間隙連接蛋白43與胎膜早破的相關(guān)性

南連玲，穆碗如，張紅，李杰，楊晨晨，湯玲，白玉芳

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）是指羊膜和絨毛膜在分娩前破裂，是產(chǎn)科最常見的早產(chǎn)原因之一，PROM 發(fā)生的危險因素包括感染、雙胎妊娠、陰道炎、環(huán)境溫度過高等[1]。PROM可導(dǎo)致新生兒呼吸窘迫綜合征、絨毛膜羊膜炎、胎盤早剝、敗血癥等，95%的妊娠婦女在破膜后4 d 內(nèi)分娩，沒有發(fā)生感染的PROM 患者潛伏期常延長，造成不可避免的早產(chǎn)并給母兒帶來嚴(yán)重危害[2-3]。間隙連接通訊是細(xì)胞間重要的信息及物質(zhì)交互形式，間隙連接蛋白43（Connexin43，Cx43）為間隙連接蛋白家族中最常見的一類蛋白，在胎膜中表達(dá)并在胎膜完整性維持中有重要作用，探討Cx43 在PROM 發(fā)生中的作用可為PROM 的預(yù)防及治療提供新思路。

1 PROM 結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

PROM 患者胎膜破口處胎膜由羊膜和絨毛膜組成，羊膜在解剖學(xué)上由一層單層立方上皮細(xì)胞組成，其厚度約為100 μm，羊膜中的單個膠原纖維的直徑約為50 nm，組織成隨機(jī)交織且無規(guī)律方向性的松散纖維束[4]。絨毛膜由絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞和分散的成纖維細(xì)胞組成，其厚度為300～500 μm。絨毛膜中膠原蛋白形成直徑為4～6 μm 的較厚的纖維束，絨毛膜柔順且可擴(kuò)展，其堅韌度及拉伸度明顯高于羊膜[5]。在胎膜結(jié)構(gòu)中，相對薄弱的羊膜在受到壓力及炎癥刺激時較絨毛膜更易發(fā)生破裂，進(jìn)而導(dǎo)致胎膜破裂[6]。故若羊膜在臨產(chǎn)前破裂，則會顯著增加PROM 的風(fēng)險，給母兒帶來嚴(yán)重危害。

羊膜上沒有血管和神經(jīng)，一旦受到損傷，很難自行愈合[7]。羊膜自胎兒側(cè)至母體側(cè)分別為羊膜上皮層、基底膜、致密層、成纖維層、纖維細(xì)胞層、中間層。羊膜上皮層細(xì)胞分泌Ⅲ、Ⅳ型膠原、糖蛋白、層黏連蛋白和纖連蛋白，它們形成與基底膜的連接。致密層由成纖維細(xì)胞層分泌的Ⅰ型和Ⅲ型膠原形成，Ⅰ型和Ⅲ型膠原與核心蛋白聚糖的結(jié)合在羊膜的機(jī)械穩(wěn)定性及促進(jìn)膠原纖維側(cè)向排列中起重要作用，該層存在間充質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，可及時修復(fù)胎膜損傷[8]。中間層形成羊膜和絨毛膜之間的連接，由Ⅲ型膠原、蛋白聚糖和糖蛋白組成，在羊膜腔不足以使絨毛膜和羊膜之間的空隙消失前發(fā)揮重要作用[9]。

2 PROM 發(fā)病機(jī)制探討

胎膜承受壓力過大時，胎膜發(fā)生超出容受范圍的延展擴(kuò)張，進(jìn)而羊膜層與絨毛膜層分離，若發(fā)生絨毛膜破裂，則拉伸彈性差的羊膜進(jìn)一步擴(kuò)張，最終導(dǎo)致羊膜破裂發(fā)生PROM[10]。若胎膜存在炎癥，則機(jī)械壓力增加時更易發(fā)生PROM[11]。已有研究表明，特定基質(zhì)蛋白降解酶以及普遍蛋白水解作用對基底膜的降解是導(dǎo)致足月或未足月PROM 的重要相關(guān)因素。膜的機(jī)械性能通常與結(jié)締組織中膠原蛋白的類型和分布有關(guān)。羊膜的機(jī)械穩(wěn)定性是由核心蛋白聚糖決定的，核心蛋白聚糖結(jié)合Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，促進(jìn)了膠原纖維的側(cè)向排列。Mogami 等[8]的研究表明，如果膠原蛋白含量或纖維交聯(lián)減少，胎膜的強(qiáng)度會降低，則可能發(fā)生PROM。核心蛋白聚糖與纖維膠原蛋白的影響因素均可能使胎膜的拉伸強(qiáng)度及穩(wěn)定性發(fā)生改變，削弱胎膜強(qiáng)度，進(jìn)而導(dǎo)致PROM 的發(fā)生。

覆蓋宮頸處的胎膜存在一個薄弱區(qū)域，表現(xiàn)出膠原重塑和凋亡增加的特征，該區(qū)域在受到壓力或創(chuàng)傷后容易發(fā)生破裂。對該薄弱區(qū)域的研究尚未見報道，若能明確該薄弱區(qū)域的形成機(jī)制，有望為預(yù)防PROM 提供有效手段。Richardson 等[12]通過多光子自發(fā)熒光和二次諧波成像（SHG）觀察到胎膜對PROM患者胎膜組織進(jìn)行組織成像，發(fā)現(xiàn)了胎膜間的微裂縫，胎膜受損時微裂縫可作為羊水泄漏的通道，機(jī)體修補(bǔ)微裂縫失敗也可被視為胎膜破裂的原因之一。尚有研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)激素水平同樣可影響胎膜強(qiáng)度，如糖皮質(zhì)激素可增加羊膜中環(huán)氧合酶2（COX-2）的表達(dá)，削弱胎膜以誘發(fā)PROM[13]。炎癥因素是導(dǎo)致PROM 的重要原因之一，Cx43 可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，影響白細(xì)胞參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)，Cx43水平下調(diào)后，局部炎癥減輕，Cx43 水平升高或可加重局部炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致PROM[14-15]。孕激素可減少Cx43 表達(dá)進(jìn)而可能預(yù)防因體內(nèi)炎癥因素引起的未足月PROM[10]。由此推測，炎癥、胎膜的自我修復(fù)能力、妊娠婦女體內(nèi)激素水平及外在的機(jī)械強(qiáng)度增加均可能導(dǎo)致PROM，進(jìn)而造成早產(chǎn)及一系列母兒并發(fā)癥。

3 Cx43 與PROM 相關(guān)性探討

PROM 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及胎膜自身結(jié)構(gòu)、妊娠婦女免疫力及妊娠婦女體內(nèi)激素水平等。隨著對胎膜的研究越來越深入，分子生物學(xué)實驗技術(shù)的應(yīng)用也發(fā)現(xiàn)了很多預(yù)測PROM 的指標(biāo)，對基質(zhì)金屬蛋白酶、間隙連接蛋白、凋亡因子等在PROM 中的研究也越來越多，Cx43 作為細(xì)胞間連接、信息及物質(zhì)交換的重要蛋白，在胎膜的微裂縫進(jìn)展及膠原緊密排列中發(fā)揮重要作用，可能導(dǎo)致或加快PROM 的發(fā)生。隨著“全面二孩”政策的實施，預(yù)防早產(chǎn)及PROM 顯得尤為重要，亟需發(fā)現(xiàn)高敏感度、高特異度的臨床檢測指標(biāo)。

3.1 Cx43 的基本結(jié)構(gòu)Cx43 是最常見的縫隙連接蛋白，長度為43 ku。Cx43 由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，在反高爾基體內(nèi)形成六聚體結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上由6 個亞單位的跨膜蛋白形成半通道結(jié)構(gòu)，其氨基端和羧基端均位于細(xì)胞內(nèi)，2 個胞外環(huán)負(fù)責(zé)與其他細(xì)胞膜上的半通道結(jié)構(gòu)進(jìn)行信息交互及物質(zhì)交換，1 個胞內(nèi)環(huán)參與細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)。Cx43 蛋白發(fā)揮各種作用的核心是由胞質(zhì)羧基端（CT）的序列和功能決定的，CT 包含多種蛋白結(jié)合位點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附功能、細(xì)胞骨架、細(xì)胞間形成半通道結(jié)構(gòu)等作用[16]。CT 的長度及構(gòu)成因間隙連接蛋白種類及功能不同而有所不同，而細(xì)胞膜上的各類間隙連接蛋白有結(jié)構(gòu)相似的同源結(jié)構(gòu)，故表達(dá)不同連接蛋白的相鄰細(xì)胞也可以形成功能通道，以保證細(xì)胞間縫隙連接通訊的正常功能[17]。

3.2 Cx43 與妊娠的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)細(xì)胞間連接通訊在細(xì)胞的增殖、分化及凋亡中均起著重要作用，最重要的成員Cx43 在人體廣泛存在[18]。Cx43 在胚胎干細(xì)胞分化、受精卵著床和隨后的胎兒發(fā)育過程中至關(guān)重要，Cx43 的表達(dá)減少可導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生[19]。Shin 等[20]在豬卵母細(xì)胞復(fù)合物的成熟過程中，受精卵、2～4 細(xì)胞期、8～16 細(xì)胞期和桑葚胚中檢測到大量的Cx43 轉(zhuǎn)錄物，并發(fā)現(xiàn)Cx43 基因敲除可顯著降低囊胚發(fā)育質(zhì)量和囊胚內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降。Cx43 在卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟過程中也有不可或缺的作用。Cx43 是卵泡發(fā)育的所有階段中在顆粒細(xì)胞中表達(dá)最豐富的縫隙連接蛋白，卵丘細(xì)胞依賴于縫隙連接為卵母細(xì)胞提供少量的營養(yǎng)物質(zhì)，以支持卵母細(xì)胞成熟[21]。Liu 等[22]發(fā)現(xiàn)體內(nèi)雌激素濃度越高，Cx43 基因和蛋白的表達(dá)水平越低，可能干擾子宮內(nèi)膜狀態(tài)，影響胚胎的正常著床。由此可見，Cx43 在妊娠發(fā)生及妊娠初期都有重要作用，目前Cx43 在產(chǎn)科領(lǐng)域研究甚少，若能發(fā)現(xiàn)Cx43 在妊娠發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制，可有望為預(yù)防妊娠期疾病及母兒并發(fā)癥提供有力手段。Cx43 是子宮平滑肌細(xì)胞的主要縫隙連接蛋白[23]。Ou 等[24]在大鼠中發(fā)現(xiàn)機(jī)械拉伸可導(dǎo)致Cx43 水平明顯增高，而孕激素的存在會阻斷這種增高現(xiàn)象，所以分娩期間子宮肌層中Cx43 表達(dá)依賴于低孕酮條件下的子宮肌層拉伸。Cx43 在宮頸中定位于子宮頸間質(zhì)和肌肉組織，Cx43在宮頸癌組織中低表達(dá)，Cx43 過表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[25]。胚胎著床前子宮內(nèi)膜中Cx43 表達(dá)下降利于胚胎著床，Cx43 表達(dá)升高可導(dǎo)致體外受精-胚胎移植的失敗[26]。

由此可見，Cx43 在胎膜、子宮肌層、子宮頸組織中均有表達(dá)，多項研究證明Cx43 表達(dá)水平受到內(nèi)分泌和機(jī)械因素相互作用的調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)，Cx43 作為細(xì)胞間間隙連接通訊的重要因子，廣泛參與妊娠的發(fā)生、妊娠進(jìn)展及婦產(chǎn)科疾病，受到體內(nèi)多種因素影響調(diào)節(jié)，在生理狀態(tài)與疾病發(fā)生中均有參與，但是其具體作用機(jī)制尚不明確，若能明確其在發(fā)病機(jī)制中的作用，可有效預(yù)防疾病發(fā)生。

3.3 Cx43 與損傷胎膜修復(fù)密切相關(guān)在PROM 發(fā)生過程中，薄弱的羊膜起著關(guān)鍵作用，若羊膜發(fā)生破裂，將會顯著增加PROM 的風(fēng)險。王艷艷等[27]通過免疫組織化學(xué)染色PV 法發(fā)現(xiàn)Cx43 主要定位于絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞層細(xì)胞，羊膜上皮細(xì)胞也有少許表達(dá)，PROM 患者胎膜中Cx43 水平相比正常產(chǎn)婦降低。Barrett 等[28]建立了受損人工胎膜模型，通過免疫熒光（IMF）共聚焦顯微鏡及SHG 技術(shù)觀察到在人工胎膜創(chuàng)傷模型培養(yǎng)168 h 后，Cx43 在胎膜成纖維細(xì)胞層表達(dá)水平顯著增加，在創(chuàng)傷邊緣的胎膜微裂縫中表達(dá)更高，并發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞與傷口前緣呈90°極化，驅(qū)動膠原蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而減慢了胎膜創(chuàng)口處的細(xì)胞遷移效率，減慢了創(chuàng)口愈合速度。Barrett等[29]發(fā)現(xiàn)靶向Cx43 可以防止應(yīng)變誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)損傷，并促進(jìn)胎膜的組織重塑機(jī)制，炎癥因素和機(jī)械因素的結(jié)合可以擾亂胎膜中由Cx43 信號介導(dǎo)的典型的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，對拉伸敏感的CX43/蛋白激酶B 信號通路可因炎癥介質(zhì)前列腺素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶的增加而激活，進(jìn)而導(dǎo)致胎膜中膠原降解，增加對促進(jìn)組織重塑有重要作用的糖胺聚糖的合成，促使胎膜組織結(jié)構(gòu)重塑而導(dǎo)致胎膜正常結(jié)構(gòu)改變。胎兒手術(shù)后絨毛膜中Cx43 的過度表達(dá)會誘導(dǎo)膠原基質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，從而可能干擾正常的愈合機(jī)制。

3.4 Cx43 與Ⅰ、Ⅲ型膠原密切相關(guān)羊膜的強(qiáng)度主要是由Ⅰ、Ⅲ型膠原決定。Cx43 模擬肽Gap27 與Cx43 細(xì)胞外環(huán)結(jié)合，影響Ⅲ型膠原表達(dá)；而TATGap19 與細(xì)胞質(zhì)環(huán)的L2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，改變其與羧基末端尾部的相互作用，影響Ⅰ型膠原表達(dá)[30]。Montgomery 等[31]在Cx43 基因局部敲除小鼠皮膚受傷后第7 天發(fā)現(xiàn)，Cx43 局部基因被敲除的小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原的基因表達(dá)顯著增加。Cogliati 等[32]也在Cx43 基因被敲除的小鼠皮膚中發(fā)現(xiàn)，Ⅰ、Ⅲ型膠原的mRNA 表達(dá)量在皮膚損傷后7 d 達(dá)到高峰，且真皮再上皮化和創(chuàng)面閉合、成纖維細(xì)胞增殖和活化、細(xì)胞外基質(zhì)重塑速度均明顯加快，可證實Cx43 能抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原水平。王寧等[18]在皮膚組織中發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)水平與Ⅰ型膠原水平呈負(fù)相關(guān)。胎兒手術(shù)后AM 中Cx43 的過度表達(dá)會誘導(dǎo)膠原基質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，從而可能干擾正常的愈合機(jī)制[33]。說明Cx43 可能通過干擾Ⅰ、Ⅲ型或更多膠原而參與PROM。目前尚無更多證據(jù)證實Cx43 在胎膜中是否對Ⅰ、Ⅲ型膠原有同樣影響，尚待進(jìn)一步研究證實。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，目前關(guān)于預(yù)測PROM 的生物學(xué)標(biāo)記物很多，但敏感度和特異度有限，尚需進(jìn)一步探究具有高敏感度、高特異度的標(biāo)記物。而Cx43 作為間隙連接蛋白家族的重要成員，對檢測胎膜間隙連接功能有明確特異性。多項研究已證實，Cx43 在胎膜完整性與重塑過程中發(fā)揮重要作用，已有學(xué)者通過顯微鏡技術(shù)觀察到胎膜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并通過免疫染色方法在胎膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Cx43 的表達(dá)，這為通過檢測妊娠婦女體內(nèi)Cx43 水平預(yù)測PROM 的提供了理論依據(jù)?；陂g隙連接通訊在細(xì)胞間連接通訊的重要作用，Cx43 或可作為PROM 的預(yù)測指標(biāo)及治療靶點(diǎn)，改善PROM 患者的母兒預(yù)后。然而目前對Cx43參與PROM 的具體機(jī)制及表達(dá)方式尚不明確，且PROM 病因尚未完全掌握，尚需進(jìn)一步深入研究。