèi)含子，不同苦蕎ARF所含外顯子數(shù)量差異很大，ClassⅠ成員的外顯子數(shù)量差異較大，有10—15個，ClassⅡ成員的外顯子數(shù)量為10—12個，ClassⅢ除個別基因含有7和15個外顯子外，其余基因均含有14個外顯子，ClassⅣ成員的外顯子數(shù)量最少，為2—4個。這些結(jié)果暗示著FtARFs基因的結(jié)構(gòu)差異可能影響著其功能的發(fā)揮，因此，有必要對該類基因進行進一步的功能分析。

2.3 不同植物ARF蛋白進化關(guān)系

為了充分揭示苦蕎ARF基因家族的進化關(guān)系，選取擬南芥、水稻、甜蕎、甜菜和大豆，6個物種共114個ARF蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3）。聚類分析顯示，共分為4個類群（GroupⅠ—GroupⅣ），分別含有38、15、38和23個成員，然而不同類群的蛋白在功能上可能存在一定差異，其中，苦蕎FtARFs在4個類群中均有分布，如在GroupⅠ中包含8個成員（FtARF1、FtARF3、FtARF5、FtARF10、FtARF11、FtARF12、FtARF20和FtARF22），Group Ⅱ中包含3個成員（FtARF9、FtARF17和FtARF23），Group Ⅲ中包含10個成員（FtARF2、FtARF4、FtARF6、FtARF8、FtARF13、FtARF14、FtARF16、FtARF18、FtARF24和FtARF25），Group Ⅳ中包含5個成員（FtARF7、FtARF15、FtARF19、FtARF22和FtARF26）。同時發(fā)現(xiàn)有18個苦蕎ARF成員與甜蕎ARF高度同源。在Group Ⅰ中，擬南芥AtARF12—AtARF15、AtARF20— AtARF23成員單獨聚在一個分支上，在其他5個物種中，均未發(fā)現(xiàn)與其高度同源的序列。

圖1 FtARFs基因染色體分布圖

圖2 苦蕎ARF家族的系統(tǒng)發(fā)育樹、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)

圖3 苦蕎與其他物種ARF蛋白系統(tǒng)進化樹

2.4 苦蕎ARF基因的表達分析

為了解苦蕎生長發(fā)育過程中ARF基因的表達變化，利用6個組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的FPKM值繪制熱圖（圖4），發(fā)現(xiàn)FtARFs基因具有組織特異性表達。其中，在成熟籽粒中特異表達，和在未成熟籽粒中表達量高，在成熟籽粒中表達量降低，且、和在聚類過程中高度同源，表明其可能在種子成熟發(fā)育過程中起重要作用。而另有7個基因在根中呈現(xiàn)高表達水平，這些基因可能參與根系發(fā)育及細胞伸長。但在葉中僅有3個基因特異表達，其余基因表達量都較低，可能是因為展開的葉片在促進細胞伸長方面要求較低。同時發(fā)現(xiàn)在花中基因表達量較高，有4個基因呈現(xiàn)表達差異。值得注意的是，、、、、、、、和在下胚軸中特異表達，暗示其可能與下胚軸伸長有關(guān)。

2.5 苦蕎ARF基因家族啟動子序列分析

利用在線網(wǎng)站PlantCARE預(yù)測9個下胚軸特異表達的FtARFs基因上游2 000 bp序列的順式作用元件位點（圖5），發(fā)現(xiàn)其具有多個激素響應(yīng)元件，包括生長素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件以及赤霉素響應(yīng)元件。此外，該區(qū)域還發(fā)現(xiàn)一些其他脅迫響應(yīng)元件，如光響應(yīng)元件、干旱響應(yīng)元件以及低溫響應(yīng)元件等。其中發(fā)現(xiàn)5個基因（、、、和）具有生長素響應(yīng)元件TGA-element，而4個基因（、、和）啟動子區(qū)域沒有生長素響應(yīng)元件。

2.6 IAA誘導(dǎo)下胚軸長度變異與FtARFs基因表達分析

FtARFs基因的啟動子順式作用元件預(yù)測結(jié)果表明多個FtARFs基因受生長素誘導(dǎo)。選取株高較高和較低材料各2份，經(jīng)IAA處理后，2份矮稈材料的下胚軸1個被抑制（PI658429），1個被促進（PI647612），2份高稈材料下胚軸均伸長，但伸長趨勢不一，ZNQ189伸長不明顯（圖6-A和圖6-C）。對其下胚軸進行縱向切片并測量其細胞長度（圖6-B和圖6-D），結(jié)果顯示，PI658429在生長素處理后細胞長度縮短0.4倍左右，其余3份材料在生長素處理后，細胞長度均伸長0.5倍以上，與幼苗表型變化相一致。

qRT-PCR檢測IAA誘導(dǎo)下9個莖稈特異表達的FtARFs基因的相對表達量。結(jié)果顯示（圖7），在IAA處理前期（0.5—1 h），除、與外，其余基因表達水平均升高。在未經(jīng)處理的材料中表達水平較高，而經(jīng)IAA處理后，表達水平大幅下降，這可能是受到IAA抑制所引起的，并且在啟動子元件分析中，該基因缺乏IAA響應(yīng)元件也有印證。與之規(guī)律類似的還有，該基因在0.5 h處理點極短響應(yīng)，隨后即出現(xiàn)表達水平大幅降低，推測與缺乏生長素響應(yīng)元件有關(guān)。

圖4 苦蕎ARF基因組織特異性表達

圖5 苦蕎ARF基因啟動子元件分析

值得注意的是，PI658429在IAA處理后，下胚軸被明顯抑制；相應(yīng)地，所檢測的FtARFs基因在處理0.5 h后都表現(xiàn)為表達量降低，推測可能是由于該品種無法響應(yīng)持續(xù)的激素信號所引起的。PI647612和PI673849在IAA處理后，下胚軸呈現(xiàn)增長趨勢（增幅為1 cm左右），在處理0.5 h后，分別有6個和7個基因表達量提高，其中PI673849材料中初期表達水平較低，隨后表達水平持續(xù)升高，在6 h達到最高值，可部分解釋該材料經(jīng)IAA處理后呈現(xiàn)的下胚軸明顯伸長的趨勢。ZNQ189在IAA處理后，下胚軸增長但不明顯，處理0.5 h時，基因表達差異不顯著，在處理1和6 h時，和表達量都有一定的提高，說明這兩個基因響應(yīng)IAA的誘導(dǎo)?？傊煌牧蠈ιL素響應(yīng)不同，且大多數(shù)FtARFs基因受到IAA誘導(dǎo)，在處理初期（0.5—1 h）表達升高，處理后期表達降低。

3 討論

近年來，從全基因組水平研究基因家族的分類、序列特點、進化特征和功能預(yù)測等已成為生物學(xué)分析的一種重要手段。ARF基因家族已被證明調(diào)控植物生長發(fā)育多個過程，具有重要的生物學(xué)功能[27]。

本研究鑒定的苦蕎ARF蛋白多含有3個保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)聯(lián)決定其功能。如，B3結(jié)構(gòu)域可以與ARF基因啟動子上的作用元件結(jié)合，通過Auxin_resp結(jié)構(gòu)域激活或抑制相關(guān)基因的表達，ARF激活子可與Aux /IAA抑制子通過CTD結(jié)構(gòu)域二聚化來抑制基因的表達[28]，而缺失的Aux/IAA結(jié)構(gòu)域可能造成功能的多樣化。系統(tǒng)進化是研究基因家族功能，預(yù)測基因功能的重要工具。由于苦蕎分子生物學(xué)研究還處在起步期，因此，利用系統(tǒng)進化樹對基因功能進行分類就顯得尤為重要。本研究中的ARF蛋白聚為4類，該結(jié)果與梨[29]和葡萄[20]等研究結(jié)果一致，其中Class Ⅳ外顯子數(shù)量明顯少于其他類群，在蘋果[30]、梨[29]等物種中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象,且FtARFs基因家族成員外顯子數(shù)量為2—15個，與擬南芥[14]、葡萄[20]和番茄[18]相似。由此可見，ARF基因家族在結(jié)構(gòu)進化上具有一定的保守性和一致性，這為其功能研究提供了參考依據(jù)。同時，對114個ARF蛋白的聚類結(jié)果深入分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tARF20與擬南芥AtARF1，F(xiàn)tARF1和FtARF5與AtARF2遺傳距離接近，Ellis等[31]研究發(fā)現(xiàn)AtARF1和AtARF2主要調(diào)控葉片衰老、開花時間和種子大小等，預(yù)測苦蕎中該類基因編碼的蛋白可能具有類似功能。Feng等[32]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtARF11促進側(cè)根形成，在激素信號途徑中起關(guān)鍵作用，而FtARF12恰與其高度同源。同樣，發(fā)現(xiàn)FtARF2、FtARF6、FtARF13與AtARF5聚為一類，預(yù)測其與極性生長及細胞擴增有關(guān)[33]。FtARF8、FtARF18、FtARF25與AtARF6聚為一類，Wu等[34]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtARF6調(diào)控種子心皮發(fā)育，促進開花和果實成熟。FtARF14、FtARF24與AtARF19同源性較高，預(yù)測其能促進側(cè)根的形成，在激素信號通路中發(fā)揮重要作用[35]。值得關(guān)注的是，AtARF8能調(diào)控下胚軸的伸長，并且是果實起始發(fā)育的負調(diào)控子[36]，本研究發(fā)現(xiàn)其同源基因和為下胚軸特異表達基因，表明極有可能調(diào)控下胚軸伸長，值得進一步研究。

A：生長素處理前后幼苗生長情況；B：生長素處理前后下胚軸細胞縱切圖，黑色方框代表單個細胞大??；C：幼苗下胚軸長度變化；D：下胚軸細胞長度變化；圖中*代表差異顯著（P＜0.05），**代表差異極顯著（P＜0.01）

A: PI658429, B: PI647612, C: ZNQ189, D: PI673849

作為最廣泛的植物激素，生長素對植株的生長發(fā)育具有重要作用。Tiwari等[37-39]研究發(fā)現(xiàn)，生長素以濃度依賴的方式調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。當(dāng)生長素濃度低時，Aux/IAA抑制子與ARF轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，抑制ARF的活性，當(dāng)生長素濃度提高時，Aux/IAA被泛素化，ARF轉(zhuǎn)錄因子變?yōu)橛谢钚缘男问?，激活或抑制下游基因的表達。Cheng等[40]發(fā)現(xiàn)擬南芥特定組織中生長素合成缺陷會造成突變體頂端優(yōu)勢喪失、株高下降、葉片扭曲等發(fā)育缺陷，對植株形態(tài)產(chǎn)生重要影響。同時，擬南芥受到外源生長素和乙烯的誘導(dǎo)，外源生長素濃度會影響的表達，從而影響介導(dǎo)的側(cè)根形成[41]?？梢?，生長素的含量和分布對植株形態(tài)建成具有重要影響，因此，研究與生長素含量變化相關(guān)的基因，對解析植物生長發(fā)育具有指導(dǎo)作用。本研究使用0.5 mg·L-1IAA處理苦蕎幼苗，不同的材料表現(xiàn)出不同的生長狀態(tài)，PI658429下胚軸變短，其余材料下胚軸呈現(xiàn)出增長趨勢，王紅飛等[42]研究發(fā)現(xiàn)下胚軸伸長與細胞伸長直接相關(guān)，本研究對其下胚軸縱向切片發(fā)現(xiàn)，PI658429生長素處理后，細胞長度變短，其余材料細胞均伸長，因此推測4份材料在生長素處理后表現(xiàn)出不同的表型變化主要是由于細胞長度變化引起的。在生長素處理0.5 h時，大多數(shù)下胚軸特異表達的FtARFs基因表達量上調(diào)，在處理前期（0.5—1 h）表達量升高，處理后期表達量降低，盛慧等[43]使用生長素處理黃瓜幼苗發(fā)現(xiàn)，ARF基因的表達受到IAA的正調(diào)控。Liu等[25]對苦蕎ARF研究發(fā)現(xiàn)在不同的組織和器官中，F(xiàn)tARFs基因的轉(zhuǎn)錄豐度變化很大，且具有組織特異性表達，外源NAA處理試驗表明FtARFs基因在果實發(fā)育過程中對生長素正響應(yīng)。同時WALLER等[44]也研究發(fā)現(xiàn)外源生長素在15—30 min內(nèi)上調(diào)mRNA的穩(wěn)態(tài)水平。因此，推測FtARFs基因在響應(yīng)IAA信號誘導(dǎo)苦蕎下胚軸伸長中發(fā)揮作用。但是發(fā)現(xiàn)雖然大多數(shù)FtARFs基因?qū)ν庠瓷L素處理有反應(yīng)，但生長素響應(yīng)元件僅存在于其中5個FtARFs基因的啟動子區(qū)，因此，F(xiàn)tARFs基因受生長素誘導(dǎo)的機制有待進一步闡明。

4 結(jié)論

鑒定出26個苦蕎ARF家族基因，其具有組間多樣性和組內(nèi)保守性的特征，且FtARFs具有組織特異性表達，下胚軸長度變化與細胞長度變化相關(guān)，推測IAA可能調(diào)控苦蕎下胚軸的伸長。

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Identification of ARF Gene Family and Expression Pattern Induced by Auxin in

HAO YanRong1, DU Wei1, HOU SiYu1, WANG DongHang1, FENG HongMei1, HAN YuanHuai1, ZHOU MeiLiang2, ZHANG KaiXuan2, LIU LongLong3, WANG JunZhen4, LI HongYing1, SUN ZhaoXia1

（1College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;3Center for Agricultural Genetic Resources Research, Shanxi Agricultural University, Taiyuan 030031;4Xichang Agricultural Institute of Liangshan, Xichang 615000, Sichuan）

【】The objective of this study is to lay a foundation for the further functional studies and application of ARF genes by identifying the ARF gene family in tartary buckwheat (), and analysis of gene structure, conserved domains, phylogeny, tissue expression characteristics, and gene expression levels under exogenous auxin treatment.【】The data of transcriptome and ARF conservative domains (PF06507) were analyzed to screen for ARF family members in tartary buckwheat. TBtools software was used to analyze the gene structure, NCBI and MEME were used to predict the conserved domain and motif of ARF proteins online, and MEGA X was used to construct ARF protein phylogenetic trees for tartary buckwheat,,,,,and. The FPKM values of six tissues of roots, stems, leaves, flowers, green grains, and black grains were analyzed in the transcriptome data of tartary buckwheat. Heat maps of FtARFs were drawn using TBtools HeatMap to analyze the tissue expression specificity of FtARFs. To predict the cis-acting elements of the FtARFs promoter specifically expressed on the stem, the PlantCARE online website was used. Two parts of tall buckwheat (ZNQ189 and PI673849) and two parts of dwarf buckwheat (PI658429 and PI647612) were treated with 0.5 mg·L-1IAA and the elongation characteristics of the hypocotyls were analyzed. Samples were taken at different time periods (0, 0.5, 1, 6, 12, 24, and 48 h) after auxin treatment, and the expression differences of FtARFs in different hypocotyls were analyzed by qRT-PCR. Moreover, paraffin sections of four materials grown for 7 days were saffron and green stained, and the cell length was measured.【】Total of 26 FtARFs were identified in the buckwheat genome. Chromosome mapping analysis showed that in addition to chromosome 4, FtARFs were distributed in other chromosomes. Analysis of physical and chemical properties showed thatamino acid residues ranged from 331 to 1 083 aa and the theoretical isoelectric point ranged from 5.34 to 8.63. Conserved motif analysis identified several differences in motif composition among different groups. Gene structure analysis showed that the number of FtARFs exons ranged from 2 to 15, showing large variation. Phylogenetic analysis showed that 114 ARF proteins were divided into four groups (Group Ⅰ to Group Ⅳ), and FtARFs were distributed throughout all groups. The results of tissue-specific analysis showed that FPKM values of FtARFs differed significantly in different tissues. In roots, stems, and flowers, seven, nine, and four genes showed high expression, respectively, whereas in leaves, green grains, and black grains, the expression values remained low. When exogenous auxin was applied to these four buckwheat materials, the trend of hypocotyl elongation differed, which is consistent with observed changes in cell length. qRT-PCR showed that the expression of FtARFs was higher during the early stage (0.5-1 h) of auxin treatment, and decreased during later stages. When buckwheat seedlings were treated for 0.5 h, the expression of most genes was induced.【】The tartary buckwheat ARF gene structures and protein motifs show diversity among groups and conservation within groups. FtARFs show tissue expression specificity, and nine FtARFs, that are specifically expressed in the stem, respond to IAA induction. These exert a regulatory role in the stem elongation of tartary buckwheat.

tartary buckwheat; ARF gene family; auxin; plant height; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.002

2020-03-25；

2020-06-22

國家重點研發(fā)計劃中歐政府間合作項目（2017YFE0117600）、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃（YGC2019FZ2）、國家燕蕎麥產(chǎn)業(yè)體系（CARS-07-A-2）、山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（201801D221296）、山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2017-069）、山西省研究生教育創(chuàng)新項目（2020SY211）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)專業(yè)提升計劃（TSJH1406）

郝彥蓉，Tel：19834543980；E-mail：1148639230@qq.com。通信作者孫朝霞，Tel：18636071356；E-mail：18636071356@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）