新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳分化與變異特征

于少帥 趙文霞 姚艷霞 張學(xué)超 淮穩(wěn)霞

摘要：利用15對特異性SSR引物對290份新疆野蘋果和栽培蘋果樣品進行擴增，并通過分子生物學(xué)方法分析其遺傳變異特征與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。15對SSR引物在290份新疆野蘋果和栽培蘋果樣品中共獲得69個等位基因，平均每個SSR位點獲得4.6個等位基因。新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關(guān)系較近，新疆野蘋果種群遺傳多樣性豐富，遺傳分化系數(shù)為0.25，基因流為0.76。新疆新源和鞏留2個地區(qū)的新疆野蘋果聚于一個進化分枝，栽培蘋果與采自新疆的紅肉蘋果聚于一個進化分枝。編碼轉(zhuǎn)錄因子RAX3的SSR位點在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶;編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端的SSR位點在新疆野蘋果中有特異性條帶;編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端、轉(zhuǎn)錄因子bHLH74的SSR位點在栽培蘋果中有特異性條帶。

關(guān)鍵詞：新疆野蘋果;微衛(wèi)星標(biāo)記;遺傳多樣性;系統(tǒng)發(fā)育;抗逆性

中圖分類號：S661.1文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1274-08

Abstract： 15 pairs of specific simple sequence repeats（SSR） primers were used to amplify 290 samples of Malus sieversii and cultivated apples， and their genetic variation and phylogenetic relationships were analyzed by molecular biology method. 69 alleles were obtained in 290 samples of M. sieversii and cultivated apples based on 15 pairs of SSR primers， with an average of 4.6 alleles per SSR locus. There was a close genetic relationship between M. sieversii and cultivated apples. The genetic diversity of M. sieversii groups was rich， with a genetic differentiation coefficient of 0.25 and a gene flow of 0.76. M. sieversii from Xinyuan and Gongliu of Xinjiang clustered in an evolutionary branch， cultivated apples and the red-flesh apple collected from Xinjiang clustered in an evolutionary branch. The SSR locus that coding transcription factor RAX3 showed a specific band in M. sieversii samples whose deadwood rate was above 90%. The SSR locus that coding the N end of the TMV-like resistant protein showed a specific band in M. sieversii samples. The SSR loci that coding the N end of the TMV-like resistant protein and the transcription factor bHLH74 showed specific bands in cultivated apples.

Key words：Malus sieversii;microsatellite marker;genetic diversity;phylogeny;stress resistance

新疆野蘋果（Malus sieversii）是薔薇科蘋果屬的瀕危二級重點保護植物，是研究世界蘋果遺傳多樣性和基因進化的重要天然基因庫，主要分布于中國新疆西部、中亞的哈薩克斯坦和吉爾吉斯斯坦[1]。新疆野蘋果由于受自然選擇的長期作用，形成了豐富的遺傳特征和較強的環(huán)境適應(yīng)性，具有抗病、抗蟲等優(yōu)良性狀[2]。近年來，分布于中國的新疆野蘋果枯死嚴重。影響新疆野蘋果生存狀態(tài)的原因較多，比如人類活動、蘋小吉丁蟲害和蘋果樹腐爛病等因素[3-5]。但關(guān)于引起新疆野蘋果枯死的具體原因及枯死機制尚不清楚。因新疆野蘋果脅迫因子的多樣性和復(fù)雜性，在新疆野蘋果保育過程中采取單一的防治手段較難起到理想的保護效果。在尋找引起新疆野蘋果種群退化的關(guān)鍵因子和保護新疆野蘋果的同時，保護、選育和栽培具有抗性特征的遺傳資源應(yīng)該是控制其種群衰退最為經(jīng)濟有效和根本的措施。

關(guān)于新疆野蘋果種質(zhì)遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育的研究結(jié)果表明，新疆鞏留縣、新源縣等地的新疆野蘋果種群存在豐富的遺傳多樣性[6-7]，種群內(nèi)部遺傳分化程度較高[8]。在新疆野蘋果遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中常用的分子標(biāo)記有SSR[9]、SRAP[7]、RAPD[10]、ITS[11]，其中應(yīng)用較多的分子標(biāo)記為SSR標(biāo)記[2]。作為一種分辨率高、遺傳信息量大、操作相對簡單的標(biāo)記方法，SSR被廣泛應(yīng)用于瀕危植物遺傳變異研究中[12-14]。SSR標(biāo)記可以與植物的一些表型、抗性等性狀關(guān)聯(lián)在一起。Klabunde等[15]用11對SSR引物對152份具有不同蘋果葉斑病抗性的巴西栽培蘋果的遺傳多樣性進行評估發(fā)現(xiàn)：不同抗性栽培蘋果間存在豐富的遺傳多樣性，蘋果抗葉斑病品種與感葉斑病品種間遺傳結(jié)構(gòu)差異顯著，有120個等位位點是抗病品種獨有的。新疆野蘋果研究結(jié)果顯示，SSR標(biāo)記可以很好地揭示新疆野蘋果種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[6]，新疆野蘋果種內(nèi)不同個體的葉形等表型性狀的變異與SSR標(biāo)記的位點有一定的相關(guān)性[2，16]。目前關(guān)于新疆野蘋果抗病蟲等抗性差異在新疆野蘋果個體、種群間的遺傳變異尚未見報道。

新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳關(guān)系較近，可能是現(xiàn)代栽培蘋果的祖先[1]。目前關(guān)于新疆野蘋果種質(zhì)遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育研究應(yīng)用較多的分子標(biāo)記是SSR標(biāo)記[6，9，16]，但現(xiàn)在大部分標(biāo)記均為非編碼區(qū)分子標(biāo)記，擴增片段的功能未知，在NCBI上無明確比對結(jié)果?；谠耘嗵O果基因組，篩選了15對可以在栽培蘋果、新疆野蘋果中擴增出目的條帶的的特異性SSR引物，通過這些特異性引物對不同種群新疆野蘋果和栽培蘋果進行遺傳變異分析，旨在揭示新疆野蘋果的遺傳信息及變異規(guī)律。本研究用新開發(fā)的15對特異性SSR引物，對新疆野蘋果和栽培蘋果290份樣品進行遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析，揭示其遺傳變異規(guī)律和親緣關(guān)系，為新疆野蘋果的生態(tài)保育，蘋果優(yōu)質(zhì)新品種培育和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展等提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗樣品

2016年至2017年對新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州鞏留縣和新源縣的新疆野蘋果健康狀況進行調(diào)查并采樣。根據(jù)新疆野蘋果樹上的枯枝率將新疆野蘋果按級別進行劃分[17]，共分6個級別，0級：單株枯枝率為0;Ⅰ級：單株枯枝率為0～10%;Ⅱ級：單株枯枝率為11%～40%;Ⅲ級：：單株枯枝率為41%～60%;Ⅳ級：單株的枯枝率為61%～90%;Ⅴ級：單株枯枝率為91%～100%。新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所基于前期調(diào)查研究篩選了一些疑似抗逆資源，本研究樣品于2017年9月采自新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所資源圃。栽培蘋果樣品于2017年7月至8月采自山東，樣品信息如表1所示。

1.2儀器和試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、SYBR Green I染料購自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司，2×Taq Mix購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，Hi-Di去離子甲酰胺、POP-7 Polymer、GS-500LIZ相對分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)購自美國ABI公司，A200型基因擴增儀購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司， DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠，超純水由 MILLI-Q 超純水純化系統(tǒng)制得，乙醇等其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3DNA提取

取樣品葉片0.1 g，采用CTAB法提取新疆野蘋果和栽培蘋果的基因組總DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR擴增

根據(jù)已報道的栽培蘋果品種金冠蘋果基因組[18]，獲得15對新疆野蘋果特異性SSR引物，如表2所示。DNA測序PCR反應(yīng)體系25.0 μl：1.0 μl DNA模板，0.5 μl 上游/下游引物 （10 μmol/L）， 12.5 μl 2×PCR Master Mix （包括 0.05 U/μl Taq DNA polymerase， 4.0 mmol/L MgCl2， 0.4 mmol/L dNTPs），最后用ddH2O補齊。PCR擴增條件是95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s， 52 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用SYBR Green I熒光染料染色在1% （質(zhì)量體積比）的瓊脂糖凝膠電泳中檢測。毛細管電泳PCR反應(yīng)體系是30 μl，包括1 μl DNA模板、1 μl上游/下游引物（10 μmol/L，加熒光），15 μl 2×PCR Master Mix （包括 0.05 U/μl Taq DNA polymerase、4.0 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs），用ddH2O補齊。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。PCR擴增結(jié)束后，取0.3 μl PCR產(chǎn)物用ABI 3730×l DNA analyzer進行毛細管電泳分析。

1.5數(shù)據(jù)處理

將上機結(jié)果原始文件導(dǎo)入Genemarker 2.2.0，按位點導(dǎo)出峰圖、Excel位點信息表。利用GeneMarker V2.2.0和POPGENE V1.32計算引物擴增的等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息量;使用GenAlEx V6.501軟件計算各引物擴增的等位基因的PIC值;利用NTSYSpc V2.10e和MEGA V7.0軟件計算品種間的遺傳距離，用UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀圖;根據(jù)遺傳多樣性系數(shù)（Na）、Neis基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（I）、期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）進行遺傳多樣性分析。

2結(jié)果與分析

2.1遺傳多樣性參數(shù)和遺傳分化

用15對特異性SSR引物擴增290份不同地區(qū)、不同枯枝癥狀級別的新疆野蘋果和栽培蘋果樣品，對其遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行分析，共擴增出69個等位基因，平均每個位點擴增出4.6個等位基因，如表3所示。本研究結(jié)果表明，不同類群的等位基因數(shù)為1.40～3.67，有效等位基因數(shù)為0.98～2.28，Neis基因多樣性指數(shù)為0.20～0.46，香農(nóng)指數(shù)為0.28～0.83，觀察雜合度為0.33～0.73，期望雜合度為0.25～0.76。根據(jù)這些遺傳多樣性參數(shù)評估可知，檢測的新疆野蘋果和栽培蘋果樣品遺傳多樣性較為豐富。遺傳分化系數(shù)（Fst）為0～0.05時，一般認為遺傳分化低;Fst值為0.05～0.25時，一般認為中等程度遺傳分化;Fst值>0.25時，一般認為顯著遺傳分化[19]。新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群290份樣品的Fst為0.25，基因流（Nm）為0.76，由遺傳分化系數(shù)和基因流可知，不同類群間具有一定程度的分化，在總的遺傳變異中，種群間變異為24.86%。

2.2新疆野蘋果和栽培蘋果SSR位點特異性分析

15對特異性SSR引物在290份樣品中共擴出69個等位基因，平均每個位點擴增出4.6個等位基因。每個位點擴增的片段長度及等位基因數(shù)如表4所示。SSR引物XS71-1-4和XS72-1-1在290份樣品中擴增的等位基因數(shù)最多，為10個;引物XS62-1-4擴增的等位基因數(shù)最少，為2個。特異性SSR位點分析結(jié)果表明，XS24-1-5-2（轉(zhuǎn)錄因子RAX3）位點獲得的等位基因是GL（V）、GL1、XY（V）特有的，由此可知編碼轉(zhuǎn)錄因子RAX3的SSR位點在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶。XS2-1-2（組氨酸激酶5）位點246等位基因是YN-red特有的。XS71-1-4（類TMV抗性蛋白質(zhì)N端）位點440等位基因是GL（0）、GL1、GL2、XY-84特有的。XS71-1-5（類TMV抗性蛋白質(zhì)N端）位點367等位基因是YN-red特有的。XS71-1-5（類TMV抗性蛋白質(zhì)N端）位點422等位基因是GL1、GL2、GL3特有的，由此可知編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端的SSR位點在新疆野蘋果中有特異性條帶。XS63-1-10引物（擴增的基因序列編碼的蛋白質(zhì)為類TMV抗性蛋白質(zhì)N端）獲得的等位基因是山東煙臺栽培蘋果特有的[18]，XS25-1-8引物（轉(zhuǎn)錄因子bHLH74亞型X1）獲得的等位基因是LS、LY特有的，由此可知編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端、轉(zhuǎn)錄因子bHLH74的SSR位點在栽培蘋果中有特異性條帶。

每個位點平均等位基因數(shù)，也稱為等位基因多樣性（通常用A表示）。GL（0）、GL（I）、GL（II）、GL（III）、GL（IV）、GL（V）、GL1、GL2、GL3、LS、LY、XY（I）、XY（II）、XY（III）、XY（IV）、XY（V）、XY-75、XY-76、XY-84、XY-89、XY-90、XY-91、YN-red見表1。

2.3新疆野蘋果和栽培蘋果不同種群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

由Neis無偏差異遺傳特征和遺傳距離可知，新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關(guān)系較近，新疆野蘋果內(nèi)部具有較高相似性，栽培蘋果內(nèi)部也具有較高相似性?；贜eis無偏差異遺傳距離構(gòu)建的UPGMA進化樹可以將新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群或不同個體清晰、準確地分開，形成不同的進化分枝。由新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群的UPGMA進化樹可知，栽培蘋果LY和LS類群與采自新疆伊犁農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所資源圃的紅肉蘋果聚于一類，采自鞏留、新源不同樣點、不同枯枝癥狀級別的新疆野蘋果樣品聚于不同的分枝，但與采樣地點、癥狀級別等無明顯關(guān)系。鞏留、新源不同樣點、不同枯枝癥狀級別的新疆野蘋果樣品難以區(qū)分。由此可知，鞏留、新源兩地新疆野蘋果的親緣關(guān)系較近?；谛陆疤O果和栽培蘋果不同個體的Neis無偏差異遺傳距離構(gòu)建的UPGMA進化樹和遺傳距離結(jié)果表明，新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳關(guān)系較近，但兩者可以準確分開，新疆野蘋果聚于一個大的進化分枝，栽培蘋果聚于另一個大的進化分枝，如圖1所示。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關(guān)系較近，新疆野蘋果種群遺傳多樣性豐富，不同類群間存在較高程度的分化水平，遺傳分化系數(shù)為0.25，基因流為0.76。研究結(jié)果與已有研究結(jié)果[20-21]基本一致。而揭示種群間遺傳分化水平的遺傳分化系數(shù)與所采用的分子標(biāo)記和種群自身的遺傳變化有一定的關(guān)系[6，22]。新疆野蘋果和栽培蘋果不同種群間基因流相對較低，分化水平較為顯著。新疆新源和鞏留2個地區(qū)的新疆野蘋果聚于一個進化分枝，栽培蘋果與采自新疆的紅肉蘋果聚于一個進化分枝。關(guān)于新疆野蘋果遺傳多樣性的研究相對較多，但SSR標(biāo)記大部分為非編碼區(qū)且功能未知，對于差異標(biāo)記的功能作用等認知不足[6，21]。

通過特異性SSR引物，不僅可以揭示新疆野蘋果和栽培蘋果的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，而且對變異位點的抗逆特性也會有一定的了解。在不同SSR位點擴增的等位基因數(shù)有所不同，同一SSR位點不同等位基因在不同新疆野蘋果或栽培蘋果類群中出現(xiàn)的頻率也有所不同，如編碼轉(zhuǎn)錄因子RAX3的SSR位點在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶;編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端的SSR位點在新疆野蘋果中有特異性條帶;編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端、轉(zhuǎn)錄因子bHLH74的SSR位點在栽培蘋果中有特異性條帶。SSR引物XS71-1-4和XS72-1-1在290份樣品中擴增的等位基因數(shù)最多，為10;SSR引物XS62-1-4擴增的等位基因數(shù)最少，為2。不同新疆野蘋果或栽培蘋果種群具有不同的特異性SSR變異位點。這一現(xiàn)象可能與新疆野蘋果或栽培蘋果進化過程中對生境的適應(yīng)性有一定的關(guān)系[1]。15對SSR特異性引物可以對新疆野蘋果和栽培蘋果進行遺傳多樣性、多態(tài)性或系統(tǒng)發(fā)育分析，揭示新疆野蘋果和栽培蘋果的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及獲得的遺傳變異對新疆野蘋果和栽培蘋果在生物學(xué)功能等方面的影響。通過這些新開發(fā)的SSR引物，可以很好地揭示新疆野蘋果和栽培蘋果之間的遺傳變異規(guī)律和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，這些研究結(jié)果將為新疆野蘋果生態(tài)恢復(fù)、優(yōu)質(zhì)種源選育和優(yōu)良栽培品種的創(chuàng)制提供一定的參考。新疆野蘋果在長期的進化過程中形成了許多抗寒、抗病蟲害等的優(yōu)良性狀[23-24]。新疆野蘋果種內(nèi)變異類型豐富，但缺乏系統(tǒng)遺傳多樣性的系統(tǒng)調(diào)查與評估，抗逆特性突出但基因資源深入挖掘與開發(fā)利用研究環(huán)節(jié)相對較為薄弱。目前新疆野蘋果無全基因組序列，對國內(nèi)外新疆野蘋果起源、分化、擴散情況，以及新疆野蘋果抗病蟲害、抗寒和風(fēng)味形成的遺傳構(gòu)成、基因調(diào)控機制等研究有一定的影響，從而限制新疆野蘋果抗逆相關(guān)基因克隆和新型抗逆新疆野蘋果種質(zhì)資源的創(chuàng)制[2]。全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)用于新疆野蘋果抗病蟲害基因的篩選，在全基因組范圍內(nèi)找出存在的變異序列（SNP），以差異強表達候選基因為目標(biāo)來開發(fā)多態(tài)性SNPs。該技術(shù)一次可定位多個性狀，而且定位精度高，可直接獲得與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因。因此，后續(xù)研究中有待于通過全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)等對新疆野蘋果抗病蟲害（抗蘋果樹腐爛病和蘋小吉丁蟲）、抗寒以及風(fēng)味形成的相關(guān)遺傳基因進行挖掘，分析其遺傳構(gòu)成和基因調(diào)控機制。通過全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、全基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)，充分挖掘和利用新疆野蘋果基因資源，通過雜交育種與配套撫育等方法，創(chuàng)制營養(yǎng)價值高、經(jīng)濟價值高的“功能性”新型蘋果品種，通過“利用保存”這一方式更好地保存新疆野蘋果遺傳資源，并基于優(yōu)質(zhì)的新疆野蘋果種質(zhì)資源，解決中國栽培蘋果的遺傳背景狹窄、種質(zhì)退化等相關(guān)問題，促進中國蘋果產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻：

[1]束懷瑞. 蘋果學(xué)[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1999.

[2]張艷敏，馮濤，張春雨，等. 新疆野蘋果研究進展[J]. 園藝學(xué)報， 2009， 36（3）： 447-452.

[3]劉華，臧潤國，丁易，等. 天山西部新疆野蘋果種群特征[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2010， 46（11）： 1-7.

[4]王春曉，趙褔，趙健桐，等. 新疆發(fā)生蘋果小吉丁蟲[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1995（5）： 225-226.

[5]劉愛華，張新平，溫俊寶，等. 天山野蘋果林蘋果小吉丁與蘋果樹腐爛病復(fù)合危害研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 51（12）： 2240-2244.

[6]ZHANG C， CHEN X， HE T， et al. Genetic structure of Malus sieversii population from Xinjiang， China， revealed by SSR markers[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2007， 34（10）： 947-955.

[7]張春雨，陳學(xué)森，林群，等. 新疆野蘋果群體遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 園藝學(xué)報， 2009， 36（1）： 7-14.

[8]DONG Y， ZHANG J， REN Y C， et al. Stduy on genetic diversity of natural population in Malus sieversii with microsatellite[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2013， 14（5）： 771-777.

[9]OMASHEVA M， CHEKALIN S， GALIAKPAROV N. Evaluation of molecular genetic diversity of wild apple Malus sieversii populations from Zailiysky Alatau by microsatellite markers[J]. Russian Journal of Genetics， 2015， 51（7）： 647-652.

[10]ZHOU Z Q， LI Y N. The RAPD evidence for the phylogenetic relationship of the closely related species of cultivated apple[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2000， 47（4）： 353-357.

[11]趙偑，楊美玲，龍鴻，等. 基于ITS序列的新疆野蘋果系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 生物學(xué)雜志， 2013， 30（5）： 19-22.

[12]CHE Y H， YANG Y P， YANG X M， et al. Phylogenetic relationship and diversity among Agropyron Gaertn germplasm using SSRs markers[J]. Plant Systematics and Evolution， 2015， 301（1）： 163-170.

[13]GHARGHANI A， ZAMANI Z， TALAIE A， et al. Genetic identity and relationships of Iranian apple （Malus×domestica Borkh.） cultivars and landraces， wild Malus species and representative old apple cultivars based on simple sequence repeat （SSR） marker analysis[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2009， 56（6）： 829-842.

[14]SEGARRA-MORAGUES J G， IRIONDO J M， CATALAN P. Genetic fingerprinting of germplasm accessions as an aid for species conservation： a case study with Borderea chouardii （Dioscoreaceae）， one of the most critically endangered Iberian plants[J]. Annals of Botany， 2005， 96 （7）： 1283-1292.

[15]KLABUNDE G H F， JUNKES C F O， TENFEN S Z A， et al. Genetic diversity and apple leaf spot disease resistance characterization assessed by SSR markers[J]. Crop Breeding and Applied Biotechnology， 2016， 16（3）. http：//dx.doi.org/10.1590/1984-70332016v16n3a29.

[16]左力輝，張文林，邱彤，等. 新疆野蘋果葉形性狀變異及其與SSR標(biāo)記關(guān)系分析[J]. 園藝學(xué)報， 2015， 42（4）： 759-768.

[17]阿格里斯（美）. 植物病理學(xué)[M]. 沈崇堯，譯.北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 2009：3.

[18]VELASCO R， ZHARKIKH A， AFFOURTIT J， et al. The genome of the domesticated apple （Malus×domestica Borkh.）[J]. Nature Genetics， 2010， 42（10）： 833-839.

[19]FREELAND J R， KIRK H， PETERSEN S D.分子生態(tài)學(xué)[M]. 戎俊，楊小強，耿宇鵬，等譯.北京： 高等教育出版社， 2015：9.

[20]ZHANG H X， ZHANG M L， WANG L N. Genetic structure and historical demography of Malus sieversii in the Yili valley and the western mountains of the Junggar Basin， Xinjiang， China[J]. Journal of Arid Land， 2015， 7（2）： 264-271.

[21]RICHARDS C M， VOLK G M， REILLEY A A， et al. Genetic diversity and population structure in Malus sieversii， a wild progenitor species of domesticated apple[J]. Tree Genetics and Genomes， 2009， 5（2）： 339-347.

[22]MAGUIR T I， PEAKALL R， SAENGER P， et al. Comparative analysis of genetic diversity in the mangrove species Avicennia marina （Forsk.） Vierh. （Avicenniaceae） detected by AFLPs and SSRs[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2002， 104： 388-398.

[23]梅闖，閆鵬，韓立群，等. 新疆野蘋果不同類型單株對蘋果小吉丁蟲抗性差異[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 52（10）： 1859-1865.

[24]劉君，刁永強，陳淑英，等. 伊犁河谷不同蘋果品種苗木凍害調(diào)查及分析[J]. 北方園藝， 2013（23）： 34-37.

（責(zé)任編輯：陳海霞）