綿羊肺炎支原體和小反芻獸疫病毒雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立

霍曉麗　李文良　毛立　楊蕾蕾　劉茂軍　張紋紋　李基棕　孫敏

摘要：綿羊肺炎支原體（MO）和小反芻獸疫病毒（PPRV）都可以造成山羊和綿羊的呼吸系統(tǒng)疾病，二者常呈現(xiàn)混合感染，給我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的威脅和經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)二者的檢測(cè)有助于了解臨床疾病混合感染情況、更好地防控呼吸道疾病。本研究的目的是建立同時(shí)檢測(cè)綿羊肺炎支原體和小反芻獸疫病毒的雙重RT-PCR檢測(cè)方法。根據(jù)公布的基因序列針對(duì)MO和PPRV的16S rDNA和N基因設(shè)計(jì)合成2對(duì)特異性引物，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，進(jìn)而通過(guò)退火溫度和引物濃度的優(yōu)化、特異性和靈敏性檢測(cè)，建立雙重RT-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法能特異性擴(kuò)增MO（359 bp）和PPRV（686 bp）基因片段，其特異性好，敏感性高，對(duì)MO和PPRV的最小檢出量分別為103拷貝/μL和102拷貝/μL。對(duì)部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法可有效檢測(cè)這2種病原，與單重PCR具有較高的符合率。本研究建立的雙重 RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性，可用于臨床樣品MO和PPRV感染的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：綿羊肺炎支原體;小反芻獸疫病毒;雙重RT-PCR;標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒;混合感染

中圖分類號(hào)：S858.26?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0185-05

收稿日期：2019-12-10

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（18）2003]。

作者簡(jiǎn)介：霍曉麗（1995—），女，山西晉中人，碩士研究生，從事動(dòng)物疫病診斷防控技術(shù)研究。E-mail：942975692@qq.com。

通信作者：李文良，博士，副研究員，從事動(dòng)物疫病診斷防控技術(shù)研究。E-mail：kfliwenliang@163.com。

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，簡(jiǎn)稱PPR）是由小反芻獸疫病毒（peste des petis ruminants virus，簡(jiǎn)稱PPRV）引起的一種具有高度傳染性的動(dòng)物病毒性疾病[1]。小反芻獸疫引起小反芻動(dòng)物發(fā)熱、眼和鼻出現(xiàn)大量分泌物、肺炎、白細(xì)胞減少、呼吸困難、上消化道潰瘍糜爛和腹瀉等主要癥狀[2]。我國(guó)的第一例 PPR 病例于 2007 年發(fā)現(xiàn)于西藏自治區(qū)[3]，2013—2014年P(guān)PR再次出現(xiàn)并迅速蔓延至多個(gè)?。ㄊ校4-5]。小反芻獸疫傳播迅速，跨度范圍大，感染風(fēng)險(xiǎn)大，給我國(guó)動(dòng)物疫病防控造成了巨大威脅。綿羊肺炎支原體（mycoplasma ovipneumoniae，簡(jiǎn)稱MO）是造成羊支原體肺炎（mycoplasmal pneumonia of sheep）的一種重要病原體，是目前影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展的主要呼吸道病原[6]。在臨床上表現(xiàn)的主要特征是發(fā)熱、咳嗽、流涕同時(shí)出現(xiàn)肺炎和胸膜炎[7]，發(fā)病過(guò)程多取急性或慢性，有很高的病死率，呈全球性分布[8]，多流行于中東、東亞、澳洲等養(yǎng)羊業(yè)較為集中的國(guó)家。在我國(guó)，自 1982年胡景韶等首次分離到 MO以來(lái)[9]，羊支原體肺炎流行日益普遍，危害增強(qiáng)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)造成巨大威脅。

MO和PPRV均為引起山羊呼吸道疫病的主要病原，臨床上常呈現(xiàn)混合感染，因此正確有效地檢測(cè)混合感染情況對(duì)了解疾病的發(fā)生及防控具有重要意義。支原體分離培養(yǎng)和病毒分離是檢測(cè)病原的常用方法，但此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和生物安全性要求很高，很容易因操作原因?qū)е路蛛x失敗，且絕大部分實(shí)驗(yàn)室不具備病毒分離的條件，這給這2種病原的快速診斷帶來(lái)困難。目前對(duì)于綿羊肺炎支原體和小反芻獸疫病毒的檢測(cè)已經(jīng)分別建立了分子生物學(xué)方法特異的PCR或RT-PCR方法，這種方法可以廣泛應(yīng)用在對(duì)病原的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面[10-11]，但是，建立能夠同時(shí)檢測(cè)MO和PPRV的PCR方法將更有利于臨床檢測(cè)。因此，本研究通過(guò)篩選靶基因和引物組合，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立同時(shí)檢測(cè)MO和PPRV的雙重RT-PCR方法，以期為這2種病原的檢測(cè)提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 菌、毒株

山羊支原體（PG3株）、MO（Y98株）、絲狀支原體（F38株）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;PPRV疫苗（PPRV Nigeria 75/1株）購(gòu)自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司;山羊痘活疫苗購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司;藍(lán)舌病病毒（BTV）[12]、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）[13-14]、邊界病病毒（BDV）[15]、山羊副流感病毒3型（CPIV3）[16]、山羊皰疹病毒Ⅰ型（CpHV-1）[17]由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、10×K buffer、pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司; DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Trans Zol UP、一步法RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA/RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中的MO 16S rDNA序列和PPRV N基因序列，利用Primer 5和MPprimer軟件設(shè)計(jì)不同的引物組合，然后篩選出2對(duì)特異性引物對(duì)（表1），引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

取200 μL MO培養(yǎng)液置于1.5 mL離心管（RNase free）中，參考核酸提取試劑說(shuō)明書提取DNA，用引物MO1、MO2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：0.2 mL PCR反應(yīng)管中加入2×PCR Mix10 μL，上下游引物各0.5 μL，核酸模板2 μL，無(wú)菌雙蒸水加至總體積為20 μL，混勻。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。

將MO和PPRV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒混合物按10倍梯度稀釋為1×108拷貝/μL至1×100拷貝/μL，取每個(gè)稀釋度樣品進(jìn)行雙重RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示，該方法對(duì)MO的最小檢出量為103拷貝/μL，對(duì)PPRV的最小檢出量為102拷貝/μL。

2.6 臨床樣品檢測(cè)

利用建立的雙重RT-PCR方法對(duì)2015—2018年采集的165份臨床樣本（鼻拭子和血清）進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂凝膠電泳結(jié)果如表2所示，165份樣本中有79份呈MO陽(yáng)性，有30份呈PPRV陽(yáng)性，其中MO和PPRV混合感染的有21份。檢測(cè)結(jié)果與單一PCR和RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果符合率為：MO 98.7%、PPRV 100%。這說(shuō)明本試驗(yàn)建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法可有效地對(duì)臨床樣品中的MO和PPRV進(jìn)行快速同步檢測(cè)。

3 討論

MO在全球范圍內(nèi)均有分布，且有很高的流行率，筆者所在實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)對(duì)江蘇省及周邊地區(qū)患呼吸道疾病的山羊和綿羊鼻拭子、肺臟等樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，MO普遍存在，該結(jié)果在臨床疾病防控中發(fā)揮重要作用。PPRV自2013年年底再次傳入我國(guó)多個(gè)?。▍^(qū)），造成了巨大的損失，目前雖然通過(guò)疫苗免疫已經(jīng)很好控制了疫病的流行和發(fā)生，但仍有散播病例。這2種病原臨床上經(jīng)?；旌细腥緦?dǎo)致羊呼吸道疾病的發(fā)生。PCR和RT-PCR方法操作簡(jiǎn)便、快速且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，已被廣泛用于這2種病原的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。但是，目前僅有單獨(dú)檢測(cè)MO和PPRV的PCR和RT-PCR方法，需分別進(jìn)行檢測(cè)。因此，本研究建立一種一步法雙重RT-PCR方法，以同時(shí)、快速、準(zhǔn)確、方便地檢測(cè)這2種病原。

由于PCR方法敏感性高，容易污染，且PPRV為RNA病毒，檢測(cè)時(shí)需要先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而檢測(cè)MO時(shí)則直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此，本研究方法采用核酸提取試劑盒從樣品中同時(shí)提取DNA和RNA，擴(kuò)增反應(yīng)采用一步法RT-PCR方法，以減少操作和加樣步驟，減少污染的機(jī)會(huì)并提高檢測(cè)效率。

引物設(shè)計(jì)是決定雙重PCR成敗的關(guān)鍵。利用多重PCR引物設(shè)計(jì)系統(tǒng)MPprimer軟件針對(duì)MO和PPRV基因分別設(shè)計(jì)多對(duì)引物并進(jìn)分析篩選最佳引物組合，在設(shè)計(jì)過(guò)程中，不僅要考慮到每對(duì)引物的Tm值、GC含量以及引物特異性，還應(yīng)確保這些引物對(duì)之間有相近的Tm值，同時(shí)需保證不同的擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳后能夠很清晰地分辨;進(jìn)而通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證篩選針對(duì)MO和PPRV的引物組合，用于同時(shí)特異地檢測(cè)MO和PPRV。在設(shè)計(jì)篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有些引物組合經(jīng)軟件預(yù)測(cè)效果良好且特異，但試驗(yàn)驗(yàn)證時(shí)擴(kuò)增效果不理想，因此在雙重PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)使用軟件分析篩選多個(gè)引物組合并通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證其應(yīng)用效果。使用設(shè)計(jì)好的引物分別用單重PCR/RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，得到特異性片段并克隆入pMD18-T載體上構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，作為雙重RT-PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照。同時(shí)，為了減少引物對(duì)間的干擾，獲得最佳檢測(cè)效果，本研究對(duì)雙重RT-PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳引物反應(yīng)濃度比為1 ∶1，即各上下游引物均為0.5 μL，最佳退火溫度為52 ℃。敏感性和特異性試驗(yàn)證明，本研究方法具有良好的特異性和較高的敏感性。通過(guò)對(duì)165份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)證明，雙重RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果與單一PCR和RT-PCR有很高的符合率。臨床樣品中MO感染率較高（約50%），說(shuō)明MO臨床感染率較高，在PPRV陽(yáng)性樣品中，有70%（21/30）混合感染MO，表明PPRV與MO混合感染較普遍，在PPRV的臨床檢測(cè)時(shí)應(yīng)考慮混合感染情況。

總之，本研究建立的雙重RT-PCR方法可用于同時(shí)檢測(cè)臨床樣品中的綿羊肺炎支原體和小反芻獸疫病毒，操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、敏感性高且可減少污染機(jī)會(huì)、提高檢測(cè)效率，可作為臨床呼吸道疾病樣品快速檢測(cè)的有力工具，具有較好的應(yīng)用前景。

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