規(guī)?；膛?chǎng)牛病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查與防控

郭啟勇，柳國(guó)鎖，黃海碧，吳心華*

(1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750000；2. 金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的一種傳染病[1-2]。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬的成員[3-4]。BVD病程復(fù)雜，臨床癥狀和亞臨床癥狀多樣，主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生產(chǎn)性能等機(jī)能破壞，并導(dǎo)致免疫抑制[5-6]。BVDV主要感染牛、綿羊、山羊、鹿等動(dòng)物，多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染。新生犢牛經(jīng)常因?yàn)楦篂a而死亡[7-8]。牛病毒性腹瀉在臨床上經(jīng)常表現(xiàn)為混合感染，由于病毒感染后，導(dǎo)致牛群排毒造成持續(xù)性感染，臨床表現(xiàn)多樣，在不同的時(shí)期感染具有不同的臨床表現(xiàn)，懷孕母牛感染BVDV可以通過(guò)胎盤(pán)傳給胎兒[9-10]。BVDV感染牧場(chǎng)之后，由于防控困難。給牧場(chǎng)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi)，世界上每年每頭牛損失50～500美元，平均大約46.5美元；歐洲的經(jīng)濟(jì)損失大概每年達(dá)到87美元[11-12]。中國(guó)目前為止沒(méi)有關(guān)于經(jīng)濟(jì)損失方面的研究和分析。BVDV 1946年在紐約州首次發(fā)現(xiàn)[13]，該病毒屬的病毒具有交叉感染性，豬的豬瘟病毒可以傳染給牛，牛的病毒性腹瀉可以傳染給豬、綿羊、山羊、駱駝、鹿、羚羊等[14-15]。

國(guó)外分為3個(gè)階段進(jìn)行逐步凈化：第一個(gè)階段，加強(qiáng)牧場(chǎng)生物安全的防范措施，對(duì)周?chē)h(huán)境做定時(shí)、定期、定量的消毒，對(duì)引進(jìn)的牛群嚴(yán)格按照OIE標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于陽(yáng)性牛立即淘汰，減少損失。做到安全隔離，禁止和牧場(chǎng)的接觸，預(yù)防出現(xiàn)持續(xù)性感染牛(PI)。第二階段有計(jì)劃有目標(biāo)的嚴(yán)格篩查PI牛，篩查之后，應(yīng)該盡快清除。第三階段，對(duì)健康牛進(jìn)行檢測(cè)?？偨Y(jié)各國(guó)經(jīng)驗(yàn)，清除PI牛是整個(gè)防控中最為嚴(yán)格和重要的一步。疫苗免疫雖然是提高牛的免疫力，但是無(wú)法阻止PI牛的出現(xiàn)和排毒。疫苗免疫有兩種形式存在，一種是篩查和淘汰，存在于奧地利、瑞士以及北歐的一些國(guó)家;另外一種就是免疫和淘汰，在養(yǎng)殖密集區(qū)域、疫病高發(fā)區(qū)域、動(dòng)物流動(dòng)率高的地區(qū)多進(jìn)行疫苗免疫。

為了解BVD在規(guī)?；膛?chǎng)中的流行情況，采用ELISA檢測(cè)對(duì)奶牛養(yǎng)殖密集區(qū)域的銀川市、中衛(wèi)市、吳忠市、石嘴山市、固原市等規(guī)模化奶牛場(chǎng)的奶牛血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)，對(duì)599份犢牛樣品采用熒光定量PCR進(jìn)行病原檢測(cè)，為規(guī)?；膛?chǎng)的防控工作提供數(shù)據(jù)參考。同時(shí)選擇一個(gè)規(guī)模化牧場(chǎng)做防控示范場(chǎng)研究，為以后本病的防控提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品

2018年9月到2019年6月，采集寧夏30個(gè)未進(jìn)行疫苗免疫牧場(chǎng)的1 500份血樣，599份腹瀉犢牛的糞便、鼻拭子、肛拭子及死亡犢牛的脾臟組織樣品。

1.2 試劑

牛病毒性腹瀉抗體檢測(cè)試劑盒和抗原快速檢測(cè)卡(美國(guó)愛(ài)德士公司)、AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)、Premix TaqTM(TaKaRa)、無(wú)酶水、無(wú)水乙醇等。

1.3 牛病毒性腹瀉的抗體檢測(cè)

嚴(yán)格按照愛(ài)德士ELISA抗體試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 病料處理

在生物安全柜內(nèi)處理。取大約5 mg的組織病料放置到2 mL帶有鋼珠的離心管中，用剪子盡可能剪碎。用組織研磨儀研磨裂解組織。加入PBS進(jìn)行稀釋?zhuān)? mL放入2 mL離心管中。編號(hào)，置于-20 ℃冰箱中。鼻拭子和肛拭子樣品在超凈工作臺(tái)中加入定量的PBS溶液，漩渦振蕩，吸取1 mL放入離心管中編號(hào)，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 病料的總DNA提取

采用TaKaRa MinBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒，提取病料組織中的總RNA。

1.4.2 熒光定量PCR

根據(jù)GenBank中登陸的BVDV的基因序列，利用DNAStar軟件MegAlign模板分析選擇Ⅰ型的5'UTR保守序列，引物由北京華大基因工程公司合成，探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物與探針

1.4.3 擴(kuò)增體系

以已獲得的DNA為模板，加入RT-PCR buffer Ⅲ 12.5 μL，ExTaqHS 0.5 μL， PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，上下游引物(20 μmol/L) 各 1.0 μL，Ⅰ型1.0 μL，模板核酸 2 μL，加無(wú)酶水補(bǔ)充至 25 μL。擴(kuò)增條件為：反轉(zhuǎn)錄 51 ℃ 15 min；94 ℃ 2 min；PCR 反應(yīng) 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。經(jīng)優(yōu)化后熒光定量PCR檢測(cè)方法的陰性對(duì)照無(wú)Ct值，BVDV陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于30，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型曲線。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)陰性、陽(yáng)性對(duì)照成立，R2>0.990，試驗(yàn)成立。(2)結(jié)果判定：若被檢樣品出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，且Ct值為10～35，則結(jié)果為陽(yáng)性；若3537，則判定為陰性。

1.5 防控方法

選擇寧夏吳忠的一個(gè)3 000頭規(guī)模未進(jìn)行疫苗免疫的血清學(xué)陽(yáng)性奶牛場(chǎng)，使用愛(ài)德士公司生產(chǎn)的BVDV抗原快速檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)。無(wú)菌采集未斷奶犢牛耳組織，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

全群BVDV抗原檢測(cè)，成年母牛使用ELISA方法檢測(cè)，犢牛使用快速檢測(cè)卡檢測(cè)。陰性?；貧w群體，陽(yáng)性牛隔離，21 d后重復(fù)送樣檢測(cè)，陰性?；貧w群體，陽(yáng)性牛淘汰。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 規(guī)?；膛?chǎng)抗體檢測(cè)

2.1.1 不同地區(qū)抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)寧夏地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)的1 500份進(jìn)行了BVD抗體的檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。共檢出1 314份陽(yáng)性血清樣品，陽(yáng)性率為87.6%。銀川市感染率最高為94.80%，固原市感染率最低為59.87%。

表2 寧夏地區(qū)不同地區(qū)血清抗體檢測(cè)陽(yáng)性率

2.1.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期牛群的BVD抗體陽(yáng)性率

根據(jù)奶牛的生長(zhǎng)時(shí)期分為犢牛(0～6月齡)、青年牛(6～18月齡)和成年母牛(18月齡以上)。不同時(shí)期血清抗體檢查陽(yáng)性率結(jié)果見(jiàn)表3。犢牛的血清抗體陽(yáng)性率為83.33%，青年牛的血清抗體陽(yáng)性率為84.08%，成母牛的血清抗體陽(yáng)性率88.98%。

表3 不同生長(zhǎng)時(shí)期血清抗體檢測(cè)陽(yáng)性率

2.2 BVD病原檢測(cè)

從寧夏回族自治區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)抽樣無(wú)菌采集599頭具有腹瀉癥狀犢牛的糞便、鼻拭子、肛拭子、脾組織樣品經(jīng)過(guò)處理后，用RT-PCR進(jìn)行BVD病原檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。顯示抗原陽(yáng)性樣品數(shù)為16份，陽(yáng)性率為2.67%，其中吳忠市的陽(yáng)性率最高為4.42%，固原市未檢出陽(yáng)性。

表4 不同地區(qū)的BVD抗原檢測(cè)結(jié)果

2.3 示范防控場(chǎng)BVD監(jiān)測(cè)

2019年8月對(duì)規(guī)模牧場(chǎng)300多頭未斷奶犢牛進(jìn)行耳組織采集檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為0.6%。PI牛的淘汰是規(guī)?；翀?chǎng)防控病毒性腹瀉最好的防護(hù)方式，相對(duì)于接種疫苗預(yù)防而言，具有減少工作時(shí)間和減少經(jīng)濟(jì)支出的優(yōu)勢(shì)。2019年9月至11月對(duì)該牧場(chǎng)腹瀉死亡的病料進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為0，說(shuō)明該牧場(chǎng)病毒性腹瀉的防控有效。

3 討論

改革開(kāi)放以來(lái)，我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)生了翻天覆地的變化，從原始的小農(nóng)戶生產(chǎn)變成了初具規(guī)模的農(nóng)牧公司生產(chǎn)。其中，奶牛養(yǎng)殖變化明顯，從以前小農(nóng)戶養(yǎng)殖變成了規(guī)?；?、集約化的公司化養(yǎng)殖。由于我國(guó)原始品種不能充分滿足消費(fèi)者的需求，因此大量從國(guó)外引種。貿(mào)易和集約化的養(yǎng)殖方式雖然提高了經(jīng)濟(jì)效益，但也加快了疾病傳播。牛病毒性腹瀉是一種以水平傳播為主的疾病，由于病毒特性，一旦在牧場(chǎng)存在便很難清除[16-18]。犢牛容易造成持續(xù)性感染，病牛初期沒(méi)有明顯的臨床癥狀，牧場(chǎng)獸醫(yī)很難通過(guò)臨床表現(xiàn)做出準(zhǔn)確的診斷。病牛持續(xù)向牧場(chǎng)排毒，造成牧場(chǎng)的永久性污染。病毒性腹瀉在牧場(chǎng)盛行，極大地降低了犢牛的成活率。BVD導(dǎo)致牛淘汰之后，牧場(chǎng)的牛不能得到及時(shí)補(bǔ)充，存欄量下降，而且本病一旦進(jìn)入牧場(chǎng)便長(zhǎng)期存在。

本次試驗(yàn)共檢測(cè)牛血清1 500份，其中血清抗體陽(yáng)性的牛有1 314頭，抗體陽(yáng)性率高達(dá)87.6%。其中犢牛抗體陽(yáng)性率為83.33%，青年?？贵w陽(yáng)性率為84.08%，成母?？贵w陽(yáng)性率88.96%。對(duì)599份犢牛樣品應(yīng)用熒光定量PCR進(jìn)行病原檢測(cè)，其中陽(yáng)性16份，陽(yáng)性率為2.67%。1999年對(duì)西北地區(qū)牛病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，寧夏地區(qū)病毒性腹瀉血清抗體陽(yáng)性55.95%[16]；2015年對(duì)寧夏地區(qū)病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，血清抗體陽(yáng)性率高達(dá)64.92%[17]；2016年對(duì)寧夏地區(qū)奶牛疑似病毒性腹瀉的牛采取了135份耳組織，進(jìn)行抗原檢測(cè)，陽(yáng)性率最高0.5%，平均0.01%[18]。說(shuō)明我國(guó)規(guī)模化牛場(chǎng)BVD感染嚴(yán)重，并且逐年呈上升趨勢(shì)，制定有效的防控措施迫在眉睫。

根據(jù)寧夏地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)BVD的流行情況來(lái)看，陽(yáng)性率普遍較高。寧夏地區(qū)養(yǎng)牛在我國(guó)發(fā)展較早，國(guó)內(nèi)外畜牧交易多，加之該地區(qū)全年干旱，對(duì)于奶牛和肉牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。未免疫牛群的血清陽(yáng)性率存在著地區(qū)性的差異，說(shuō)明牛群的生長(zhǎng)環(huán)境也是導(dǎo)致牛感染病毒性腹瀉的原因之一。本次研究結(jié)果表明，清除PI 牛有助于牧場(chǎng)從根本上預(yù)防BVD的大規(guī)模感染。進(jìn)行PI牛檢測(cè)之后，對(duì)PI陽(yáng)性犢牛的姐姐、媽媽進(jìn)行了跟蹤調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)犢牛的媽媽和姐姐抗原檢測(cè)陰性，抗體檢測(cè)陽(yáng)性，說(shuō)明犢牛的抵抗力相對(duì)較差，容易感染疾病，造成發(fā)病。關(guān)于相關(guān)傳播機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本次的研究為以后BVD的防控提供成功經(jīng)驗(yàn)，要想徹底預(yù)防本病，還需要從生物安全的方面考慮，盡量減少外來(lái)病原的侵入，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)。

綜上，從調(diào)查結(jié)果來(lái)看，規(guī)?；膛?chǎng)病毒性腹瀉的感染率普遍較高，BVDV的感染導(dǎo)致免疫力下降，進(jìn)而引發(fā)其他傳染病的發(fā)生，隨著養(yǎng)殖生產(chǎn)的不斷集中，規(guī)?；?、現(xiàn)代化牧場(chǎng)的不斷發(fā)展，疾病將會(huì)成為影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的決定因素。建立重大疾病預(yù)警體系，把疾病預(yù)防放在首位，是畜牧業(yè)發(fā)展的必然。從防控示范場(chǎng)的建設(shè)來(lái)看，清除PI牛是規(guī)?；翀?chǎng)最經(jīng)濟(jì)的做法，也是減少規(guī)?；翀?chǎng)疫病泛濫最為有效的方法。