清流雪薯組培復(fù)壯技術(shù)

李麗紅　華樹妹　陳芝華　李清　張楊文　鄧才生

摘要：以清流雪薯有節(jié)莖段為外植體，通過對誘導(dǎo)、增殖、生根及移栽影響因子的研究，初步建立清流雪薯的組培復(fù)壯技術(shù)體系。結(jié)果表明，初代培養(yǎng)中，上部莖段用70%乙醇15 s+0.1%氯化汞5 min，中下部莖段用70%乙醇30 s+0.1%氯化汞9 min消毒效果最佳;有節(jié)莖段的誘導(dǎo)培養(yǎng)以MS+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+4.5 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭效果最佳，萌芽率達(dá)88.0%;增殖最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+2.0 mg/L AD+30.0 g/L蔗糖+4.5 g/L瓊脂，增殖系數(shù)為3.03;最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+20.0 g/L蔗糖+4.5 g/L瓊脂+0.5 g/L活性炭，生根率達(dá)97%;煉苗后，移入進口泥炭 ∶珍珠巖=2 ∶1 的基質(zhì)中，成活率達(dá)100%。

關(guān)鍵詞：山藥;組培;復(fù)壯;清流雪薯

中圖分類號： S632.104+.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0151-05

收稿日期：2019-12-11

基金項目：福建省引導(dǎo)性項目（編號：2017N0051、2018N02020275）。

作者簡介：李麗紅（1980—），女，河南焦作人，碩士，助理研究員，主要從事山藥種質(zhì)資源遺傳育種研究。E-mail：red7603@163.com。

山藥學(xué)名薯蕷，為薯蕷科薯蕷屬一年生或多年生草質(zhì)藤本植物，是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，主要食用部位為地下部肥大的肉質(zhì)塊莖，具有健脾、補肺、固腎、除濕、益精補氣的功效[1]。山藥為無性繁殖植物，長期無性繁殖加上人們對留種種薯選擇或貯藏不當(dāng)?shù)仍?，?dǎo)致山藥出現(xiàn)病害加重、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、種性退化等現(xiàn)象。李明軍等研究認(rèn)為，病毒病是造成懷山藥種性退化、產(chǎn)量降低的重要原因，并圍繞懷山藥脫毒快繁開展了許多研究工作[2]。福建地區(qū)山藥病毒病較少，品種退化主要表現(xiàn)為產(chǎn)量降低，山藥薯皮黑斑逐年增多，尤其在當(dāng)?shù)厣剿幹鳟a(chǎn)區(qū)問題尤為突出，嚴(yán)重的病害黑斑可深入薯肉0.5～1.0 cm，能極大地影響山藥的商品性，農(nóng)民只能將山藥削皮出售，這不僅增加了勞動成本，降低了收益，同時也限制了山藥的對外銷售，對當(dāng)?shù)厣剿幃a(chǎn)業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。

清流雪薯是福建省清流縣首個獲農(nóng)業(yè)農(nóng)村部評審認(rèn)證的國家級地理標(biāo)志產(chǎn)品，該山藥品種具有個體較粗大、渾圓、均勻，薯體堅實，切口少黏液，不易褐變，耐貯藏等優(yōu)點，而且薯質(zhì)粉性足、細(xì)膩、雪白、味鮮，深受人們的喜愛，但近年來該品種退化現(xiàn)象嚴(yán)重，亟需解決。目前，山藥生產(chǎn)上主要采用零余子繁殖的方式進行品種復(fù)壯，清流雪薯為褐苞薯蕷類型，在福建地區(qū)并不結(jié)實零余子，無法通過零余子進行復(fù)壯。

本試驗通過組織培養(yǎng)技術(shù)復(fù)壯該品種，使其優(yōu)良品種種性得以保存延續(xù)。褐苞薯蕷類型山藥，組培快繁較其他類型的山藥品種更難，筆者所在課題組從2011年開始一直致力于褐苞薯蕷類型山藥的組培復(fù)壯技術(shù)研究，現(xiàn)已在組培、移栽等多方面取得較大進展，并在生產(chǎn)上取得一定的應(yīng)用成效，現(xiàn)就清流雪薯的組培復(fù)壯技術(shù)進行報道，為該品種的復(fù)壯及組培苗工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料由福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，2018年3月中下旬，種植健康無病蟲危害的清流雪薯，切段種植于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院大棚內(nèi)，待到山藥藤蔓生長旺盛期，剪取上部約30 cm藤蔓作為外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒與誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

將藤蔓用剪刀去掉葉片，將其分為上部（頂端5～8 cm）和中下部2個部分，并剪成長度為1.5 cm左右?guī)Ч?jié)間的莖段，分別放在不同的容器中，置于超凈工作臺上。首先對莖段進行表面殺菌，分別倒入70%乙醇輕輕晃動15、30 s，用無菌水沖洗2～3次，然后用0.1% HgCl2消毒劑進行深層滅菌，兩者設(shè)置不同的時間處理（3、5、6、7 min和7、8、10、12 min），期間不斷搖動，最后用無菌水沖洗5～6次。將消毒處理后的有節(jié)莖段接種于MS+KT（激動素，0.5、1.0、1.5 mg/L）+0.1 mg/L NAA（萘乙酸）和MS+6-BA（細(xì)胞分裂素，0.5、1.0、1.5 mg/L）+0.1 mg/L NAA誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每瓶接種1個莖段，每個處理接種20瓶，重復(fù)2次，之后每周統(tǒng)計1次污染率。一般10 d后，在莖段葉腋處出現(xiàn)萌芽，30 d 統(tǒng)計萌芽率。

1.2.2 培養(yǎng)基配方

誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)均以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉4.5 g/L以及不同類型和濃度的激素組合（表2、表3），誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加0.3 g/L活性炭，pH值調(diào)至6.0，增殖培養(yǎng)基不添加活性炭。生根培養(yǎng)基則以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖20 g/L、瓊脂粉4.5 g/L、活性炭0.5 g/L 以及不同濃度的生長素（表4），pH值調(diào)至5.8。配制分裝后于121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照度1 500 lx，每日光照14 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS軟件中的LSD方法進行數(shù)據(jù)處理和方差分析，各指標(biāo)計算公式：污染率=污染苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%;腋芽誘導(dǎo)率=腋芽萌發(fā)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;增殖系數(shù)=切出有效芽總數(shù)/接種芽數(shù)×100%;生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對外植體消毒效果的影響

由表1中數(shù)據(jù)可以看出，隨著氯化汞消毒時間的延長，無論上部還是中下部的莖段污染率均呈下降趨勢。上部莖段在70%乙醇15 s+0.1%氯化汞5 min與70%乙醇15 s+0.1%氯化汞4 min 2個處理間污染率差異達(dá)極顯著水平，70%乙醇15 s+0.1%氯化汞5 min與70%乙醇15 s+0.1%氯化汞6 min、70%乙醇15 s+0.1%氯化汞7 min處理之間污染率差異未達(dá)到顯著水平，但消毒處理70%乙醇15S+0.1%氯化汞5 min萌芽率最高，與其他幾個處理之間差異顯著，尤其當(dāng)上部莖段消毒處理時間為7 min時，莖段褐化加重，萌芽率與處理時間為5、6 min相比極顯著降低，故上部莖段最適宜的消毒時間為70%乙醇15 s+0.1%氯化汞5 min。中下部莖段不同消毒時間處理之間污染率差異均達(dá)到顯著水平，說明隨著消毒時間的延長，污染率呈顯著下降趨勢，但萌芽率以70%乙醇30 s+0.1%氯化汞9 min消毒處理時最高，并與其他幾個處理差異達(dá)顯著水平，故中下部莖段最佳消毒時間為70%乙醇30 s+0.1%氯化汞9 min?？傮w看，上部莖段較中下部莖段更容易消毒，污染率低，但萌芽率也低;中下部莖段污染率高于上部莖段，但萌芽率高，這可能是中下部莖段較粗壯，芽體發(fā)育更成熟的原因。

2.2 不同濃度KT、6-BA和NAA組合對山藥芽誘導(dǎo)的影響

將有節(jié)莖段插入不同濃度生長調(diào)節(jié)劑的初代培養(yǎng)基上，節(jié)基部靠近培養(yǎng)基，基部以上露于培養(yǎng)基外。一般10 d左右會在葉腋處萌出小芽，1個月后，生長好的可達(dá)3 cm，具有2～3個節(jié)，差的僅萌發(fā)出1個芽點，這種芽點有的會慢慢長大，有的則會逐漸褐化，慢慢死亡。從表2可以看出，4號、5號、6號培養(yǎng)基萌芽率極顯著高于1號、2號和3號培養(yǎng)基，也就是說KT不同水平處理極顯著優(yōu)于6-BA處理。KT處理中又以5號培養(yǎng)基萌芽率最高，達(dá)88.0%，與4號培養(yǎng)基和6號培養(yǎng)基差異極顯著，且萌芽多為對生芽（圖1-A）。6-BA處理中1號和2號培養(yǎng)基萌芽率差異未達(dá)到顯著水平，分別為52.3%和51.3%。2號與3號培養(yǎng)基萌芽率差異達(dá)極顯著水平，說明3號培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基時效果最差。從莖段不同部位萌芽率來看，以莖蔓中下部的節(jié)段萌芽率高，莖蔓上部的莖段萌芽率低。不同培養(yǎng)基除萌芽率不同外，萌芽質(zhì)量也存在較大差異，KT誘導(dǎo)萌芽早，芽較健壯，萌芽成活率高，6-BA誘導(dǎo)萌芽較晚，芽的質(zhì)量較差，多為芽點，萌發(fā)后不再生長，成活率較低。因此，無論從萌芽率還是芽的長勢看，均1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA處理最優(yōu)。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對山藥增殖效果的影響

從表3可以看出，1 mg/L KT+0.1 mg/L NAA雖然誘導(dǎo)效果好，但用于增殖效果較差，主要表現(xiàn)為多數(shù)生根、植株生長健壯，葉色濃綠，但不增殖。將KT的濃度增加到3 mg/L，仍不增殖，而在1.0 mg/L KT中在加入少量的6-BA即開始增殖，說明山藥繼代培養(yǎng)時對KT不敏感，而對6-BA比較敏感。綜合分析，增殖培養(yǎng)基最佳組合是MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA+2 mg/L AD（腎上腺髓質(zhì)的主要激素），芽多，葉色濃綠，生長健壯，成苗率高（圖1-B）。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對山藥生根效果的影響

由表4可知，0.5 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭與0.3 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭2個處理的生根率分別為94%和97%，兩者之間差異達(dá)顯著水平，未達(dá)到極顯著水平。而1.0 mg/LKT+0.1 mg/L NAA與其他2個處理之間差異達(dá)到極顯著水平，生根率僅為89%，說明除1.0 mg/LKT+0.1 mg/L NAA處理外，其他2個處理均可作為生根培養(yǎng)基使用，但0.3 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA+0.5 g/L 活性炭的培養(yǎng)基生根條數(shù)及側(cè)根更多、苗生長更健壯（圖1-C）。一般山藥生根培養(yǎng)10 d左右根系開始生長，同時植株長高，葉片長大，35 d左右即可根據(jù)根系及植株生長情況進行移栽種植。

2.5 不同栽培基質(zhì)對組培苗移栽成活率的影響

移栽前2周，將瓶苗搬至溫室大棚內(nèi)，放置1周，使其適應(yīng)外界環(huán)境，如遇到氣溫較高時，需覆蓋遮陽網(wǎng)，避免組培苗被灼傷。1周后，打開瓶蓋煉苗1～2 d，再用鑷子小心把苗夾取出來，用自來水將基部的培養(yǎng)基沖洗干凈，并用多菌靈800倍液浸泡5 min，然后移至穴盤種植。從表5可以看出，3種基質(zhì)中普通草炭土 ∶細(xì)沙=2 ∶1時成活率略低，為95%。進口泥炭土與珍珠巖（2 ∶1）和進口泥炭土與細(xì)沙（2 ∶1）配比成活率均為100%，但由于珍珠巖透氣性更好，進口泥炭土與珍珠巖（2 ∶1）配比根系須根多，效果更好 （圖1-E）。

3 結(jié)論與討論

外植體消毒是誘導(dǎo)栽培的關(guān)鍵步驟，消毒時間的長短不但影響污染率， 還直接關(guān)系外植體的褐化率及萌芽率。本研究中，隨著氯化汞消毒時間的延長，污染率減少，但褐化程度加重，從而影響萌芽率。中下部莖段發(fā)芽率明顯高于上部莖段，因此，清流雪薯組培最適宜選用植株中下部莖段，70%乙醇30 s+0.1%氯化汞9 min或者根據(jù)材料不同部位做適當(dāng)調(diào)整，同時考慮取材時期，這樣更有利于提高萌芽率。但也有研究認(rèn)為，山藥頂端10 cm幼嫩莖段表面光滑、易消毒，更適合作外植體使用[3]。

本試驗中KT誘導(dǎo)整體好于用6-BA誘導(dǎo)，清流雪薯用1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA的激素組合最適宜山藥芽體的誘導(dǎo)，不僅芽體誘導(dǎo)形成的時間短，且形成的芽體飽滿有活性，可直接長成健康植株。但KT用于增殖效果不好，表現(xiàn)為葉片生長，生根，植株較大，但幾乎不長新芽，增殖系數(shù)很低。本試驗中清流雪薯適宜芽體增殖的最佳培養(yǎng)基激素組合為0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L AD，這與前人研究結(jié)果[4-8]不同，這可能與山藥不同類型及品種有關(guān)，因此，在進行山藥組培苗生產(chǎn)時，應(yīng)針對不同品種篩選出適宜的激素類型和濃度。本研究還發(fā)現(xiàn)，添加AD有利于山藥組培苗的生長，具體原因還有待進一步研究。

褐化是山藥組培過程中存在的普遍現(xiàn)象，也是限制一些山藥品種開展組培研究工作的重要因素。黃玉吉等研究表明，添加2.0 mg/L活性炭及100 mg/L 抗壞血酸，山藥莖段基本不褐變，出芽率高[9]。劉金英等研究表明，添加AC、VC 和 PVP等抗氧化劑，僅有AC能有效地抑制褐變，但AC對試管苗生長有較大的影響[4]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)階段添加AC有助于減輕褐化，促進萌芽和生長，但在增殖階段添加AC的組培苗則以生根和莖葉生長為主，影響增殖率，研究結(jié)果和劉金英等的報道結(jié)果有相似之處。

組培苗的移栽成活率是關(guān)系組培苗能否在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的關(guān)鍵[10]，山藥組培苗移栽成活率的高低除與品種、移栽基質(zhì)有關(guān)外，移栽種植的大棚環(huán)境也至關(guān)重要。本試驗初期在簡易大棚中種植，加上南方春季氣溫變化無常，移栽成活率受天氣影響較大，成活率較低。溫度低，組培苗生根慢、易霉?fàn)€;溫度高，組培苗葉片易萎蔫枯死，不但移栽成活率低，且成活的苗因受損嚴(yán)重，質(zhì)量較差，后期需要較長時間緩苗，收獲的一級種薯產(chǎn)量低。通過對比試驗發(fā)現(xiàn)，采用進口泥炭與珍珠巖混合基質(zhì)（比例為2 ∶1）在可溫控的大棚內(nèi)移栽，組培苗的成活率可以大大提高，加上適宜的管理，基本可以達(dá)到95%以上。此外，組培苗收獲的一級種薯大小差異較大，大的塊莖可達(dá)200 g，和普通薯塊種植的大小差不多，小的僅有20 g左右，這種差異與組培苗質(zhì)量、組培苗成活率及后期田間管理有直接關(guān)系，同時也可以看出組培苗一級種薯的產(chǎn)量還有很大的提升空間。經(jīng)組培復(fù)壯后的種薯田間長勢優(yōu)于未組培的種薯，表現(xiàn)為植株地上部生長勢強、分枝較多、枝葉繁茂、抗病能力增強。一級種薯第2年種植產(chǎn)量與對照相比，產(chǎn)量可提高20%左右，薯皮顏色鮮黃（圖1-F），薯肉質(zhì)地更緊實。

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