香芹酮對(duì)馬鈴薯種薯發(fā)芽的調(diào)控機(jī)制

葛霞，徐瑞，李梅，田甲春，李守強(qiáng)，程建新，田世龍

香芹酮對(duì)馬鈴薯種薯發(fā)芽的調(diào)控機(jī)制

葛霞1，徐瑞2,3，李梅1，田甲春1，李守強(qiáng)1，程建新1，田世龍1

（1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，蘭州 730070；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070；3甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，蘭州 730070）

【】香芹酮是植物精油中常見(jiàn)的單萜類(lèi)物質(zhì)。從激素調(diào)控和膜脂過(guò)氧化方面探討香芹酮對(duì)馬鈴薯種薯發(fā)芽調(diào)控的作用機(jī)制，為其在種薯上的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。以‘青薯9號(hào)’微型薯為試驗(yàn)材料，采用香芹酮0.3 mL?kg-1（藥劑體積/塊莖重量）的處理劑量，貯藏18周后進(jìn)行停藥6周的處理方式，同時(shí)以不做任何處理為對(duì)照，分別在貯藏0、6、18、20和24周，測(cè)定種薯芽長(zhǎng)、失重率、脫落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、丙二醛（MDA）和脯氨酸（PRO）的含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性，并定期對(duì)種薯芽分生組織進(jìn)行切片和顯微成像分析。香芹酮可調(diào)控種薯的發(fā)芽和芽長(zhǎng)，降低種薯的失重率，貯藏24周時(shí)，處理種薯芽長(zhǎng)為4.77 mm，顯著低于對(duì)照芽長(zhǎng)51.02 mm，且失重率比對(duì)照降低49.76%。香芹酮通過(guò)損傷種薯頂芽分生組織和維管束組織抑制頂芽的生長(zhǎng)，但不影響腋芽的萌出。貯藏期間，香芹酮顯著提高了種薯中ABA的含量，但抑制了IAA的含量，推遲了GA3含量的峰值和（GA3+IAA）/ABA＞1拐點(diǎn)的出現(xiàn)；香芹酮處理的種薯MDA含量比對(duì)照降低了15.04%—25.90%，PRO含量比對(duì)照高24.59%—54.45%，SOD、CAT和PPO活性分別比對(duì)照高18.86%—35.56%、14.34%—31.97%和26.00%—36.41%，POD的活性是對(duì)照的1.87—3.07倍。香芹酮通過(guò)促進(jìn)/抑制甲羥戊酸途徑中3-羥基-3-甲基戊二?；o酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）來(lái)調(diào)節(jié)種薯中內(nèi)源激素ABA、IAA和GA3的含量水平，抑制種薯頂芽生長(zhǎng)。此外，香芹酮提高了種薯中的抗氧化酶活性，降低了膜脂過(guò)氧化程度，進(jìn)而延緩種薯衰老。

香芹酮；種薯發(fā)芽調(diào)控機(jī)制；內(nèi)源激素；抗氧化酶；組織切片

0 引言

【研究意義】馬鈴薯易于栽培，營(yíng)養(yǎng)豐富，在膳食結(jié)構(gòu)中占有獨(dú)特的地位，是全球最重要、最普及的糧菜兼用作物[1]。馬鈴薯從田間收獲后，塊莖進(jìn)入生長(zhǎng)相對(duì)暫停的休眠狀態(tài)，但隨著生理老化和環(huán)境條件的變化，休眠被逐漸打破，塊莖開(kāi)始發(fā)芽[2]。發(fā)芽會(huì)加快馬鈴薯生理老化、失水、腐爛，從而造成品質(zhì)劣變等巨大的貯藏?fù)p失[3]。特別是種薯休眠過(guò)早打破或發(fā)芽延遲，都會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量的下降[4]。低溫貯藏（2—4℃）常用于延長(zhǎng)種薯的休眠期，但維持低溫貯藏條件不但增加了貯藏成本，且一旦過(guò)了休眠期，即使低溫也不會(huì)抑制種薯的發(fā)芽，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中常采用化學(xué)方法來(lái)抑制發(fā)芽。氯苯胺靈（Chlorpropham，CIPC）是目前最常用的馬鈴薯抑芽劑[5]，一直被用于商品薯的長(zhǎng)期貯藏，因其抑芽作用的不可逆，不能將其用于種薯的抑芽。為了解決種薯長(zhǎng)期貯藏發(fā)芽的問(wèn)題，探索開(kāi)發(fā)天然、綠色安全，既可用于種薯貯藏抑芽又能滿足生產(chǎn)要求發(fā)芽的抑芽活性化合物已成為目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物精油如薄荷、茉莉、留蘭香、香菜、檸檬草、香茅精油和丁香精油等及其活性成分包括香芹醇、香芹酚、橙花醇、香葉醇、香芹酮等，可抑制或調(diào)控馬鈴薯發(fā)芽[6-10]。其中香芹酮對(duì)馬鈴薯發(fā)芽具有顯著的抑制作用[11-12]，一些歐洲國(guó)家已將其作為商業(yè)化的馬鈴薯抑芽劑（TalentTM），且獲得歐盟批準(zhǔn)并列入歐盟農(nóng)藥管理?xiàng)l例的附錄Ⅰ[11]。香芹酮在自然界中天然存在兩種同分異構(gòu)體，S-(+)-香芹酮是葛縷子、蒔蘿籽油的主要成分，R-(-)-香芹酮是留蘭香、薄荷精油的主要成分，這兩種同分異構(gòu)體對(duì)馬鈴薯發(fā)芽都有抑制作用，但S-(+)-香芹酮更易被馬鈴薯吸收且能更快地抑制馬鈴薯發(fā)芽[13]。筆者課題組前期曾探討了S-(+)-香芹酮不同處理對(duì)‘青薯9號(hào)’微型薯貯藏期間發(fā)芽調(diào)控和田間種植效果的影響，研究發(fā)現(xiàn)，使用S-(+)-香芹酮0.3 mL?kg-1（藥劑體積/塊莖重量）的處理劑量，以及距種植前進(jìn)行停藥4—6周的處理方式，對(duì)種薯貯藏期間芽長(zhǎng)的調(diào)控、抑制腐爛及田間種植效果最佳[14]。【本研究切入點(diǎn)】雖然已有關(guān)于香芹酮及以其為主要成分的精油對(duì)馬鈴薯發(fā)芽抑制效果的報(bào)道，但關(guān)于S-(+)-香芹酮對(duì)塊莖發(fā)芽調(diào)控的作用機(jī)制報(bào)道較少。Oosterhaven等[15]研究發(fā)現(xiàn)S-(+)-香芹酮在抑制馬鈴薯發(fā)芽的同時(shí)，能促進(jìn)3-羥基-3-甲基戊二?；o酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）的降解，但S-(+)-香芹酮是如何通過(guò)影響HMG-CoA還原酶活性調(diào)控塊莖發(fā)芽的機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究S-(+)-香芹酮處理對(duì)種薯發(fā)芽調(diào)控過(guò)程中芽分生組織變化、內(nèi)源激素、丙二醛（MDA）、脯氨酸（PRO）和抗氧化酶活性的影響，從激素調(diào)控和膜脂過(guò)氧化方面探討香芹酮對(duì)種薯發(fā)芽調(diào)控的作用機(jī)制，為其在種薯上的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年9月至2019年4月在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所保鮮與加工實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

供試馬鈴薯材料為‘青薯9號(hào)’微型薯，由定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供；S-(+)-香芹酮（以下簡(jiǎn)稱(chēng)香芹酮，含量≥96%），購(gòu)于Alfa Aesar Co., Ltd.；吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）標(biāo)樣、用于組織包埋切片用的石蠟均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；色譜純甲醇、乙腈和乙酸為天津光復(fù)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；環(huán)保型浸蠟脫蠟透明液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；包埋盒底膜為江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司生產(chǎn)；液相色譜測(cè)試用水為超純水，其余均使用二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（L-1200型、配備Agilent G1356D MWD紫外檢測(cè)器，Agilent，USA）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan GO 1510型，Thermo，Vantaa Finland）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Cary-100型，Agilent，USA）；透明塑料密閉貯藏箱（50 cm×37 cm×27 cm，武漢市康博順家居用品有限公司，中國(guó)）；迷你風(fēng)扇（9 cm×9 cm，德鑫旺工具商行，中國(guó)）；數(shù)顯卡尺（SF2000，桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司，中國(guó)）；烤片機(jī)（DB-B1型，常州國(guó)華電器有限公司，中國(guó)）；切片機(jī)（RM2235型，Leica，德國(guó)）；體視顯微鏡（SZX9型，Olympus Tokyo，日本）；顯微鏡（BX51型，Olympus Tokyo，日本）。

1.3 處理方法與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

‘青薯9號(hào)’微型薯采收于2018年9月25日，在微型薯培育大棚內(nèi)自然晾干，于10月中旬運(yùn)至馬鈴薯恒溫貯藏庫(kù)，在溫度12—18℃、相對(duì)濕度85%—95%的環(huán)境下，預(yù)處理2周。種薯完全木栓化后，按照不同的試驗(yàn)處理進(jìn)行分組，每組種薯為10.0 kg。香芹酮處理在自制內(nèi)循環(huán)種薯貯藏箱中進(jìn)行。使用透明塑料箱、迷你風(fēng)扇按圖1所示組裝，模擬具有內(nèi)循環(huán)通風(fēng)系統(tǒng)的馬鈴薯貯藏庫(kù)，營(yíng)造試驗(yàn)貯藏的微環(huán)境。吸取香芹酮3.0 mL（每kg種薯香芹酮處理劑量為0.3 mL）分散滴加在自制內(nèi)循環(huán)微型薯貯藏箱底部的濾紙上，距箱底1/3處加透氣隔板，然后將10.0 kg微型薯置于隔板上，密閉貯藏箱，接通風(fēng)扇電源，使藥劑在箱內(nèi)循環(huán)20 min，同時(shí)以不做任何藥劑處理為對(duì)照。每個(gè)處理3組重復(fù)。對(duì)照和處理貯藏箱分開(kāi)放置，貯藏溫度為（10±1）℃。貯藏期間管理方法為：密閉貯藏7 d后開(kāi)蓋通風(fēng)，之后每2 d開(kāi)蓋通風(fēng)一次，每次通風(fēng)10 min，以保證種薯足夠的氧氣交換。通風(fēng)后再接通風(fēng)扇電源10 min，使箱內(nèi)的香芹酮?dú)怏w分布均勻。貯藏18周時(shí)進(jìn)行6周的停藥處理，停藥處理方法為：將各處理微型薯裝于網(wǎng)袋中置于通風(fēng)干燥處充分散除藥劑并繼續(xù)貯藏至24周。貯藏期間馬鈴薯塊莖芽長(zhǎng)大于2 mm時(shí)判定為發(fā)芽，發(fā)芽率為發(fā)芽塊莖數(shù)占?jí)K莖總數(shù)的百分比，當(dāng)發(fā)芽率達(dá)到50%時(shí)判定為萌芽[16]；當(dāng)塊莖平均芽長(zhǎng)在（5±0.5）mm，且發(fā)芽率大于95%時(shí)，為種薯的最佳種植時(shí)期。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇在貯藏0、6（對(duì)照萌芽時(shí)）、18（處理停藥時(shí)）、20（處理萌芽時(shí)）和24周（處理達(dá)到適宜種植條件時(shí)）時(shí)測(cè)定對(duì)照組和處理組種薯平均芽長(zhǎng)、失重率、吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、MDA、PRO的含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）的活性。此外，采用上述香芹酮處理方法另外處理種薯3組，用于種薯芽分生組織的觀察試驗(yàn)，每10個(gè)種薯裝入1個(gè)小網(wǎng)袋，方便拿取，采用組織學(xué)分析法觀察種薯不同時(shí)期芽組織的變化情況。

圖1 自制貯藏箱示意圖（65%為微型薯體積占貯藏箱體積的百分?jǐn)?shù)）

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 平均芽長(zhǎng)及失重率的測(cè)定 平均芽長(zhǎng)的測(cè)定：每組隨機(jī)取30個(gè)種薯進(jìn)行測(cè)定，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)種薯頂芽的長(zhǎng)度，測(cè)量后取其平均值。

失重率的測(cè)定：每組處理固定10個(gè)種薯進(jìn)行測(cè)定，分別測(cè)定小網(wǎng)袋中種薯的初始質(zhì)量（1）與貯藏一段時(shí)間后的質(zhì)量（2）。

1.4.2 種薯芽分生組織的觀察 分別采集未經(jīng)香芹酮處理及香芹酮處理開(kāi)始后1—7 d、停藥后1—7 d種薯的芽分生組織若干，進(jìn)行石蠟切片前處理：每次每組隨機(jī)取1個(gè)小網(wǎng)袋的種薯，在體視鏡下使用單面刀片縱切塊莖的芽眼部位（以芽眼為中心，直徑2—3 mm），然后將組織放入FAA固定液（10%甲醛，5%冰乙酸，50%乙醇）中，在4℃條件下保存。根據(jù)KAMENETSKY[17]描述的方法處理樣品，并進(jìn)行少許修正。對(duì)前處理固定好的組織更換一次新鮮的FAA固定液，然后逐步在濃度增加的乙醇（50%，70%，83%，95%和100%）中進(jìn)行脫水，再用濃度逐漸增加的二甲苯（25%，50%，75%和100%）逐漸取代乙醇脫水劑，之后將組織浸入1﹕1（v/v）的石蠟+二甲苯混合溶液中，在42℃不斷加入石蠟粒直至飽和，升溫至58℃，更換融化好的純石蠟，每4—6 h更換一次，共更換3次。設(shè)置烤片機(jī)溫度70℃，將組織用融化好的石蠟在包埋盒底膜中進(jìn)行包埋過(guò)夜。之后將包有組織的蠟塊修整好固定在小木塊上，注意芽組織的方向，調(diào)整切片厚度為7 μm，并在切片機(jī)上進(jìn)行切片。將切好的切片涂布在載玻片上進(jìn)行展片，然后逐步在脫蠟透明液、一系列不同濃度乙醇（100%，95%，83%，70%，50%和30%）、蒸餾水中進(jìn)行脫蠟處理，之后分別在1%（w/v）番紅水溶液和0.2%（w/v）固綠水溶液中染色10 min和2 min，最后使用配有相機(jī)的BX51顯微鏡以40—100×放大倍數(shù)對(duì)組織進(jìn)行觀察并拍照。

1.4.3 生化測(cè)定取樣 分別在貯藏的0、6、18、20和24周，隨機(jī)取對(duì)照組和處理組的種薯20個(gè)，使用打孔器取以種薯芽眼為中心，直徑1 cm、長(zhǎng)1 cm的塊莖樣品5 g，用錫箔紙包好后迅速用液氮冷凍，在-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 內(nèi)源激素 ABA、IAA、GA3含量的提取與測(cè)定 稱(chēng)取約0.1 g冷凍樣品放入研缽中加液氮磨碎，加入1.0 mL甲醇/水/冰醋酸（80﹕20﹕1，V/V/V）混合溶液，4℃浸提過(guò)夜。8 000×離心10 min，離心后取出上清液，氮吹將有機(jī)溶劑去除。用0.1 mol?L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)pH至2—3，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，氮吹至干。最后用甲醇定容至0.5 mL，使用針頭式過(guò)濾器（0.22 μm）過(guò)濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)待測(cè)。ABA、IAA、GA3的含量采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇﹕乙酸水溶液（1.0%）＝40﹕60（V/V），測(cè)試條件為：紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)254 nm，流速0.8 mL?min-1，柱溫35℃，走樣時(shí)間40 min。

1.4.5 MDA和PRO含量的測(cè)定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法[18]進(jìn)行測(cè)定，PRO含量采用磺酸性茚三酮法[19]進(jìn)行測(cè)定。

1.4.6 抗氧化酶SOD、CAT、POD、PPO活性的測(cè)定 SOD活性采用核黃素-NBT光化還原法[20]進(jìn)行測(cè)定，CAT活性采用H2O2紫外吸收法[21]進(jìn)行測(cè)定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[22]進(jìn)行測(cè)定，PPO活性采用鄰苯二酚比色法[19]進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003 軟件進(jìn)行分析與作圖。采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 香芹酮處理對(duì)馬鈴薯種薯貯藏期間芽長(zhǎng)和失重率的影響

種薯貯藏6周時(shí)，對(duì)照種薯處于萌芽狀態(tài)，平均芽長(zhǎng)為2.61 mm；貯藏18周時(shí)，對(duì)照發(fā)芽率和芽長(zhǎng)分別為100%和32.26 mm，芽長(zhǎng)顯著高于處理芽長(zhǎng)（0.91 mm）（＜0.05），此時(shí)香芹酮處理的種薯發(fā)芽率為0并仍處于休眠期；隨后進(jìn)行停藥處理并繼續(xù)貯藏至20周時(shí)，處理種薯處于萌芽狀態(tài)，其芽長(zhǎng)為2.16 mm；貯藏24周時(shí)，對(duì)照芽長(zhǎng)達(dá)51.02 mm，而處理芽長(zhǎng)僅為4.77 mm且發(fā)芽率達(dá)96.67%，說(shuō)明香芹酮處理可調(diào)控種薯的發(fā)芽和芽長(zhǎng)，使處理芽長(zhǎng)達(dá)到適宜種植的條件（圖2-a）。貯藏期間，對(duì)照和處理種薯的失重率均逐漸升高（圖2-b），而處理的失重率顯著低于對(duì)照（＜0.05）。在貯藏18周和24周時(shí)，處理失重率分別比對(duì)照降低了46.84% 和49.76%。說(shuō)明香芹酮處理可降低馬鈴薯種薯貯藏期間的失重率。

*代表處理間顯著性差異（P＜0.05）。下同* indicate significant differences (P＜0.05). The same as below

2.2 香芹酮處理對(duì)種薯芽分生組織的影響

顯微觀察發(fā)現(xiàn)，未進(jìn)行香芹酮處理的種薯芽眼分生組織保持著生長(zhǎng)活力，但尚未開(kāi)始萌動(dòng)，芽尖因空氣氧化而導(dǎo)致輕微的壞死（圖3-a）。經(jīng)香芹酮處理2 d后，芽分生組織末端和維管組織變黑（圖3-b），并在接下來(lái)的幾天芽分生組織逐漸壞死，5—7 d后整個(gè)頂端分生組織完全壞死（圖3-c）。此時(shí)在種薯芽眼處肉眼可見(jiàn)黑色的小芽，經(jīng)測(cè)量這些芽的芽長(zhǎng)不到2 mm。圖3-d為香芹酮處理停藥3 d后，隨著香芹酮藥效的散除，在壞死的頂芽分生組織旁邊腋芽開(kāi)始生長(zhǎng)。停藥7 d后，在壞死的頂芽周?chē)饾u長(zhǎng)出對(duì)稱(chēng)的腋芽（圖3-e）。圖3-f為處理停藥14 d即貯藏20周時(shí)香芹酮處理的種薯，可肉眼觀察到腋芽的萌發(fā)，每個(gè)芽眼處的腋芽生長(zhǎng)速度一致。貯藏24周時(shí)，可見(jiàn)對(duì)照種薯發(fā)芽呈現(xiàn)明顯的頂端優(yōu)勢(shì)（圖3-g），而處理的種薯發(fā)芽不存在對(duì)照這樣明顯的頂端優(yōu)勢(shì)（圖3-h）。

2.3 香芹酮處理對(duì)種薯貯藏期間內(nèi)源ABA、IAA和GA3含量的影響

ABA被認(rèn)為對(duì)塊莖休眠有維持作用。貯藏期間，對(duì)照和香芹酮處理的種薯ABA含量隨著貯藏期的延長(zhǎng)呈整體下降趨勢(shì)，且處理組ABA含量顯著高于對(duì)照（＜0.05）（圖4-a）。對(duì)照ABA含量在貯藏6周時(shí)相比貯藏初始下降了52.23%，說(shuō)明種薯萌芽后，ABA含量迅速下降。貯藏0—18周，香芹酮處理種薯的ABA含量一直較高且變化平穩(wěn)，貯藏18周時(shí)，香芹酮處理的ABA含量是對(duì)照的1.97倍（＜0.05）；經(jīng)停藥后，香芹酮處理的ABA含量出現(xiàn)快速降低的趨勢(shì)，與圖2-a結(jié)果一致，此時(shí)處理組薯芽開(kāi)始萌發(fā)。IAA對(duì)休眠打破后芽的生長(zhǎng)有調(diào)控作用。從圖4-b可以看出，貯藏期間，對(duì)照和香芹酮處理種薯IAA的含量呈現(xiàn)整體增加的趨勢(shì)，且香芹酮處理IAA含量顯著低于對(duì)照（＜0.05）。在貯藏6周和18周，香芹酮處理IAA含量比對(duì)照分別降低了40.97%和42.22%；進(jìn)行香芹酮停藥處理后IAA含量則呈現(xiàn)快速增加的趨勢(shì)，貯藏20周和24周，香芹酮處理IAA的含量?jī)H比對(duì)照分別降低17.32%和9.37%。圖4-c為香芹酮處理對(duì)種薯GA3含量的影響，從圖中可以看出對(duì)照和香芹酮處理種薯GA3的含量呈先增加后降低的趨勢(shì)。對(duì)照在貯藏6周時(shí)種薯GA3含量達(dá)到峰值（0.83 μg?g-1FW），而處理組GA3含量在貯藏20周時(shí)達(dá)到峰值（0.61 μg?g-1FW），說(shuō)明GA3在種薯萌發(fā)時(shí)含量較高，香芹酮處理推遲了GA3峰值的出現(xiàn)。塊莖在休眠和萌芽過(guò)程中促進(jìn)和抑制生長(zhǎng)類(lèi)植物激素之間存在著平衡關(guān)系，從圖4-d看出，當(dāng)（GA3+IAA）/ABA＜1，即GA3+IAA＜ABA時(shí)，抑制生長(zhǎng)類(lèi)激素占優(yōu)勢(shì)，種薯處于休眠期；當(dāng)（GA3+IAA）/ABA＞1，即GA3+IAA＞ABA時(shí)，促進(jìn)生長(zhǎng)類(lèi)激素占優(yōu)勢(shì)，種薯休眠被打破、開(kāi)始萌芽，對(duì)照和處理組的（GA3+IAA）/ABA比值變化分別在貯藏6周和20周出現(xiàn)（GA3+IAA）/ABA＞1的拐點(diǎn)，說(shuō)明香芹酮處理通過(guò)改變激素水平調(diào)控種薯的發(fā)芽。

a：未處理前種薯芽眼處分生組織；b：香芹酮處理2 d后芽的分生組織；c：香芹酮處理7 d后芽的分生組織；d：香芹酮處理停藥3 d后在壞死的頂芽分生組織旁邊，腋芽開(kāi)始生長(zhǎng)；e：香芹酮處理停藥7 d后在壞死的頂芽周?chē)饾u長(zhǎng)出對(duì)稱(chēng)的腋芽；f：香芹酮停藥14 d即貯藏20周時(shí)香芹酮處理的種薯；g：貯藏24周時(shí)對(duì)照；h：香芹酮處理的種薯。比例尺為100 μm（a、b、c），200 μm（d、e）

2.4 香芹酮處理對(duì)種薯貯藏期間MDA和PRO含量的影響

貯藏期間，對(duì)照和香芹酮處理種薯MDA含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加（圖5-a），處理種薯的MDA含量比對(duì)照低15.04%—25.90%（＜0.05），說(shuō)明香芹酮處理降低了種薯中MDA的累積。從圖5-b可以看出，貯藏期間，對(duì)照種薯PRO含量曲線呈先降低后增加然后趨于平緩的趨勢(shì)，而香芹酮處理的種薯PRO含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明種薯萌芽時(shí)PRO含量發(fā)生下降；此外，處理組種薯PRO的含量比對(duì)照顯著增加了24.59%—54.45%（＜0.05），說(shuō)明香芹酮處理提高了種薯中PRO的含量。

2.5 香芹酮處理對(duì)種薯貯藏期間SOD、CAT、POD和PPO活性的影響

貯藏期間，對(duì)照和香芹酮處理種薯的SOD活性呈總體下降趨勢(shì)（圖6-a），說(shuō)明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，塊莖逐漸發(fā)生生理老化，SOD不斷抵御O2-而降低了其活性?？傮w來(lái)說(shuō)，香芹酮處理種薯的SOD活性比對(duì)照高18.86%—35.56%（＜0.05），香芹酮處理提高了種薯的SOD活性。對(duì)照和香芹酮處理種薯的CAT活性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而呈整體降低趨勢(shì)，且香芹酮處理種薯的CAT活性比對(duì)照高14.34%—31.97%（＜0.05），說(shuō)明香芹酮處理增加了種薯的CAT活性，使CAT清除H2O2能力較對(duì)照增強(qiáng)（圖6-b）。貯藏6周時(shí)，對(duì)照和香芹酮處理種薯的POD活性分別比貯藏初始時(shí)降低了78.31%和33.47%，說(shuō)明對(duì)照種薯萌芽后POD活性迅速下降，而香芹酮處理種薯的POD活性是對(duì)照的1.87—3.07倍（＜0.05），說(shuō)明香芹酮處理抑制了POD活性的降低（圖6-c）。貯藏期間，對(duì)照和香芹酮處理種薯的PPO活性呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì)，香芹酮處理種薯的PPO活性比對(duì)照高26.00%—36.41%（＜0.05），說(shuō)明香芹酮處理提高了種薯的PPO活性（圖6-d）。

3 討論

HMG-CoA還原酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，HMG-CoA還原酶是甲羥戊酸途徑中催化限速反應(yīng)的關(guān)鍵酶[23]。甲羥戊酸途徑是生產(chǎn)大量異戊二烯及其衍生物的重要途徑，從膽固醇生物合成到生長(zhǎng)控制，它是多種細(xì)胞功能的重要組成部分。在植物中，甲羥戊酸途徑對(duì)許多重要次生代謝物的產(chǎn)生非常重要，其中包括植物激素如脫落酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、膜成分和光合作用所需的成分等[24]。而植物激素被認(rèn)為是調(diào)節(jié)馬鈴薯休眠與發(fā)芽最重要的內(nèi)部因素[5]，通過(guò)改變特定激素水平或調(diào)節(jié)這些激素的相對(duì)含量來(lái)調(diào)節(jié)塊莖的休眠，塊莖組織對(duì)特定激素的敏感性也隨著生理衰老過(guò)程而改變[25]。ABA是馬鈴薯中提取到的一種復(fù)合體物質(zhì)2抑制物的內(nèi)源成分之一，在休眠塊莖中含量最高，并在貯藏過(guò)程中含量下降，它是誘導(dǎo)和維持馬鈴薯塊莖休眠所必需的物質(zhì)，通過(guò)干擾細(xì)胞壁的松弛來(lái)抑制細(xì)胞擴(kuò)張從而抑制薯芽萌發(fā)[26]。IAA是馬鈴薯發(fā)芽生長(zhǎng)所必需的物質(zhì)，它能促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)張和細(xì)胞分裂[27]；但它對(duì)休眠沒(méi)有任何影響，只在打破休眠并發(fā)芽的塊莖中增加[28]。GA3具有促進(jìn)種薯發(fā)芽的作用，在塊莖休眠時(shí)GA3含量很少，當(dāng)休眠解除、開(kāi)始萌芽時(shí)含量迅速增加，在控制隨后的發(fā)芽生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用[29]。OOSTERHAVEN等[15]發(fā)現(xiàn)，香芹酮在抑制馬鈴薯發(fā)芽的同時(shí)會(huì)促進(jìn)HMG-CoA還原酶的降解，并且這種作用具有可逆性。因此，根據(jù)本研究結(jié)果推斷，香芹酮對(duì)種薯發(fā)芽調(diào)控的機(jī)制可能是：當(dāng)香芹酮作用于種薯時(shí)，它通過(guò)抑制HMG-CoA還原酶促進(jìn)了ABA的合成，阻礙了IAA和GA3的合成，從而抑制了種薯的發(fā)芽；當(dāng)香芹酮作用移除后，HMG-CoA還原酶活性增加，抑制了ABA含量，提高了IAA和GA3的含量，使種薯休眠被解除。此外，從香芹酮對(duì)種薯芽分生組織的影響中觀察到，未經(jīng)香芹酮處理的種薯由于頂端優(yōu)勢(shì)的作用，芽眼中最先活躍出的是頂芽，而腋芽受到抑制。香芹酮作用于種薯2 d后就開(kāi)始損傷頂芽分生組織末端和維管束組織，5—7 d就可以造成頂端分生組織的壞死，這與TEPER-BAMNOLKER等[4]的研究結(jié)果一致。一方面可能是香芹酮對(duì)上述激素調(diào)控的原因使頂芽生長(zhǎng)速度受到抑制；另一方面是由于香芹酮分子結(jié)構(gòu)決定了它親脂性的生物活性，損傷了芽分生組織的細(xì)胞膜而造成頂芽的壞死，腋芽則受到激素調(diào)控而被抑制并仍然保持著發(fā)芽活力。在停藥處理3 d后，觀察到香芹酮作用減弱，通過(guò)甲羥戊酸途徑改變了種薯內(nèi)源激素水平，從而促進(jìn)了腋芽的生長(zhǎng)。

活性氧在協(xié)助種子打破休眠進(jìn)而促進(jìn)發(fā)芽過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種作物種子發(fā)芽都跟活性氧的產(chǎn)生有密切關(guān)系[30-31]。普遍認(rèn)為活性氧促進(jìn)種子發(fā)芽的機(jī)理為活性氧可將ABA迅速降解，并促進(jìn)基因的表達(dá)而大量合成GA，使種子打破休眠而促進(jìn)發(fā)芽[32-33]。發(fā)芽過(guò)程中積累的過(guò)量活性氧可直接攻擊膜系統(tǒng)中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化。MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，常被用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞膜系統(tǒng)受傷害的程度[34]，其含量的增加是塊莖發(fā)生衰老的標(biāo)志。本研究結(jié)果表明，香芹酮處理能顯著抑制種薯中MDA的積累，葉旭等[35]也發(fā)現(xiàn)薄荷醇和茉莉精油在抑制馬鈴薯發(fā)芽的同時(shí)，可降低馬鈴薯中MDA的含量。此外，本研究發(fā)現(xiàn)香芹酮處理提高了種薯中PRO的含量，PRO是植物體內(nèi)最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，PRO的增加可抵御植物體因過(guò)量活性氧積累導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化而引起膜功能受損或結(jié)構(gòu)破壞。此外，COLEMAN等[36]曾研究指出，塊莖中PRO的含量與ABA水平呈正相關(guān)，ABA可使馬鈴薯中PRO的含量累積。本研究發(fā)現(xiàn)，香芹酮處理提高了種薯中ABA的含量，PRO的含量也相應(yīng)升高，這與COLEMAN等[36]的研究結(jié)果一致。

香芹酮處理可顯著提高種薯中SOD、CAT、POD和PPO的活性。其中SOD、CAT和POD作為活性氧清除酶系統(tǒng)中3種重要的抗氧化酶，能有效地阻止活性氧的積累，因此，香芹酮處理能夠維持休眠、控制種薯的芽長(zhǎng)和防止膜脂過(guò)氧化。此外，POD是IAA側(cè)鏈氧化酶，其活性與IAA含量呈反比，因此，POD也是調(diào)控塊莖休眠與萌發(fā)生理代謝的關(guān)鍵酶之一[16]。貯藏期間，對(duì)照和香芹酮處理種薯的PPO活性逐漸降低，這與王鵬等[37]的研究結(jié)果一致。PPO是呼吸系統(tǒng)的末端氧化酶，能催化酚類(lèi)物質(zhì)的氧化分解，楊曉玲等[38]研究證明馬鈴薯塊莖中含有促進(jìn)發(fā)芽的酚類(lèi)物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，香芹酮處理種薯的PPO活性顯著高于對(duì)照，說(shuō)明香芹酮處理減少了種薯中促進(jìn)發(fā)芽的酚類(lèi)物質(zhì)，因此抑制了薯芽的生長(zhǎng)。香芹酮所涉及的其他作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

香芹酮處理可調(diào)控種薯的發(fā)芽和芽長(zhǎng)，降低種薯失重率和膜脂過(guò)氧化程度，延緩種薯的生理老化。香芹酮通過(guò)促進(jìn)/抑制甲羥戊酸途徑中的HMG-CoA還原酶調(diào)節(jié)種薯中內(nèi)源激素ABA、IAA和GA3的含量，損傷頂芽分生組織和維管束組織，調(diào)控了對(duì)種薯頂芽的抑制與腋芽的萌發(fā)。此外，香芹酮處理還可通過(guò)提高種薯的SOD、CAT和PPO的活性清除過(guò)量活性氧，以減少種薯中促進(jìn)發(fā)芽的酚類(lèi)物質(zhì)，來(lái)達(dá)到調(diào)控種薯發(fā)芽和芽長(zhǎng)的目的。

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Regulation Mechanism of Carvone on Seed Potato Sprouting

GE Xia, XU Rui, LI Mei, TIAN JiaChun, LI ShouQiang, CHENG JianXin, TIAN ShiLong

(1Institute of Agricultural Products Storage and Processing, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070;2Animal Husbandry, Pasture and Green Agriculture Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070;3Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070)

【】 Carvone is a common monoterpene in plant essential oils. In this study, the partial regulation mechanism of carvone on seed potato sprouting was explored from the aspects of hormone regulation and membrane lipid peroxidation.【】The cultivar Qingshu 9 was used as experimental material. The method of treatment was using 0.3 mL carvone per kilogram of tuber for 18 weeks, and then stopping chemical for 6 weeks before planting. At the same time, the treatment without using carvone was as control group. Sprout length, weight loss, abscisic acid (ABA), indoleacetic acid (IAA), gibberellic acid (GA3), malondialdehyde (MDA) and proline (PRO) contents, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), polyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (POD) enzyme activities were determined under different storage periods (at 0, 6, 18, 20 and 24 week). Meanwhile, the bud meristem of seed potato was sectioned and analyzed by microimaging regularly. 【】 Carvone treatment could regulate potato sprouting and the sprout length, and reduce the weight loss of seed potatoes. After 24 weeks of storage, the sprout length of the treated seed potatoes was 4.77 mm, significantly lower than that of the control group (51.02 mm), and the weight loss was reduced by 49.76%. Carvone treatment inhibited the growth of apical buds by damaging apical meristem and vascular tissue, which did not affect the emergence of axillary buds. During storage, carvone treatment significantly increased the ABA content, inhibited the IAA content, delayed the peak of GA3content and the appearance of (GA3+IAA) /ABA ＞1 inflection point. For the carvone reated potatoes, MDA content in potato was 15.04%-25.90% lower than control group; PRO content was 24.59%-54.45% higher than control group; the activities of SOD, CAT and PPO were 18.86%-35.56%, 14.34%-31.97% and 26.00%-36.41% higher than control group, respectively; POD activity of treated potatoes was 1.87-3.07 times that of control group.【】Carvone treatment adjusted the ABA, IAA and GA3contents of seed potatoes by promoting/inhibiting 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase) in the mevalonate pathway, and regulated the inhibition of the apical bud. In addition, it increased antioxidant enzymes activities, reduced the degree of membrane lipid peroxidation and alleviated seed potato aging.

carvone; regulation of potato sprouting; endogenous hormone; membrane lipid peroxidation; tissue slice

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.017

2020-04-08；

2020-09-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31660479，31860459）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-09-P26）、甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2017GAAS31）

葛霞，E-mail：12660940@qq.com。通信作者田世龍，E-mail：723619635@qq.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）