香蕉基因組學(xué)研究20年：成就與挑戰(zhàn)

金志強(qiáng)

摘? 要：香蕉基因組學(xué)研究已逾20年，取得了一些進(jìn)展。本文從全基因組測(cè)序、亞基因組分化、基因水平上的染色體結(jié)構(gòu)變異、多倍體背景下的染色體交換及基因組擴(kuò)張與功能等5個(gè)方面，論述了香蕉基因組學(xué)研究取得的進(jìn)展，并對(duì)未來基因組學(xué)研究的重點(diǎn)方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：香蕉;基因組學(xué);A基因組;B基因組

中圖分類號(hào)：S668.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Banana genome has been studied for more than 20 years， and some progress has been made. In this paper， the achievements of banana genomics research were reviewed from five aspects： whole genome sequencing， subgenome differentiation， chromosomal structural variation at genome level， chromosome exchange under polyploid background， genome expansion and function.

Keywords： banana （Musa L.）; genomics; A genome; B genome

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.007

基因組學(xué)（genomics）是研究基因組（genome）的科學(xué)。從分子遺傳學(xué)的角度，基因組是指一個(gè)生物體或一個(gè)細(xì)胞器所有DNA分子的總和[1]?；蚪M學(xué)的發(fā)展是以1990年10月1日啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project， HGP）作為起點(diǎn)的，至2000年在全世界科學(xué)家的共同努力下，覆蓋大部分基因組的基因組序列草圖繪制完成[2]。同年，在植物中，擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組測(cè)序結(jié)果[3]即將發(fā)表時(shí)，全球香大蕉改良組織（A Global Programme for Musa Improvement， ProMusa）的部分科學(xué)家，于4月6—8日在法國蒙彼利埃（Montpellier， France）召開學(xué)術(shù)研討會(huì)。與會(huì)者認(rèn)識(shí)到，“植物基因組學(xué)是一個(gè)新興的領(lǐng)域，它有望描述植物的整個(gè)基因庫。從植物基因組學(xué)的研究中獲得的信息將有助于理解基因是如何使植物作為一個(gè)活的有機(jī)體發(fā)揮其功能的，以及所有植物的功能多樣性是如何與單個(gè)基因組的簡(jiǎn)單變化相關(guān)聯(lián)的。植物基因組學(xué)最終可能被用來對(duì)植物進(jìn)行基因改造，使其在不同的生物、生態(tài)和文化環(huán)境中獲得最佳性能，從而造福于人類和環(huán)境”。會(huì)議接近尾聲時(shí)，就香蕉基因組學(xué)研究達(dá)成了相當(dāng)程度的共識(shí)。各方同意成立一個(gè)全球香蕉基因組學(xué)聯(lián)盟（The Global Musa Genomics Consortium，以下簡(jiǎn)稱“聯(lián)盟”），共同開啟香蕉基因組測(cè)序及相關(guān)研究[4]。2001年7月17—20日，“聯(lián)盟”在美國弗吉尼亞州阿靈頓（Arlington， USA）的美國國家科學(xué)基金會(huì)（National Science Foundation， NSF）舉行了第一次會(huì)議。出席會(huì)議的科學(xué)家們對(duì)剛破譯的擬南芥基因組、水稻基因組及其他成就感到歡欣鼓舞，他們迫切希望香蕉能成為下一個(gè)被破譯的植物基因組[5]。出席這次會(huì)議的有來自全球12個(gè)國家的科學(xué)家?；诜▏r(nóng)業(yè)國際合作研究發(fā)展中心（Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement， CIRAD），以及國際熱帶農(nóng)業(yè)研究所（International Institute of Tropical Agriculture， IITA）和國際上其他科學(xué)家的相關(guān)研究基礎(chǔ)，會(huì)議在“聯(lián)盟”的目標(biāo)、策略、預(yù)期成果、測(cè)序的成本測(cè)算、成果分享方式、實(shí)施戰(zhàn)略、資源分享方式、運(yùn)作方式等方面達(dá)成共識(shí)[6]。以“聯(lián)盟”成立為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，香蕉基因組學(xué)研究至今已有20多年。雖然未能如期成為第三個(gè)破譯基因組的植物，但仍然取得一些重要進(jìn)展，綜述如下。

香蕉（包括大蕉）是世界上最重要的水果之一，在全球糧食作物排行榜上排名第四，是最早被馴化的作物之一，現(xiàn)廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)，是數(shù)百萬人的主食，對(duì)熱帶和亞熱帶發(fā)展中國家的糧食和經(jīng)濟(jì)安全具有重大意義[7]。

香蕉為單子葉植物，屬芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa L.）。芭蕉屬植物約有50多個(gè)野生種，分為4個(gè)組（section）。其中，紅蕉組（Callimusa）和澳蕉組（Australimusa）的植物染色體數(shù)目為2n=20（x=10）;真蕉組（Eumusa）和美蕉組（Rhodochlamys）的植物染色體數(shù)目為2n=22（x=11）[8]。大多數(shù)栽培香蕉都來自真蕉組的兩個(gè)野生種，即Musa acuminata（A基因組）和Musa balbisiana（B基因組）。Musa acuminata種內(nèi)雜交和Musa acuminata與Musa balbisiana的種間雜交導(dǎo)致了這些A-和B-基因組的各種組合，這些基因組分為AA、AAA、AB、AAB、ABB和ABBB共6種類型[9]。還有少數(shù)的M. schizocarpa（S基因組，2n=22）（x=11）[10]和Musa textilis（T基因組，2n=20）（x=10）[11]。但絕大多數(shù)食用品種是三倍體，其基因組的組成為AAA、AAB和ABB。

1? 繪制了完整的香蕉野生親本的基因組序列草圖

目前市場(chǎng)上90%以上用于鮮食的和進(jìn)出口的三倍體香蕉品種都屬于三倍體無性系的Cavendish和GrosMichel亞群（subgroup），均起源于Musa acuminata。Cavendish和GrosMichel的出現(xiàn)被認(rèn)為是Musa acuminata產(chǎn)生不減數(shù)配子的部分不育二倍體亞（品）種與產(chǎn)生正常單倍體配子的可育二倍體亞（品）種雜交的結(jié)果[12]。在Musa acuminata中，還發(fā)現(xiàn)了一些亞種，其中，malaccensis亞種被認(rèn)為是為三倍體香蕉（AAA）貢獻(xiàn)了其中的1條A染色體[12]，這個(gè)樣本采自馬來西亞彭亨州（Pahang），故名‘Pahang，于20世紀(jì)40年代后期引入牙買加香蕉理事會(huì)基因庫（Banana Board Jamaica Genebank）[13]。香蕉基因組計(jì)劃啟動(dòng)后，率先進(jìn)行了‘Pahang的基因組測(cè)序工作。

1.1? A基因組的序列測(cè)定

早在1996年就采用花藥培養(yǎng)的方法獲得了‘Pahang的雙單倍體（doubled haploid，DH）植株（DH-Pahang）[13]。以此為材料進(jìn)行全基因組測(cè)序，可以顯著降低基因組的雜合度，有利于測(cè)序后拼接與組裝。從20世紀(jì)90年代至21世紀(jì)初期，分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于香蕉種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育以及基因組組成等方面的研究。例如：擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism， AFLP）[14]、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphisms， RFLP）[12， 15]、微衛(wèi)星（microsatellites）[16-19]。多樣性陣列技術(shù)（diversity arrays technology， DArT）是一種基于DNA雜交的分子標(biāo)記技術(shù)，可在不需要序列信息的情況下同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因組位點(diǎn)的變異。Risterucci等[20]利用此技術(shù)，分析了168個(gè)Musa基因型，共鑒定出836個(gè)標(biāo)記并用于基因分型（genotyping），其中10%對(duì)A基因組特異，能夠在不同染色體倍性構(gòu)成的相關(guān)性分析中以該基因組部分為靶點(diǎn)。因DArT標(biāo)記在檢測(cè)香蕉種質(zhì)基因組組成和揭示聚類方面的準(zhǔn)確性，被用于構(gòu)建香蕉基因組的遺傳連鎖圖。DArT和SSR相結(jié)合，以M. acuminata中2個(gè)遺傳距離較遠(yuǎn)的亞種（microcarpa亞種材料‘Borneo為母本，malaccensis亞種材料‘Pisang Lilin為父本）雜交，獲得180個(gè)F1后代個(gè)體，構(gòu)建了由SSR和DArT標(biāo)記組成的親本圖譜[21]。用于DH-Pahang測(cè)序的遺傳連鎖圖，就是據(jù)此技術(shù)繪制的。根據(jù)測(cè)序DH-Pahang的親本‘Pahang的自交后代，繪制了一張遺傳圖譜。因自交后代自然條件下育性較低，用胚拯救技術(shù)[22]盡量減少自交后代個(gè)體數(shù)量的損失，從而減少潛在的分離偏差。用652個(gè)標(biāo)記（589個(gè)SSR和63個(gè)DArT）對(duì)180個(gè)‘Pahang自交后代的基因分型數(shù)據(jù)作為“異花授粉”群體確定連鎖群。LOD閾值為5.0時(shí)，可以識(shí)別11個(gè)連鎖群中的9個(gè)：LG2、LG3和LG5～LG11。通過對(duì)等位基因比率和模式的詳細(xì)分析以及NJ樹（Neighbor-Joining）分析區(qū)分了LG1和LG4。這11個(gè)連鎖群就成為DH-Pahang測(cè)序組裝后錨定在染色體上的基礎(chǔ)。

采用Sanger測(cè)序（20×）和Illumina（50×）測(cè)序方法對(duì)細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome， BAC）文庫（BAC library）進(jìn)行測(cè)序。最先在burmannica亞種的一份來自加爾各答植物園的材料，命名為‘Calcutta 4[23]，構(gòu)建了BAC library[24]。采取類似的方法，2008年構(gòu)建了‘Pahang的BAC文庫[25]。用于測(cè)序的2個(gè)分別由HindIII和BamHI酶切的DH-Pahang的BAC文庫，分別命名為MAMH（Musa acuminata malaccensis HindIII）和MAMB（Musa acuminata malaccensis BamHI）。MAMB含23 040個(gè)克隆，平均為140 kb，代表估算基因組的6.2倍。對(duì)這個(gè)文庫進(jìn)行BAC-end測(cè)序，共產(chǎn)生了2 750萬個(gè)Roche/454單端序列（single reads）和210萬個(gè)Sanger reads，代表了流式細(xì)胞儀估計(jì)的DH- Pahang基因組523 Mb大小的20.53× 覆蓋范圍。組裝（assembly）序列包括了24 425個(gè)contigs和7 513個(gè)scaffolds，總長度472.2 Mb，占預(yù)測(cè)DH- Pahang基因組大小的90%。組裝序列的90%分布在647個(gè)scaffolds中，N50（將序列從長到短排序，將它們的長度相加，長度正好為總長度的50%時(shí)的那條序列的長度）為1.3 Mb。組裝序列的70%（332 Mb）錨定在了‘Pahang遺傳圖譜的11個(gè)Musa連鎖群上。2012年發(fā)布了Musa acuminata的全基因測(cè)序結(jié)果[26]。完成A基因組測(cè)序是香蕉基因組學(xué)研究的一個(gè)重要里程碑，標(biāo)志著香蕉基因組學(xué)研究取得了重大突破，歷時(shí)12年。

2016年，采用新技術(shù)又對(duì)A基因組的數(shù)據(jù)進(jìn)行了修訂。建立了一個(gè)5 kb的DH-Pahang mate-pair文庫，并使用Illumina HiSeq 2000以40的基因組覆蓋率對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序。用模塊化的生物信息學(xué)軟件改進(jìn)基因組序列組裝，進(jìn)一步完善了Musa acuminata基因組序列草圖。分離群體的基因分型（genotyping by sequencing，GBS）和paired-end測(cè)序用于檢測(cè)和糾正scaffolds組裝錯(cuò)誤。用GBS標(biāo)記將scaffolds錨定在假分子上，避免了遺傳圖譜構(gòu)建過程中標(biāo)記排序的繁瑣步驟。此外，構(gòu)建了1個(gè)基因組圖譜，用于將scaffolds組裝成超級(jí)scaffolds。最后，將校正過的基因注釋構(gòu)建了1個(gè)新的組裝序列。這種方法將scaffolds總數(shù)從7513個(gè)減少到1532個(gè)（即減少80%），N50從1.3 Mb（65個(gè)scaffolds）增加到3.0 Mb（26個(gè)scaffolds）。89.5%的組裝序列錨定在11條染色體上，而之前僅70%的組裝序列錨定在染色體上，未知位點(diǎn)（N）由17.3%減少到10.0%[27]，基因組序列質(zhì)量得到明顯提高。

1.2? B基因組的序列測(cè)定

香蕉的生產(chǎn)分為兩大類，一類是甜香蕉或甜點(diǎn)香蕉（sweet banana或dessert banana），也稱鮮食蕉（banana），既供當(dāng)?shù)叵M(fèi)，又供出口。另一類是烹飪香蕉（cooking banana，ABB），果實(shí)通常在食用前先煮、烤或炸，還有一類是大蕉（plantain，AAB）亞群主要為當(dāng)?shù)叵M(fèi)而生產(chǎn)[28]。全球近40%的香蕉生產(chǎn)涉及A/B種間三倍體品種，占香蕉總產(chǎn)量的18%，主要種植在西非和中/南美洲。在西非和中非，估計(jì)約有7000萬人從大蕉中獲取超過四分之一的食物能量需求。鑒于B基因組的重要性，2012年，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合法國CIRAD、華大基因等國內(nèi)外多家單位，開始了B基因組的測(cè)序工作。

野生M. balbisiana為栽培香蕉品種提供了B基因組，目前沒有亞種的報(bào)道。所用的測(cè)序材料是野生二倍體基因型Pisang Klutuk Wulong（PKW， 2n=2x=22），是一種黑莖的Musa balbisiana，爪哇語中‘Klutuk是種子和烏龍黑（wulung black）的意思?；驇熘械腜KW材料是在印度尼西亞收集的[29]。為降低測(cè)序的雜合度，按照Grapin等的方法獲得雙單倍體（double haploid PKW， DH-PKW）材料[22]，進(jìn)行了全基因組測(cè)序。由于測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，B基因組測(cè)序采用PacBio單分子測(cè)序（113×）和Illumina測(cè)序（166×）的方法，共獲得58.9 Gb的PacBio單分子長reads，86.3 Gb的Illumina pair-end和mate-pair reads用于組裝。獲得492.77 Mb scaffolds，contig N50為1.83 Mb，scaffold N50為5.05 Mb，覆蓋了95%的基因組序列，經(jīng)評(píng)估，其基因組完整性達(dá)到91.3%。構(gòu)建了DH-PKW的高通量染色體構(gòu)象捕獲（high- throughput chromosome conformation capture， Hi-C）文庫，生成72 Gb（138×）的Hi-C pair-end reads。進(jìn)行重復(fù)消除、分類和質(zhì)量評(píng)價(jià)，進(jìn)行唯一的有效定位，結(jié)果將430 Mb（87.27%）和94.0%的基因組，以A基因組為參考序列，定位在11條染色體上。B基因組的測(cè)序技術(shù)先進(jìn)性、測(cè)序深度、基因組覆蓋度、contig N50、scaffold N50、定位到染色體上的序列長度都顯著高于A基因組。于2019年發(fā)布測(cè)序結(jié)果[30]，被Springer Nature遴選為2019年亮點(diǎn)工作之一，指出“該論文是2019年Springer Nature精選的最受歡迎的論文之一，反映了產(chǎn)生重要影響的頂尖研究”。

2? 香蕉亞基因組的分化

通過對(duì)越來越多的基因組數(shù)據(jù)分析表明，全基因組復(fù)制（whole-genome duplications， WGDs）在被子植物基因組進(jìn)化中起著重要作用[31]。Lescot等人通過來自13個(gè)BAC文庫的1.3 Mb的A基因組序列，并與4個(gè)先前測(cè)序的BAC進(jìn)行了注釋和分析，推導(dǎo)了與單子葉植物，以及A、B基因組可能的分化時(shí)間。首次提出了Musa系譜（Musa lineage）中WGD事件的證據(jù)[32]。經(jīng)過深度測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，A基因組的11條染色體之間存在一種復(fù)雜的旁系同源關(guān)系（paralogous relationship），發(fā)生了兩次WGD（表示為α和β），在α/β復(fù)制之前，已經(jīng)重復(fù)了的基因簇（duplicated gene clusters）被初步組裝成代表祖先基因組的12個(gè)Musa祖先基因塊（ancestral blocks），包含的重復(fù)片段覆蓋222 Mb。根據(jù)Ks（同義突變率）在旁系同源基因簇對(duì)之間的分布，推導(dǎo)出兩次WGD約發(fā)生在65 Mya（million years ago）。12個(gè)Musa祖先塊體之間的其他物種的同源關(guān)系顯示出更高的Ks值，這表明另外一個(gè)更古老的復(fù)制事件（表示為γ）發(fā)生在大約100 Mya[26]。

與其他單子葉植物相比，香蕉譜系的進(jìn)化速度相對(duì)較慢[33]?；趯?duì)519個(gè)單拷貝直系同源基因（orthologous genes）的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，A和B基因組最近的分化時(shí)間約為5.4 Mya，它們的共同祖先與禾本科植物的分化時(shí)間約為134 Mya。這估計(jì)與A和B基因組之間4.6 Mya的分化時(shí)間相近。4.6 Mya的分化時(shí)間是根據(jù)17個(gè)BAC克?。ò?3.5 kb的編碼序列）的測(cè)序結(jié)果估計(jì)得出[32]。5.4 Mya比之前估計(jì)的20.9 Mya（由3個(gè)基因和1個(gè)內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)估計(jì)）或27.9 Mya（由19F基因估計(jì)）時(shí)間更近[34-35]。在全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析研究中，增加樣本的信息量，將有助于更準(zhǔn)確地估計(jì)分化時(shí)間。

植物經(jīng)三輪WGD后，緊接著進(jìn)行基因組二倍化（diploidization）和消減（fractionation），包括染色體重排（chromosomal rearrangement）、基因丟失（gene loss）和偏好保留（biased retention）[36]。在二倍化和消減之后，A和B基因組開始獨(dú)立進(jìn)化，表現(xiàn)出了分化差異。發(fā)現(xiàn)了9038個(gè)基因家族在A、B基因組、水稻（Oryza sativa）、短柄草（Brachypodium distachyon）和葡萄（Vitis vinifera）中都是保守的。相反，A基因組中的348個(gè)基因家族以及B基因組639個(gè)基因家族具有特異性。分化后，A基因組中有1761個(gè)基因家族擴(kuò)張，203個(gè)基因家族收縮;B基因組中有392個(gè)基因家族擴(kuò)張，1008個(gè)基因家族收縮。說明B基因組對(duì)基因組的收縮比A基因組更為敏感[30]。通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）對(duì)B基因組中顯著擴(kuò)張的基因家族（P<0.05）的富集途徑分析表明，其富集在光合作用和次生代謝的生物合成，包括與肌醇、淀粉和蔗糖代謝相關(guān)的代謝途徑，亞油酸和花生四烯酸等。植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物多樣性高，除了能緩解各種非生物脅迫外，還具有抵御多種食草動(dòng)物和病原體的顯著功能[37]，與之前B基因組提高對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性有關(guān)的研究結(jié)果是一致的[38]。

3? 基因組水平上的染色體結(jié)構(gòu)變異

3.1? A基因組染色體的易位

染色體易位是染色體結(jié)構(gòu)變化的一種主要形式。M. acumicata種內(nèi)分為6～9個(gè)亞種（banksii、burmannica、malaccensis、microcarpa、zebrina、burmannicoides、truncata、siamea和errans），這些亞種在東南亞的陸地區(qū)域和島嶼上產(chǎn)生地理隔離后，發(fā)生了分化[39-40]。人類的遷徙，導(dǎo)致了這些亞種之間的接觸[41]，出現(xiàn)了亞種間雜種。細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，在減數(shù)分裂時(shí)染色體配對(duì)在亞種內(nèi)的二價(jià)體中一般是規(guī)則的，但在某些多價(jià)體和亞種間雜種的單價(jià)體是不規(guī)則的，因此導(dǎo)致這些亞種間的雜種生育率降低[42-43]。這個(gè)結(jié)果也說明亞種間的染色體結(jié)構(gòu)變異而導(dǎo)致減數(shù)分裂時(shí)出現(xiàn)了染色體配對(duì)的不規(guī)則性。

借助于A基因組測(cè)序結(jié)果，可以從DNA水平上揭示染色體易位發(fā)生。用SNP標(biāo)記野生M. acuminata亞種burmannicoides中的1份材料‘Calcutta 4[23]的自交后代分離情況，用mate-pair測(cè)序序列與malaccensis Pahang[26]參考序列進(jìn)行比對(duì)，研究染色體重排。從123份野生和栽培香蕉材料的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中，鑒定了染色體結(jié)構(gòu)的特征片段之間的連接。結(jié)果在‘Calcutta 4中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)大的相互易位：一個(gè)是2號(hào)染色體240 kb遠(yuǎn)端區(qū)域與8號(hào)染色體7.2 Mb遠(yuǎn)端區(qū)域的互換;另一個(gè)涉及到1號(hào)染色體20.8 Mb遠(yuǎn)端區(qū)域與9號(hào)染色體11.6 Mb遠(yuǎn)端區(qū)域的互換。上述兩個(gè)大的相互易位可能起源于burmannica亞種基因群[44]。

在另一個(gè)亞種M. acuminata ssp. malaccensis，通過mate-pair測(cè)序、細(xì)菌人工染色體熒光原位雜交技術(shù)（bacterial artificial chromosome and fluorescence in situ hybridization technology， BAC- FISH）、靶向PCR和DArT測(cè)序（DArT sequencing）標(biāo)記在其子代中的分離情況，分別從1號(hào)染色體遠(yuǎn)端3 Mb和4號(hào)染色體遠(yuǎn)端10 Mb鑒定出1個(gè)雜合子相互易位，表明其后代中產(chǎn)生了高度分離偏差（segregation distortion），減少了1號(hào)和4號(hào)染色體之間的重組和連鎖。結(jié)果表明，子代中這兩個(gè)染色體結(jié)構(gòu)是相互排斥的，重排的染色體結(jié)構(gòu)優(yōu)先傳遞到子代。染色體重排在三倍體品種中普遍存在，但僅在野生malaccensis中存在。表明這種重排發(fā)生在M. acuminata的malaccensis亞種中。這種重排在香蕉多樣性中的傳播機(jī)制可能在三倍體品種的出現(xiàn)中起了作用[45]。其他亞種是否存在另外的易位，還需進(jìn)一步的研究。

3.2? A、B基因組間染色體的易位與倒位

A與B基因組間大片段結(jié)構(gòu)變異（large structural variations）的第一個(gè)證據(jù)是根據(jù)種間雜交后代染色體分離而提出的[46]。從全基因組水平上，采用共線性（synteny）分析表明A和B基因組之間的基因組共線性和序列相似性很高。在A和B基因組之間鑒定出了72個(gè)大的共線性區(qū)塊（large syntenic blocks），其中的15個(gè)都包含超過900個(gè)基因?qū)?。這72個(gè)共線性區(qū)塊占A基因組的75.02%（其中含23%轉(zhuǎn)座元件）和68.01%的B基因組（含22%轉(zhuǎn)座元件）。

在A和B基因組分化之后，它們之間發(fā)生了兩個(gè)大的易位（translocation）和兩個(gè)倒位（inversion）。其中一個(gè)大的相互易位發(fā)生在B基因組1號(hào)染色體上的7.09 Mb和A基因組3號(hào)染色體上的7.03 Mb。一個(gè)倒位發(fā)生在B基因組的5號(hào)染色體（9.39 Mb）和A基因組的5號(hào)染色體上（8.83 Mb）[30]。這些易位和倒位在早前的遺傳圖譜上也有體現(xiàn)[47]，通過共線性比對(duì)，更為準(zhǔn)確地確定了易位的大小和位置。這種易位和倒位是遺傳多樣性增加的一種方式[48]。

4? 香蕉多倍體中亞基因組染色體的同源交換和替換

多倍體化似乎是植物進(jìn)化史上的一個(gè)常見事件[49]。大多數(shù)香蕉品種是多倍體的，具有不同程度的倍性和基因組背景[50]。為了解在多倍體背景下A、B基因組的同源交換，采用重測(cè)序的方法對(duì)三倍體和二倍體不同倍性，以及不同基因型香蕉進(jìn)行了重測(cè)序。重測(cè)序數(shù)據(jù)與A（Pahang）和B（PKW）基因組同時(shí)比對(duì)，確定了唯一能定位的reads用于分析覆蓋深度、變異調(diào)用和每條染色體上的同源交換。這些分析證實(shí)，香蕉種質(zhì)的基因組組成，在大多數(shù)情況下，與以往基于形態(tài)特征的基因組分類一致。在粉蕉（ABB）中鑒定了48個(gè)同源交換的片段，包括9個(gè)從B-到A-亞基因組的交換和39個(gè)反向交換。在Kamaramasenge（AAB）中，還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)從B-到A-亞基因組的同源交換片段，并在第10條染色體上A-亞基因組替換了B-亞基因組。在Pelipita（ABB）中，第2、7和11號(hào)染色體的A亞基因組被B亞基因組替換，6、9和10號(hào)染色體上有18個(gè)同源交換片段[30]。之前通過基因組原位雜交的研究結(jié)果表明了Pelipita的8A和25B染色體組成，與先前的基因組原位雜交研究一致[51]。說明在多倍體背景下，A、B基因組的同源交換和替換，是構(gòu)成多倍體香蕉遺傳多樣性的重要方面。

對(duì)于三倍體粉蕉A、B亞基因組同源基因在不同組織、果實(shí)發(fā)育和成熟的不同階段以及非生物脅迫處理后的香蕉幼苗中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，在A、B亞基因組間共鑒定出25 717對(duì)同源基因。在同源基因?qū)χ校?1.83%得到了共線性分析的證實(shí)。對(duì)所有同源基因?qū)Φ谋磉_(dá)進(jìn)行分析，以確定三倍體粉蕉中B/A表達(dá)倍數(shù)變化的分布。log2（RPKM B/RPKM A）為1.2/1，其中RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）代表每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)，這與2/1的基因組組成值不同。這個(gè)結(jié)果可以用劑量補(bǔ)償來解釋[52]。選取1075對(duì)在A基因組上調(diào)表達(dá)的同源基因，和4032對(duì)在B基因組中上調(diào)表達(dá)的同源基因進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果表明，在B基因組中具有表達(dá)優(yōu)勢(shì)的基因與2-氧羰基水楊酸代謝和精氨酸生物合成途徑有關(guān)（Q<0.05），而在A亞基因組中具有表達(dá)優(yōu)勢(shì)的基因在KEGG途徑中沒有顯著富集。利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，對(duì)那些具有表達(dá)顯性的基因構(gòu)建了一個(gè)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，87個(gè)顯性表達(dá)基因與A基因組的4302個(gè)基因互作，295個(gè)顯性表達(dá)基因與B基因組的4612個(gè)基因互作。KEGG途徑富集分析表明，A、B基因組共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的基因通常與淀粉、蔗糖代謝等代謝途徑有關(guān)。特別是，泛醌和其他萜類醌生物合成、光合作用-觸角蛋白、類胡蘿卜素生物合成和其他聚糖降解途徑在A基因組中特別豐富。B基因組中的硒復(fù)合代謝和氰胺酸代謝途徑特別豐富（Q<0.05）[30]。這些結(jié)果說明，在多倍體香蕉中，A和B基因在染色體發(fā)生上同源片段交換，并表現(xiàn)出功能分化，這些功能分化可能表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上。

5? 香蕉A、B基因組擴(kuò)張與功能

5.1? 基因組擴(kuò)張與乙烯生物合成

乙烯在果實(shí)采后呼吸躍變成熟的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[53]。乙烯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶包括S-腺苷-L-蛋氨酸合酶（S-adenosyl-L-methionine synthase， SAMS）、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase， ACS）和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase， ACO）[54]。從A基因組中鑒定出了12個(gè)SAMS、11個(gè)ACS和11個(gè)ACO基因，在B基因組中鑒定了10個(gè)SAMS、11個(gè)ACS和18個(gè)ACO基因[30]，與單子葉植物和真雙子葉植物中的其他7個(gè)測(cè)序植物物種相比[55]，這是一個(gè)顯著的擴(kuò)張。鑒定了來自A和B基因組的28對(duì)同源基因，對(duì)這些基因?qū)υ诎臀鹘叮∕usa AAA group， cv. Cavendish， BX）和粉蕉A基因組（Musa ABB group， cv. Pisang Awak， FJ）的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其與粉蕉B亞基因組表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。有趣的是，8對(duì)基因在B基因組中表現(xiàn)出同源表達(dá)優(yōu)勢(shì)，5對(duì)基因在FJ的A基因組中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[30]。

ACS和ACO以前都被證明是乙烯生物合成中的限制酶[56]。在10對(duì)ACS基因中，MaACS7/ MbACS7是Ma-ACS1的同源基因，在果實(shí)成熟過程中（主要在B基因組中）高水平表達(dá)。MbACS6和MbACS7在一個(gè)大的共線性模塊中是旁系同源基因（該共線性模塊包含19個(gè)基因?qū)Γ?，這些基因?qū)Ψ謩e與MaACS6和MaACS7保持著共線性和緊密的進(jìn)化關(guān)系，這表明這些基因是通過WGD復(fù)制而來。在9個(gè)ACO基因?qū)χ?，?對(duì)（MaACO2/MbACO6、MaACO3/MbACO7和MaACO8/MbACO13）在果實(shí)成熟過程中高水平表達(dá)，并主要在B基因組中表達(dá)。MaACO2/MbACO6和MaACO3/MbACO7分別處于A基因組的5號(hào)染色體和B基因組的6號(hào)染色體，處于1個(gè)線性模塊中，屬于同一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支。這些結(jié)果表明，MaACO2/MbACO6和MaACO3/MbACO7是獨(dú)立起源的，在果實(shí)成熟過程中發(fā)揮重要作用[30]。

基因復(fù)制是產(chǎn)生新的遺傳多樣性的主要機(jī)制，是真核生物產(chǎn)生新遺傳多樣性和進(jìn)化創(chuàng)新的基礎(chǔ)[57]。與A基因組中的11個(gè)ACO基因相比，B基因組中的ACO基因顯著擴(kuò)張到18個(gè)成員，包括位于3號(hào)染色體上的MbACO2、MbACO3、MbACO4、MbACO5，位于6號(hào)染色體上的MbACO8、MbACO9、MbACO11和位于scaffold中的MbACO16、MbACO18，是由B基因組中的串聯(lián)重復(fù)（tandem duplications）驅(qū)動(dòng)的。在B基因組擴(kuò)增的ACO基因中，MbACO2和MbACO3在果實(shí)成熟期表現(xiàn)出很強(qiáng)的表達(dá)水平，在果實(shí)采后6 d（days postharvest， DPH）粉蕉中的log2RPKM>11，這與乙烯躍變期一致。此外，MbACO8、MbACO9、MbACO11、MbACO16、MbACO18在開花后0 d（days post flowering， DAF）在根和果實(shí)中高表達(dá)。這些基因?qū)儆谕粋€(gè)簇，它們的表達(dá)模式與它們的復(fù)制高度一致，表明B基因組中ACO基因的擴(kuò)張和進(jìn)化有助于組織發(fā)育和果實(shí)成熟[30]。在采后成熟過程中，F(xiàn)J比BX成熟快與乙烯生物合成和果實(shí)成熟相關(guān)基因?qū)Φ娘@性表達(dá)以及B基因組中ACO家族的擴(kuò)張有關(guān)。

5.2? 基因組擴(kuò)張與淀粉代謝

淀粉是植物中最廣泛和最豐富的貯藏碳水化合物，也是香蕉果實(shí)的主要成分，在香蕉果實(shí)發(fā)育過程中大量積累（約占干重的60%～75%），導(dǎo)致大淀粉顆粒（約8～30 nm）的存在，以及在收獲后成熟期間幾乎完全轉(zhuǎn)化為可溶性糖[58-60]。負(fù)責(zé)淀粉生物合成的主要酶[61]（sugars will eventually be exported transporter， SWEET; sucrosetransporter， SUT; sucrose synthase， SuSy; UDP-glucose pyro- phosphorylase， UGPase; ADP-glucose pyrophos- phorylase， AGPase; granule-bound starch synthase， GBSS; soluble starch synthase， SSS; starch branch- ing enzyme， SBE; starch debranching enzyme， DBE）和降解淀粉的主要酶（α-amylase， AMY; β-amylase， BMY; starch phosphorylase， DPE）由多基因家族編碼。在A基因組中鑒定了101個(gè)淀粉代謝相關(guān)基因，其中77個(gè)參與淀粉合成途徑，24個(gè)參與淀粉降解途徑。在B基因組中鑒定出淀粉合成途徑中的68個(gè)基因，以及淀粉降解途徑中的28個(gè)基因[30]。

在淀粉合成途徑中，9個(gè)基因家族中的5個(gè)（SuSy、GBSS、SSS、SBE和DBE）與其他7種植物（包括番茄和葡萄）相比，在香蕉的A和B基因組中表現(xiàn)出明顯的擴(kuò)張。在這些家族的A和B基因組中鑒定了54個(gè)同源基因?qū)?。其中?7個(gè)同源基因?qū)υ诟⑷~和果實(shí)組織中具有表達(dá)優(yōu)勢(shì)，其中7對(duì)在A亞基因組中占優(yōu)勢(shì)，20對(duì)在B亞基因組中占優(yōu)勢(shì)。因此，淀粉合成途徑在B基因組中的不同組織中比在A基因組中更為活躍。那些在B亞基因組中顯性表達(dá)的基因?qū)χ校诠麑?shí)采前0 DAF和20 DAF時(shí)，MbSWEET17、MbSuSy1、MbSuSy2和MbSuSy9的表達(dá)水平較高，表明對(duì)果實(shí)發(fā)育過程中的淀粉合成起重要作用。相比之下，大多數(shù)淀粉合成相關(guān)基因（A或B基因組特有）表現(xiàn)出低表達(dá)水平[30]。

在淀粉降解途徑中基因組注釋表明，與其他7種植物相比，AMY和BMY家族在香蕉A和B基因組中有明顯的擴(kuò)張。從A和B基因組中鑒定了21個(gè)同源基因?qū)?。在這些基因?qū)χ校?1個(gè)具有顯性表達(dá)，并且在果實(shí)成熟期間與B基因組相關(guān)。在顯性表達(dá)基因中，MbAMY-2、MbAMY-3、MbAMY-8、MbBMY-6、MbBMY-8和MbDPE-2在果實(shí)成熟過程中表現(xiàn)出高表達(dá)。MbAMY-1、MbAMY-2、MbAMY-3、MbAMY-4、MbAMY-5和MbAMY-6、MbAMY-7、MbAMY-8顯示出緊密的親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系，表明這些基因是從串聯(lián)拷貝復(fù)制的。MbBMY-5、MbBMY-8和MbBMY-6、MbBMY-12是B基因組處于1個(gè)共線性模塊中的兩個(gè)旁系同源基因?qū)?，顯示出密切的進(jìn)化關(guān)系，表明這些基因來源于WGD[41]。綜上所述，表明B基因組中串聯(lián)驅(qū)動(dòng)的AMY復(fù)制和WGD驅(qū)動(dòng)的BMY復(fù)制有助于淀粉降解。B基因組中淀粉生物合成相關(guān)基因的顯性表達(dá)可能導(dǎo)致FJ果實(shí)發(fā)育過程中淀粉積累增加。此外，與淀粉降解相關(guān)的基因在B基因組中的顯性表達(dá)也可能導(dǎo)致FJ中淀粉降解的升高[30]。因此，在果實(shí)發(fā)育和成熟過程中，B基因組在淀粉代謝途徑中分別導(dǎo)致顯著的淀粉積累和降解。

6? 展望

6.1? 繼續(xù)廣泛進(jìn)行基因組測(cè)序工作

由于基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，全基因組測(cè)序已成為基因組學(xué)的一個(gè)常規(guī)技術(shù)，越來越多的植物物種（品種）都已完成了全基因組測(cè)序。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2018年12月31日，僅園藝植物就有181種完成測(cè)序[62]。據(jù)估計(jì)全球約有39.1萬種陸地植物，此外還有8000種綠藻，與其他生物界相比，它們的基因組異常多樣，從10 Mb到100 Gb不等，目前已獲得的全基因組數(shù)據(jù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類的需求[63]。因此，有學(xué)者提出了萬種植物基因組測(cè)序計(jì)劃（10 000 Plants Project， 10 kP），旨在將我們對(duì)植物基因組的了解擴(kuò)大到比目前所知范圍更廣的物種[64]。香蕉的基因組測(cè)序雖然取得了一些進(jìn)展，除了兩個(gè)野生親本外，還有2個(gè)野生近緣種——Musa itinerans[65]和M. schizocarpa（S基因組）[66]也進(jìn)行了全基因組測(cè)序。因?yàn)樗鼈儾皇菑念^獲得的，沒有將這些最終組裝序列與現(xiàn)有參考序列進(jìn)行比較，且基因組的連續(xù)性較差，得到的組裝序列是片段化的，影響了數(shù)據(jù)的使用?，F(xiàn)保存在國際生物多樣性組織香蕉種質(zhì)資源轉(zhuǎn)運(yùn)中心（Bioversity International Musa Germplasm Transit Centre， ITC）的1500多種可食和野生香蕉種質(zhì)，被認(rèn)為是全球香蕉多樣性最豐富的保存庫。全世界大約有500個(gè)香蕉品種，然而，在全世界種植的所有品種中，超過40%只屬于一個(gè)基因狹窄的群體——Cavendish亞群。要加快栽培品種的選育，就必須借助于全基因組測(cè)序，深入了解其基因來源、演化規(guī)律等。在A、B基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，加快幾個(gè)野生亞種的序列測(cè)定，對(duì)品種的遺傳構(gòu)成加以解析。

6.2? 盡快啟動(dòng)表型組學(xué)研究

隨著基因組學(xué)技術(shù)的不斷擴(kuò)展，基因組學(xué)研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。然而，基因組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)作物改良的影響仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意，遠(yuǎn)沒有達(dá)到“聯(lián)盟”成立之初所預(yù)見的那樣“對(duì)植物進(jìn)行基因改造，使其在不同的生物、生態(tài)和文化環(huán)境中獲得最佳性能，從而造福于人類和環(huán)境”。這在很大程度上是由于缺乏有效的表型數(shù)據(jù)。收集有用的高質(zhì)量表型數(shù)據(jù)的能力落后于目前產(chǎn)生高通量基因組學(xué)數(shù)據(jù)的能力。因此，從基因組學(xué)轉(zhuǎn)移到表型組學(xué)（phenomics）是基因組學(xué)研究的必然結(jié)果[67]。表型分析是一項(xiàng)困難而復(fù)雜的研究工作，其難點(diǎn)表現(xiàn)在：（1）有效的表型分析。有效的表型被認(rèn)為是彌合數(shù)量性狀基因型-表型差距的關(guān)鍵因素[67]，利用大量種質(zhì)資源發(fā)現(xiàn)候選數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus， QTL）對(duì)足夠廣泛的性狀進(jìn)行表型定位，從而發(fā)現(xiàn)QTL/基因，并克隆重要基因以用于分子育種。（2）表型的穩(wěn)定性。表型的穩(wěn)定性必須要進(jìn)行大量的重復(fù)試驗(yàn)，才能在復(fù)雜多變的環(huán)境中對(duì)群體或種質(zhì)進(jìn)行表型分型，以便捕捉到有益性狀的代表性變異，如生物和非生物脅迫耐受性、產(chǎn)量、品質(zhì)等，并且要證明這些性狀可以穩(wěn)定遺傳。（3）表型的分析方法。通過使用高通量有效的表型分析技術(shù)篩選大量種質(zhì)資源，加快植物育種進(jìn)程[68]。目前在其他植物中已經(jīng)使用的高通量有效的分析技術(shù)包括非侵入性成像、光譜學(xué)、圖像分析、機(jī)器人技術(shù)、高性能計(jì)算設(shè)備和建立表型數(shù)據(jù)庫等，系統(tǒng)地收集表型數(shù)據(jù)。這些現(xiàn)代表型組學(xué)平臺(tái)和工具旨在記錄植物生長、發(fā)育、結(jié)構(gòu)、光合作用或生物量等性狀的數(shù)據(jù)，在一天之內(nèi)記錄成百上千株植物，這是一場(chǎng)表型組學(xué)革命。對(duì)于香蕉而言，這一切似乎還很遙遠(yuǎn)。目前，表型數(shù)據(jù)的收集還處在對(duì)資源或品質(zhì)的性狀描述階段。香蕉的表型組學(xué)研究的挑戰(zhàn)在于大多數(shù)品種來源單一，性狀間的差異很小，增加了表型分型的難度。香蕉的繁殖方式大多是無性繁殖，性狀的穩(wěn)定性要通過長期觀察才能獲得，需要耗費(fèi)大量人力物力。香蕉植株高大，增加了設(shè)備、設(shè)施的投入，成本高。這些都制約著香蕉表型組學(xué)的研究。

6.3? 今后一段時(shí)間的重點(diǎn)工作

香蕉基因組學(xué)研究的20年歷程，雖然取得了一些積極進(jìn)展，但將基因組學(xué)研究成果應(yīng)用于新品種的創(chuàng)制仍需進(jìn)一步努力。目前應(yīng)著重從以下3個(gè)方面積極開展工作：一是加大種質(zhì)資源引進(jìn)、收集、鑒定和評(píng)價(jià)，擴(kuò)大資源擁有量;二是圍繞香蕉系統(tǒng)演化、遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變異與馴化、不育性和營養(yǎng)繁殖等重大科學(xué)問題，持續(xù)深入開展基因組學(xué)研究;三是加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因育種[69]、基因編輯[70]等技術(shù)研究，加快新功能基因的應(yīng)用。

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