黃花蒿種子形態(tài)與幼苗生長的地源差異及相關性

霍鴻浩，楊占南，羅世瓊，張曲玲，韋小芳，趙 鋮，扶 蝶

(1. 貴州師范大學貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州 貴陽 550001； 2.貴州師范大學生命科學學院，貴州 貴陽 550001)

【研究意義】種子作為種子植物的繁殖體，繼承了母體的遺傳物質，體現(xiàn)母體適應環(huán)境和進化下的繁殖對策[1]，根據生活史對策理論，不同地源種群所處的生境不同，勢必導致種群間個體表現(xiàn)不同，即出現(xiàn)不同的表現(xiàn)型并通過種子影響后期植物的命運[2]，這也是藥用植物形成道地性的原因之一[3]。其中種子大小是植物生活史策略的一個核心特征及植物分類及遺傳研究的重要指標，在植物的諸多性狀的研究中，處于中心地位[4]。而研究草本植物種子大小的地源差異及幼苗的更新策略關系對中藥材生產有重要意義。種子種苗是藥材生產最基本、最重要的生產資料，優(yōu)良的種子及種苗是提高藥材產量和質量的先決條件[5]。黃花蒿 (ArtemisiaannuaL.) 俗稱中藥里的“青蒿”，為菊科蒿屬1年生草本植物，具有清熱解暑，除蒸截瘧，退黃等功效，為我國傳統(tǒng)的中草藥[6]。近代醫(yī)學研究表明，黃花蒿所含的多種生物活性成分，如倍半萜類 (包括青蒿素)、黃酮類、多糖類、香豆素類、揮發(fā)油類及酚類等，有抗瘧疾[7]、抗癌[8]、抗炎抗菌[9]、抗腫瘤[10]和抗氧化及較強的免疫活性[11]等作用。其青蒿素可治療瘧疾最引人注目，日前已成為我國唯一獲得國際承認的擾瘧藥物，而黃花蒿是提取青蒿素的唯一天然原料來源[12]。我國雖然大部分地區(qū)均有黃花蒿分布，但不同產地黃花蒿的藥效組分與其植物產量差異顯著，加之黃花蒿植物的自交障礙導致性狀不穩(wěn)定，增加了黃花蒿資源利用難度[13]?！厩叭搜芯窟M展】目前黃花蒿不同環(huán)境因子下的資源地理分布差異的研究較多[14-15]，但種子形態(tài)的地源差異及差異對幼苗生長的影響研究報道很少，不同地源黃花蒿種群的不同繁殖對策導致種子形態(tài)和營養(yǎng)成分顯著差異，這種差異對植物后期的生長有重要影響?！颈狙芯壳腥朦c】黃花蒿種子萌發(fā)及幼苗的形成階段受遺傳物質和環(huán)境的影響，為了排除不同地源環(huán)境因素的影響，有必要對不同種源種子在相同環(huán)境條件下進行萌發(fā)試驗?！緮M解決的關鍵問題】試驗以貴州為主的不同地源黃花蒿種子為研究對象，比較黃花蒿種子在不同地理空間格局下的形態(tài)學差異，并在溫室內比較萌發(fā)及幼苗生長狀況，建立地理因子與相關性分析，對種質資源進行地理聚類及綜合評價，揭示不同地理格局的種子變異規(guī)律。為黃花蒿種子篩選與形態(tài)研究提供實踐參考，也為黃花蒿品種選育、品質鑒定以及種質資源評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2017年11月中旬種子成熟期間，按經度、緯度和海拔梯度設置樣地，在貴州、甘肅、湖南3個省境內實地采集11個種群野生黃花蒿種子，采樣地理信息見表1。采樣時建立20 m × 20 m的采樣地，收割健康果期黃花蒿地上部分，帶回實驗室陰干干燥保存。隨機取樣，去除枝葉，過1 mm篩去除苞片小花等雜質，再用0.18 mm細篩去其他細小雜質，篩選后種子分別編號儲藏于通風干燥處備用。

1.2 方法

1.2.1 種子形態(tài)測定 用鑷子小心從篩選樣品中分出凈種子，按不同地源編號，在顯微鏡下觀察種子形態(tài)，并使用OPTPro軟件隨機讀取10組成熟飽滿端正黃花蒿種子的長 (Ls)、寬值 (Ws)，計算出長寬比 (Ls/Ws)[16]。千粒重使用萬分之一天平，每種源挑100粒健康飽滿的種子測量，重復3次取平均值。

1.2.2 盆栽土處理及種子萌發(fā)幼苗試驗 試驗地點在貴州師范大學貴州省山地環(huán)境重點實驗室。實驗采用盆栽培養(yǎng)，盆栽土來自貴陽阿栗山的天然有機土，黑褐色、輕質。土壤拌勻晾曬3 d后均勻裝盆，并進行土壤背景值測定，土壤pH 7.12，含有機質 56.7 g /kg、全氮1.75 g/kg、全鉀11.6 g/kg，有效鉀348.8 mg/kg，有效磷59.56 mg /kg。育苗盆每盆100粒凈種子均勻平鋪，再均勻覆蓋3 cm細沙土，小心澆水濕潤。于(25±1) ℃ 恒溫室、自然光照下培養(yǎng)，每天記錄發(fā)芽情況直至發(fā)芽結束，發(fā)芽數以子葉突破薄土層為準。萌發(fā)結束后繼續(xù)培養(yǎng)幼苗，觀察幼苗生長與形態(tài)至第20天結束試驗。

表1 黃花蒿種源采集地信息

1.2.3 幼苗形態(tài)測定 利用電子游標卡尺測量不同地源幼苗莖長、根長、第一對真葉長、寬。記錄幼苗真葉數并使用萬分之一天平測量植株鮮重、子葉鮮種，重復5次計算平均值、方差、變異系數。

1.3 數據分析

數據通過 Excel 統(tǒng)計分析與作圖，SPSS17.0 統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和顯著性檢驗。利用 Pearson相關分析法分析各指標間的相關性；并綜合各項指標進行聚類分析對種子進行全面評價。R語言建立種子形態(tài)與幼苗特征與主要環(huán)境因子的冗余(RDA)分析。RDA分析法能有效對多個環(huán)境指標進行統(tǒng)計檢驗，可更好地反映群落特征與環(huán)境因子之間的關系。通過環(huán)境因子箭頭在橫坐標上作垂線，投影線段最長的為最主要的環(huán)境因子，通過參數箭頭之間的夾角來表示參數與環(huán)境因子之間的相關性，夾角越小，表示相關性越高，夾角為銳角表示正相關，夾角為鈍角表示負相關，夾角接近直角表示相關性很小[17]。

萌發(fā)率=發(fā)芽種子總數/供試種子總數×100 %

變異系數 (c.v.) 表示表型性狀的離散性特征，變異系數越大，性狀值離散程度越大[18]。

c.v.=標準差/平均值×100 %

2 結果與分析

2.1 黃花蒿種子形態(tài)觀察

黃花蒿為1年生草本植物，由于環(huán)境因子不同導致黃花蒿的生殖對策有所不同，不同地源黃花蒿的花期在8-10月，果期在10月至11月中旬。觀察發(fā)現(xiàn)，來自11個地方的黃花蒿花序、小花、種子在大小形態(tài)上各異，但是也有共同的特征。由圖1可見，果期的黃花蒿葉片分化成球形頭狀花序，黃色球形，下垂密集分布在全株中上部；每一頭狀花序有短花柄，并由2～3層線形苞片組成，在光學顯微鏡下觀察，苞片中央不透明，邊緣呈淡黃色并成膜質狀而透明。總苞有小花若干，均為管狀花，種子微小，在顯微鏡下可見不同地源黃花蒿種子均呈梨形或倒卵形瘦果，表面淡黃綠色，無毛，具有隆起的縱條紋及不規(guī)則的網狀條紋。

2.2 黃花蒿種子形狀特征的地源變異

從表2可知，各采集地源黃花蒿種子平均長、寬均出現(xiàn)明顯的變異特征。其中 Ls 在606.7 ～860.4 μm，平均為751.5 μm。Ws 在280.3～417.7 μm，平均為363.6 μm。長寬比以LD最小，為2.00；SS最大，為2.24，所有地源的平均為2.06，可見SS的種子較其他地源最為狹長。千粒重最大的地源是LP，平均為0.0665 g；LD最小，為0.0538 g。根據計算性狀在11個地源間的變異系數，各性狀值離散程度由大到小依次為Ws (10.40 %)>Ls (9.94 %)>千粒重 (7.13 %)>Ls /Ws (3.31 %)，表明Ws在地源間變化最大，長寬比最小。經方差分析，黃花蒿種子的Ls/Ms在不同地源間差異顯著 (P= 0.027*)，Ls、Ms、千粒重在不同地源間差異極顯著 (P=0.000**)，可見種子大小存在明顯的地理變異。

2.3 不同地源黃花蒿種子萌發(fā)及幼苗生長差異

黃花蒿種子無休眠期，在濕潤溫暖環(huán)境下萌發(fā)較易。從表3可知，不同地源間種子萌發(fā)率及幼苗表現(xiàn)存在不同程度變異。萌發(fā)率依次為JH

A為黃花蒿種子，B為黃花蒿花苞苞片，C為黃花蒿花序，D為黃花蒿的兩性花A.A.annua seed; B.A.annua bud bracts; C.A.annua inflorescence; D.bisexual flower of A.annua圖1 黃花蒿種子及附屬物Fig.1 Seeds and appendages of A.annua

表2 黃花蒿種子大小與變異特征

2.4 不同地源黃花蒿種子表型性狀間的相關性

從表4可知，種子特征與苗期各指標間存在不同程度的相關性。其中Ls與Ws、根長、真葉數和子葉鮮重顯著相關，與莖長極顯著相關。Ls/Ws與各指標均無顯著相關性。種子千粒重與Ls、Ws均成顯著正相關，說明黃花蒿種子越長越寬其千粒重越大。種子千粒重與子葉鮮重、真葉數、根長、莖長、干重呈極顯著正相關，說明種子千粒重為鑒定黃花蒿種子質量的重要指標，其千粒重越大子葉鮮重越大，為幼苗的生長營養(yǎng)儲存更多的營養(yǎng)與能量。

表3 黃花蒿種子萌發(fā)率及幼苗形態(tài)指標與變異特征

2.5 表型性狀與地理生態(tài)因子間的RDA分析

從圖2可知，不同地理因子對黃花蒿種子和萌發(fā)的影響大小存在差異。年降水量是最主要的影響因子，其次是經度、緯度和海拔高度。其中，年降水量和經度與各指標呈不同程度的正相關，即隨著年降水量和經度的增加，Ls、Ws、千粒重和幼苗的萌發(fā)率、莖長、干重及葉片大小均越大。緯度與海拔和各指標呈不同程度的負相關，海拔越高、緯度越高的地源，黃花蒿種子長寬、千粒重及幼苗萌發(fā)率越低。Ls/Ws與各環(huán)境因子相關程度不大，可能與Ls/Ws大小在各地源相對穩(wěn)定有關。

2.6 地理聚類分析

從圖3可知，11群體劃分為3個類群。XBS、SY、LP聚為1類，綜合品質表現(xiàn)最好； JH、HX、KY、WX、XW和SS聚為1類； QX、LD聚為第3類，綜合品質表現(xiàn)最差。

圖2 黃花蒿種子及幼苗各特征參數與地理因子的RDA分析Fig.2 Redundancy analysis of characteristic parameters and geographical factors of seeds and seedlings of A.annua

3 討 論

種子形態(tài)研究不僅可以為植物科、屬和種分類提供依據，而且可以為該屬系統(tǒng)演化提供有價值的參考資料[19]。11個地源黃花蒿均呈梨形或倒卵形瘦果，表面淡黃綠色，具有隆起的縱條紋及不規(guī)則的網狀條紋，初步說明不同地源空間黃花蒿種子形態(tài)基本穩(wěn)定。但是不同地源黃花蒿Ls、Ws、千粒重差異極顯著，Ls/Ws差異顯著，變異程度Ws>Ls>千粒重>Ls/Ws，種子寬對變異貢獻最大。表明黃花蒿種子的大小及重量在不同生態(tài)條件下并不是穩(wěn)定的，且具有一定的遺傳性，與韋美麗[20]不同種源在云南氣候下種植下的種子形態(tài)差異的研究結果相似。說明不同地源黃花蒿種子變異程度較大，可能是因為黃花蒿作為抗旱抗瘠的先鋒植物，在我國各地廣泛分布，能適應各種環(huán)境。

種子萌發(fā)、幼苗生長和植株成熟結果被視為植物生活史的三大特征[21]，其有性繁殖體—種子，是其重要的連接點。種子萌發(fā)受到遺傳物質和復雜生境的影響，而利用種子形態(tài)來研究物種的遺傳變異是直接可行的手段。為了排除復雜生境的干擾，對不同地源黃花蒿種子在相同適宜的環(huán)境下進行萌發(fā)，結果表明不同地源黃花蒿種子萌發(fā)率、根長、莖長、干重、子葉鮮重、真葉數、真葉長、真葉寬等指標在一定范圍內變化，說明不同地源黃花蒿種子在環(huán)境異質性下產生了變異，且會通過遺傳繼續(xù)影響后代幼苗的更新及生活史對策。通過種子大小與幼苗特征的相關性分析發(fā)現(xiàn)，黃花蒿種子千粒重對幼苗各個指標均呈極顯著正相關(萌發(fā)率除外)，說明千粒重可以作為黃花蒿引種的重要指標。故認為前人發(fā)現(xiàn)黃花蒿資源目標性狀的差異均可能直接來自種子的遺傳差異。朱衛(wèi)平[22]通過采集3個種源的黃花蒿種子進行人工種植試驗發(fā)現(xiàn)，葉的形態(tài)與青篙素的含量關系密切，其中以狹裂絲狀型的葉片青蒿素的含量最高。楊美權[23]通過采集67份黃花蒿種質在昆明進行種植，發(fā)現(xiàn)21個農藝性狀的差異。韋樹根[24]采集主產區(qū)72份引種在廣西南寧和靖西，發(fā)現(xiàn)不同黃花蒿種質之間的葉片產量和青蒿素質量差異顯著。

圖3 黃花蒿種子及幼苗表型性狀聚類Fig.3 Clustering of phenotypic traits of seeds and seedlings of A.annua

通過R語言建立種子形態(tài)與幼苗特征與主要環(huán)境因子的冗余分析結果顯示，年降雨量為主要影響種子表現(xiàn)的因子，表明原位環(huán)境更濕潤的黃花蒿種子表現(xiàn)更優(yōu)，與黃花蒿喜向陽潮濕環(huán)境的結果一致[25]。也有研究解釋了種子大小差異是對適應干旱擾動的響應，如在干旱條件下，Pastinacasativa小粒種子幼苗比其大粒種子幼苗蒸騰水分少[26]。研究發(fā)現(xiàn)，采集地由西向東，由北向南變化的同時，黃花蒿種子的大小、質量越大，這與我國黃花蒿優(yōu)質資源的分布相似[27]，可見種子的品質與資源的優(yōu)質有一定相關性。

種子品質較好的地源為貴州省貴陽云巖區(qū)相寶山、黎平城關鎮(zhèn)與湖南省邵陽隆回縣開智村。RDA分析的結果有一定差異，說明影響種子品質的因素復雜，除了氣候，還受到土壤、生物及人為等因素相互聯(lián)系制約的影響，不能單一環(huán)境因子對黃花蒿種子資源進行預測評價，各環(huán)境生物因子及非生物因子對植物的單一影響共同組成了物種的地理變異規(guī)律，要結合種子形態(tài)觀察和萌發(fā)試驗，對優(yōu)質種質潛力做進一步篩選。種源的優(yōu)質對植株后期的生長及后代種子的影響還有待下一步的實驗觀察及田間試驗驗證，為地區(qū)用種及合理調撥提供科學依據。

4 結 論

顯微鏡下不同地源黃花蒿種子形態(tài)均呈表面黃綠色梨形或倒卵形瘦果，不同地源黃花蒿種子的長寬比差異顯著；Ls，Ws、千粒重差異極顯著，變異程度Ws>Ls>千粒重>Ls/Ws。不同地源黃花蒿種子萌發(fā)率、根長、莖長、干重、子葉鮮重、真葉數、真葉長、真葉寬均有不同程度的變異。年降水量為影響黃花蒿種子表型差異的主要相關因子，其次是經度、緯度、海拔。綜合種子形態(tài)及幼苗生長狀況將11個地源種子初步劃分為3個組群。黃花蒿種子大小形態(tài)受環(huán)境因子影響存在明顯的地理變異，這對于黃花蒿種源評價及種子調撥生產具有重要參考價值。