煙蒜輪作對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

徐新雯，林正全，拓陽陽*，陳玉藍(lán)，李 斌，丁亞茹，李紅麗，王 巖，孫志平

(1.四川省煙草公司涼山州公司德昌分公司，四川 德昌 615500；2.四川省煙草公司涼山州公司寧南分公司，四川 寧南 615400；3.四川省煙草公司涼山州公司，四川 西昌 615000；4.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001)

【研究意義】土壤是作物生長(zhǎng)養(yǎng)分的主要來源，健康土壤是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)作物的重要條件之一。土壤健康與否是土壤的物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)以及形成這些性質(zhì)重要過程的綜合體現(xiàn)[1]，健康的土壤具有較高的生物多樣性和較高水平的內(nèi)部養(yǎng)分循環(huán)。土壤微生物參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)、有機(jī)物分解、腐殖質(zhì)形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等生化過程，其豐度和多樣性對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要作用，其變化與土壤結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分循環(huán)、病害防治等密切相關(guān)[2]。土壤不健康的一個(gè)重要體現(xiàn)是土傳病害的流行，它是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡和惡化的結(jié)果。通過采取有效措施改善土壤微生物結(jié)構(gòu)，特別是改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，對(duì)抗病具有重要作用，如假單胞菌、芽孢桿菌和農(nóng)桿菌有促進(jìn)作物生長(zhǎng)和增強(qiáng)抵抗病原菌的功能[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】張凱煜等[4]研究表明有機(jī)肥能提高細(xì)菌數(shù)量及多樣性，不同施肥措施顯著改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。涂勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)大豆與烤煙套作顯著增加細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，降低烤煙土傳病害的發(fā)生，且病害的發(fā)生與根際土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量顯著負(fù)相關(guān)，與真菌數(shù)量極顯著正相關(guān)。陽顯斌等[6]研究表明煙蒜輪作與套作根際土壤細(xì)菌含量高于單作烤煙，解磷解鉀菌含量在烤煙中后期也高于單作烤煙，研究只檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)微生物，沒有檢測(cè)煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，分析健康煙田和煙蒜輪作土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，以及大蒜對(duì)后期煙草生長(zhǎng)過程根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化，探討煙田健康土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及大蒜對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】為尋找煙草土傳病害有效的生物防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙田概況與取樣

試驗(yàn)田為四川涼山州德昌縣德州鎮(zhèn)鳳凰村4社，經(jīng)度102°11′17″，緯度27°25′40″，海拔1560 m。編號(hào)2_1的為健康煙田(往年平均發(fā)病率5 %，幾乎不發(fā)病)，種煙前空閑，土壤pH值為5.50。2_2為易感病煙田(往年平均發(fā)病率為50 %)，主要是黒脛病及根腐病混合發(fā)病，前茬為大蒜，土壤pH值為5.22。分別于煙草移栽前、旺長(zhǎng)期和成熟期采土樣，按5點(diǎn)取樣法，移栽前取5～30 cm土壤，旺長(zhǎng)期和成熟期取根際土壤，將土壤混勻取約1 kg，每個(gè)試驗(yàn)田取3個(gè)平行樣，分別編號(hào)。部分土壤風(fēng)干過篩用于土壤理化性狀及酶活的測(cè)定，部分裝離心管-20 ℃冷凍保存，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S多樣性基因測(cè)序和分析。土樣基本理化性狀如表1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定方法 按照土壤理化分析方法檢測(cè)pH值、含水率、有機(jī)質(zhì)、全氮和土壤養(yǎng)分[7]。

1.2.2 土壤微生物DNA提取及基因測(cè)序 根據(jù)陳乾錦等[8]研究的DNA提取和測(cè)序方法進(jìn)行16S土壤細(xì)菌基因測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22軟件進(jìn)行方差分析?；驕y(cè)序結(jié)果利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(tái)軟件進(jìn)行分析。

表1 煙田理化性質(zhì)

表2 各樣本OTU聚類和物種分類譜系

*為0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤細(xì)菌多樣性

如表2所示，移栽前健康土壤樣本(Y2_1)種類比易感病土壤低，說明種植大蒜增加了土壤細(xì)菌豐富度。種植煙草以后細(xì)菌種類都降低，2個(gè)試驗(yàn)田基本一樣，到成熟期有所提高，易感病土壤樣本(C2_2)低于移栽前水平，健康土壤樣本(C2_1)在屬水平以后比移栽前顯著升高，之前水平都比移栽前低，易感病煙田略高于健康土壤?？梢钥闯?，種植大蒜后煙田土壤細(xì)菌群落的自我調(diào)控能力大大提高，雖然沒有調(diào)整到移栽前水平，但比成熟期健康土壤稍高。

各樣本的Alpha多樣性差異檢驗(yàn)如圖1所示。從sobs指數(shù)可以看出，健康土壤在3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期之間存在顯著差異性，易感病土壤在3個(gè)時(shí)期之間有極顯著差異，同時(shí)期在健康和易感病煙田只有移栽前樣本之間有顯著性差異。Shannon指數(shù)評(píng)價(jià)物種群落組成的均勻度，表示群落多樣性，從香農(nóng)指數(shù)差異分析可以看出，移栽前和旺長(zhǎng)期之間有顯著差異，易感病煙田的移栽前和成熟期之間有極顯著差異，健康煙田有顯著差異。Sobs指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)顯示，在同一時(shí)期健康和易感病之間沒有顯著性差異，說明煙草生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)于煙田土壤細(xì)菌總數(shù)和多樣性影響較大，健康與易感病土壤之間有差異但不顯著。Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)反應(yīng)群落物種豐富度，只是計(jì)算方法不同，所以差異性也基本相同，健康煙田旺長(zhǎng)期和成熟期之間有極顯著差異，易感病煙田3個(gè)時(shí)期之間有極顯著差異，健康與易感病煙田之間，在移栽前有顯著差異，成熟期有極顯著差異。

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

如圖2(見封三)所示，8個(gè)樣本細(xì)菌共檢測(cè)到35門、88綱、192目、389科、837屬、1848種。在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、Saccharibacteria、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)10個(gè)菌門的相對(duì)豐度超過1 %，占總菌數(shù)的97 %以上。相對(duì)豐度含量高于5 %的優(yōu)勢(shì)菌門有變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門和酸桿菌門5種，總含量在83.31 %～88.98 %，在健康煙田稍高于易感病煙田。變形菌門和擬桿菌門在種上煙后增加，健康土壤增加的多，放線菌門則減少，健康土壤減少的少。整個(gè)生理期健康土壤的厚壁菌門和芽單胞菌門均比易感病土壤少，種上煙后，健康土壤先減少后增加，易感病煙田一直增加，特別是厚壁菌門增加顯著，Saccharibacteria種上煙草后顯著增加，同一時(shí)期健康土壤相對(duì)含量低于易感病煙田。

在綱水平上，相對(duì)含量大于1 % 的有21種，占總菌數(shù)的94 % 以上，其中健康煙田相對(duì)豐度高于易感病煙田的優(yōu)勢(shì)菌綱有：Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gemmatimonadetes，健康煙田顯著低于易感病煙田土壤的有：Acidobacteria、Ktedonobacteria。在目水平上有43種菌相對(duì)含量高于1 %，占總菌數(shù)的88 %以上，含量在前5的菌有Rhizobiales、Sphingomonadales、Micrococcales、Frankiales和Bacillales，其中種上煙后顯著增加且易感病煙田相對(duì)含量比健康煙田高的有Sphingomonadales和Bacillales，分別屬于變形菌門和厚壁菌門。在科水平上有53種菌含量大于1 %，占總菌數(shù)的75 %以上，前5種菌為Sphingomonadaceae、norank_o_Gaiellales、norank_p_Saccharibacteria、Xanthomonadaceae、和Acidobacteriaceae_Subgroup_1，種上煙后顯著增加且高于健康煙田的有Sphingomonadaceae和norank_p_Saccharibacteria。有顯著差異，易感病煙田相對(duì)含量高。Acidothemus、Bacillus、norank_o_Saccharibacteria、Candidatus_Solibacter、norank_o_SC-I-84和norank_f_HSB_OF53-F07在屬水平上，有54種細(xì)菌相對(duì)豐度大于1 %，占總菌數(shù)的60 %以上，前5種菌屬有Sphingomonas、norank_o_Gaiellales、norank_p_Saccharibacteria、Bacillus、norank_o_C0119，分別屬于變形菌門、放線菌門、Saccharibacteria、厚壁菌門和綠彎菌門。其中Sphingomonas(鞘脂單胞菌屬)、norank_p_Saccharibacteria和norank_o_C0119在種上煙后顯著增加，且在易感病煙田高于健康煙田土壤，Bacillus(芽孢桿菌屬)種上煙后稍有增加，整個(gè)生理期都是易感病煙田高，相對(duì)豐度較小的有益菌Bradyrhizobium(慢生根瘤菌屬)和Streptomyces(鏈霉菌屬)則在健康土壤高于易感病土壤。

圖3 土壤樣本非度量多維尺度分析Fig.3 Non-metric multidimensional scaling of soil samples

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Beta多樣性分析和差異分析

如圖3所示，Stress值顯示結(jié)果具有代表性，健康煙田和易感病煙田樣本之間具有差異性，種上煙以后，旺長(zhǎng)期和成熟期的樣本分別聚在一起。移栽前的2個(gè)煙田分別在2個(gè)區(qū)間，相距較遠(yuǎn)，種上煙以后的區(qū)系結(jié)構(gòu)也有較大的差距，到成熟期相距較近。

移栽前，Nitrospirae(硝化螺旋菌門)有極顯著差異(圖4-A)，易感病煙田土壤相對(duì)含量高，但硝化螺旋菌門的相對(duì)含量低于1 %，Saccharibacteria有極顯著差異，健康煙田土壤比易感病煙田高48.6 %，Gemmatimonadetes、Bacteroidetes和Latescibacteria具具有極顯著差異，Rhodanobacter和norank_f_Acidobacteriaceae_Subgroup_1_具有顯著差異，Rhodanobacter、Bacillus和norank_o_SC-I-84在易感病煙田高于健康煙田土壤，其它菌屬則是健康煙田土壤高。說明種植大蒜的易感病煙田土壤有益菌增長(zhǎng)，且與健康煙田土壤差異顯著。

旺長(zhǎng)期，Armatimonadetes具有極顯著差異，Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes和Firmicutes具有顯著差異(圖4-B)，norank_o_JG30-KF-AS9和Gemmatimonas具有顯著差異，這些菌都是易感病煙田土壤高。

在成熟期，Nitrospirae具有極顯著差異，易感病煙田土壤相對(duì)含量高，Proteobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia具有顯著差異，后2種菌門在易感病煙田土壤相對(duì)含量高，變形菌門在健康煙田土壤高。在屬水平上，Terrabacter具有極顯著差異，在健康煙田相對(duì)含量高，Bacillus、norank_o_Gaiellales、norank_o_C0119和Bradyrhizobium具有顯著差異，前3種菌屬在易感病煙田土壤相對(duì)含量高，慢生根瘤菌屬在健康煙田高。菌屬差異分析顯示種植大蒜后的易感病煙田土壤提高了調(diào)節(jié)和維持有益細(xì)菌豐度的能力。

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)土壤理化性質(zhì)和酶活的相關(guān)性

由圖5所示，環(huán)境因子對(duì)主要門分類水平細(xì)菌群落的冗余分析，第一主軸解釋了細(xì)菌門群落60.47 %的方差變化，第一和二主軸共解釋了82.97 %的方差變化。蔗糖酶INV(P=0.003)、有機(jī)質(zhì)OM(P=0.001)和堿解氮AN(P=0.001)是對(duì)門水平細(xì)菌群落具有極顯著正相關(guān)的環(huán)境因子，蛋白酶PR(P=0.012)、總氮TN(P=0.046)和速效磷AP(P=0.022)則是具有顯著負(fù)相關(guān)的環(huán)境因子。其它環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也有影響但未達(dá)到顯著水平，大部分細(xì)菌與脲酶URE、pH正相關(guān)，與酸性磷酸酶ACP、速效鉀AK、總磷TP呈負(fù)相關(guān)。

圖4 煙草不同時(shí)期煙田土壤細(xì)菌在門水平和屬水平上的差異分析Fig.4 Difference analysis of bacteria at phylum and genus level in soil of tobacco field

相對(duì)含量超過1 % 前10種細(xì)菌門與土壤酶活和理化性質(zhì)的spearman相關(guān)性分析具體如表3所示，酶活與細(xì)菌的相關(guān)性，ACP與這10種細(xì)菌門都沒有相關(guān)性，蛋白酶和蔗糖酶對(duì)細(xì)菌豐度的影響較大。PR與Saccharibacteria極顯著正相關(guān)，其余是顯著負(fù)相關(guān)，INV對(duì)變形菌門和Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與綠彎菌門極顯著正相關(guān)，與放線菌門和酸桿菌門顯著正相關(guān)，而URE對(duì)變形菌門和厚壁菌門顯著正相關(guān)，與綠彎菌門顯著負(fù)相關(guān)。理化性質(zhì)與細(xì)菌的相關(guān)性，pH與前10種細(xì)菌門沒有相關(guān)性，OM、TN、AN和AP對(duì)細(xì)菌豐度的影響較大。OM與Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與變形菌門顯著負(fù)相關(guān)，與芽單胞菌門和放線菌門極顯著正相關(guān)，總氮與Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與芽單胞菌門極顯著正相關(guān)，與浮霉菌門顯著正相關(guān)，AN與變形菌門和Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與放線菌門和芽單胞菌門極顯著正相關(guān)，速效磷與Saccharibacteria極顯著負(fù)相關(guān)，與芽單胞菌門極顯著正相關(guān)，與浮霉菌門和疣微菌門顯著正相關(guān)。AK和TP只與厚壁菌門極顯著正相關(guān)。放線菌門與主要相關(guān)的理化性質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，變形菌門與INV和理化性質(zhì)極顯著負(fù)相關(guān)，厚壁菌門只與速效鉀和總磷極顯著正相關(guān)，厚壁菌門在易感病煙田一直高于健康煙田土壤，特別是種上煙后，增加顯著，這與養(yǎng)分的變化一致(表4)，而Saccharibacteria與INV和理化性質(zhì)極顯著負(fù)相關(guān)，芽單胞菌門與主要理化性質(zhì)極顯著正相關(guān)，與PR極顯著負(fù)相關(guān)。

PR：蛋白酶，INV：轉(zhuǎn)化酶，URE：脲酶，ACP：酸性磷酸酶，OM：有機(jī)質(zhì)，TN：總氮，AN：堿解氮，AP：有效磷，AK：速效鉀，TP：總磷圖5 細(xì)菌門分類水平與環(huán)境因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis(RDA)of bacteria at phylum level and environmental factors

3 討論與結(jié)論

作物土傳病害病原菌是土壤微生物群落的組成部分，健康土壤微生物群落一方面可抑制植物病原菌過度地繁殖，另一方面可酶解產(chǎn)生誘導(dǎo)物質(zhì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生并積累大量次生抗病物質(zhì)，提高作物的抗病性[9]。不健康土壤微生物群落失衡，某些種類微生物大量繁殖，使微生物多樣性降低。土壤微生物多樣性對(duì)維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的平衡具有重要作用，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，成本降低、準(zhǔn)確性高、靈敏度高，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的土壤微生物基因的直接測(cè)序，有助于研究土壤微生物的豐富度和多樣性，為有效防控土傳病害提供數(shù)據(jù)支撐[10]。

表3 細(xì)菌門水平上的群落結(jié)構(gòu)與土壤酶活和理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

表4 移栽前和旺長(zhǎng)期土壤養(yǎng)分變化

本研究發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌的微生物總數(shù)和多樣性在煙草不同生長(zhǎng)時(shí)期有顯著差異，在移栽前和成熟期，健康煙田和易感病煙田之間的多樣性達(dá)到顯著差異。前茬作物對(duì)土壤細(xì)菌的總數(shù)和多樣性影響較大，種植大蒜的易感病煙田土壤高于健康煙田，與張笑宇等[11]的研究結(jié)果一致。旺長(zhǎng)期土壤總數(shù)和多樣性就大幅度下降，且多樣性低于健康煙田，到成熟期又升高，土壤細(xì)菌總數(shù)和多樣性都高于健康煙田，說明易感病煙田種植大蒜后再種煙，對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量和多樣性的調(diào)節(jié)能力提高，已趨于健康煙田土壤。在門水平上，優(yōu)勢(shì)菌門變形菌門、擬桿菌門和放線菌門在健康土壤含量高于易感病土壤，厚壁菌門和芽單胞菌門則低于易感病煙田土壤，厚壁菌門與健康煙田差異顯著。在屬水平上，非優(yōu)勢(shì)菌屬的鏈霉菌屬在健康煙田比易感病煙田高約2倍，具有清理土壤有毒物質(zhì)的鞘脂單胞菌屬[12]則是易感病煙田比健康煙田高約1倍。而優(yōu)勢(shì)菌屬中的鞘脂單胞菌屬和芽孢桿菌屬則一直是易感病煙田土壤高，芽孢桿菌屬的差異達(dá)到顯著水平。

有研究表明，土壤的抗病能力與根際土壤中變形菌門和放線菌門相對(duì)豐度呈正相關(guān)[13]，這可能是由于其中部分微生物具有較強(qiáng)的抗病能力。變形菌門細(xì)菌為嗜營(yíng)養(yǎng)菌菌，能以很多有機(jī)物和植物殘?bào)w為碳源和氮源，所以施用有機(jī)肥可以刺激變形菌門的生長(zhǎng)，從而提高作物抗病性[14]。放線菌門可產(chǎn)生多種抗生素和胞外酶，對(duì)植物病害具有防御作用[15]。地桿菌屬為放線菌門，是根際土壤的氫氧化細(xì)菌，作為植物的根際促生菌的一種，對(duì)農(nóng)作物具有增產(chǎn)的作用[16]。慢生根瘤菌屬是變形菌門的一種根瘤菌，具有固氮作用，可自生固氮，也可與豆科植物共生固氮，但只在植物營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)才能進(jìn)行固氮作用[17]。芽孢桿菌屬為厚壁菌門，其中有很多益生菌種，對(duì)土壤病原真菌具有強(qiáng)烈的抗性[18]，在防治作物病蟲害和修復(fù)土壤重金屬污染方面有諸多研究，近幾年研究發(fā)現(xiàn)其還能有效控制根結(jié)線蟲[19]。本研究中，移栽前和種上煙后土壤細(xì)菌群落之間差異顯著，健康煙田和易感病煙田土壤之間差異也顯著。移栽前由于前茬作物不同，優(yōu)勢(shì)菌門中的芽單胞菌門和擬桿菌門有顯著差異，易感病煙分別比健康煙田高23.6 %和67.5 %，芽孢桿菌屬有極顯(P≤0.001)著差異，在易感病煙田比健康煙田高1倍多，說明種植大蒜有益細(xì)菌門增加，有利于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)整。種上煙草后雖然優(yōu)勢(shì)菌門種類不變，但是有差異的菌種與移栽前不同，旺長(zhǎng)期厚壁菌門、芽單胞菌門和芽單胞菌屬具有顯著差異，易感病煙田均比健康煙田高約1倍，成熟期則是變形菌門、厚壁菌門、慢生根瘤菌屬和芽孢桿菌屬有顯著差異，地桿菌屬有極顯著差異，變形菌門、慢生根瘤菌屬和地桿菌屬在健康煙田比易感病煙田高9.5 %、64.2 %和92.8 %，厚壁菌門和芽孢桿菌屬在易感病煙田高62.2 %和57.9 %。說明易感病煙田種植大蒜后對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌調(diào)節(jié)作用維持時(shí)間較長(zhǎng)，促進(jìn)煙草根際環(huán)境中有益細(xì)菌的生長(zhǎng)，最終使得這一年的發(fā)病率大大降低(僅為6.5 %)。

土壤微生物中有優(yōu)勢(shì)菌門與環(huán)境因子的分析表明，蔗糖酶、有機(jī)質(zhì)和堿解氮是影響細(xì)菌群落變化的主要因子，而蔗糖酶活性與有機(jī)質(zhì)具有正相關(guān)性，這與張凱煜[4]等的研究一致，大量的研究結(jié)果證實(shí)土壤氮含量和有機(jī)質(zhì)含量顯著影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，施用有機(jī)肥可以顯著提高土壤細(xì)菌的數(shù)量和多樣性。本研究表明通過大蒜輪作也可以提高有益細(xì)菌的含量和多樣性，易感病煙田的厚壁菌門和芽單胞菌門數(shù)量顯著增加，比健康煙田還高，且厚壁菌門和芽孢桿菌屬與健康煙田土壤含量的差異達(dá)到顯著水平。但是細(xì)菌群落改善對(duì)抗病的機(jī)理研究，還需要進(jìn)一步比較分析煙草根際微生物種群的代謝變化才能真正揭示。