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    規(guī)模化奶牛場牛病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查與防控

    2020-12-09 08:36:22郭啟勇柳國鎖黃海碧吳心華
    畜牧與獸醫(yī) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:血清檢測

    郭啟勇,柳國鎖,黃海碧,吳心華*

    (1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750000;2. 金宇保靈生物藥品有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

    牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的一種傳染病[1-2]。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬的成員[3-4]。BVD病程復(fù)雜,臨床癥狀和亞臨床癥狀多樣,主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生產(chǎn)性能等機能破壞,并導(dǎo)致免疫抑制[5-6]。BVDV主要感染牛、綿羊、山羊、鹿等動物,多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染。新生犢牛經(jīng)常因為腹瀉而死亡[7-8]。牛病毒性腹瀉在臨床上經(jīng)常表現(xiàn)為混合感染,由于病毒感染后,導(dǎo)致牛群排毒造成持續(xù)性感染,臨床表現(xiàn)多樣,在不同的時期感染具有不同的臨床表現(xiàn),懷孕母牛感染BVDV可以通過胎盤傳給胎兒[9-10]。BVDV感染牧場之后,由于防控困難。給牧場帶來極大的經(jīng)濟損失和資源浪費,世界上每年每頭牛損失50~500美元,平均大約46.5美元;歐洲的經(jīng)濟損失大概每年達到87美元[11-12]。中國目前為止沒有關(guān)于經(jīng)濟損失方面的研究和分析。BVDV 1946年在紐約州首次發(fā)現(xiàn)[13],該病毒屬的病毒具有交叉感染性,豬的豬瘟病毒可以傳染給牛,牛的病毒性腹瀉可以傳染給豬、綿羊、山羊、駱駝、鹿、羚羊等[14-15]。

    國外分為3個階段進行逐步凈化:第一個階段,加強牧場生物安全的防范措施,對周圍環(huán)境做定時、定期、定量的消毒,對引進的牛群嚴(yán)格按照OIE標(biāo)準(zhǔn)進行檢測,對于陽性牛立即淘汰,減少損失。做到安全隔離,禁止和牧場的接觸,預(yù)防出現(xiàn)持續(xù)性感染牛(PI)。第二階段有計劃有目標(biāo)的嚴(yán)格篩查PI牛,篩查之后,應(yīng)該盡快清除。第三階段,對健康牛進行檢測??偨Y(jié)各國經(jīng)驗,清除PI牛是整個防控中最為嚴(yán)格和重要的一步。疫苗免疫雖然是提高牛的免疫力,但是無法阻止PI牛的出現(xiàn)和排毒。疫苗免疫有兩種形式存在,一種是篩查和淘汰,存在于奧地利、瑞士以及北歐的一些國家;另外一種就是免疫和淘汰,在養(yǎng)殖密集區(qū)域、疫病高發(fā)區(qū)域、動物流動率高的地區(qū)多進行疫苗免疫。

    為了解BVD在規(guī)?;膛鲋械牧餍星闆r,采用ELISA檢測對奶牛養(yǎng)殖密集區(qū)域的銀川市、中衛(wèi)市、吳忠市、石嘴山市、固原市等規(guī)?;膛龅哪膛Q鍢悠愤M行抗體檢測,對599份犢牛樣品采用熒光定量PCR進行病原檢測,為規(guī)?;膛龅姆揽毓ぷ魈峁?shù)據(jù)參考。同時選擇一個規(guī)?;翀鲎龇揽厥痉秷鲅芯?,為以后本病的防控提供實踐經(jīng)驗。

    1 材料與方法

    1.1 樣品

    2018年9月到2019年6月,采集寧夏30個未進行疫苗免疫牧場的1 500份血樣,599份腹瀉犢牛的糞便、鼻拭子、肛拭子及死亡犢牛的脾臟組織樣品。

    1.2 試劑

    牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒和抗原快速檢測卡(美國愛德士公司)、AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)、Premix TaqTM(TaKaRa)、無酶水、無水乙醇等。

    1.3 牛病毒性腹瀉的抗體檢測

    嚴(yán)格按照愛德士ELISA抗體試劑盒說明書進行操作。

    1.4 病料處理

    在生物安全柜內(nèi)處理。取大約5 mg的組織病料放置到2 mL帶有鋼珠的離心管中,用剪子盡可能剪碎。用組織研磨儀研磨裂解組織。加入PBS進行稀釋,取1 mL放入2 mL離心管中。編號,置于-20 ℃冰箱中。鼻拭子和肛拭子樣品在超凈工作臺中加入定量的PBS溶液,漩渦振蕩,吸取1 mL放入離心管中編號,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.1 病料的總DNA提取

    采用TaKaRa MinBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒,提取病料組織中的總RNA。

    1.4.2 熒光定量PCR

    根據(jù)GenBank中登陸的BVDV的基因序列,利用DNAStar軟件MegAlign模板分析選擇Ⅰ型的5'UTR保守序列,引物由北京華大基因工程公司合成,探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

    表1 熒光定量PCR引物與探針

    1.4.3 擴增體系

    以已獲得的DNA為模板,加入RT-PCR buffer Ⅲ 12.5 μL,ExTaqHS 0.5 μL, PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL,上下游引物(20 μmol/L) 各 1.0 μL,Ⅰ型1.0 μL,模板核酸 2 μL,加無酶水補充至 25 μL。擴增條件為:反轉(zhuǎn)錄 51 ℃ 15 min;94 ℃ 2 min;PCR 反應(yīng) 94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,45個循環(huán)。經(jīng)優(yōu)化后熒光定量PCR檢測方法的陰性對照無Ct值,BVDV陽性對照Ct值小于30,擴增曲線呈現(xiàn)典型的S型曲線。

    結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):(1)陰性、陽性對照成立,R2>0.990,試驗成立。(2)結(jié)果判定:若被檢樣品出現(xiàn)S型擴增曲線,且Ct值為10~35,則結(jié)果為陽性;若3537,則判定為陰性。

    1.5 防控方法

    選擇寧夏吳忠的一個3 000頭規(guī)模未進行疫苗免疫的血清學(xué)陽性奶牛場,使用愛德士公司生產(chǎn)的BVDV抗原快速檢測卡進行檢測。無菌采集未斷奶犢牛耳組織,根據(jù)產(chǎn)品說明書進行操作。

    全群BVDV抗原檢測,成年母牛使用ELISA方法檢測,犢牛使用快速檢測卡檢測。陰性?;貧w群體,陽性牛隔離,21 d后重復(fù)送樣檢測,陰性?;貧w群體,陽性牛淘汰。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019進行統(tǒng)計。

    2 結(jié)果

    2.1 規(guī)?;膛隹贵w檢測

    2.1.1 不同地區(qū)抗體檢測結(jié)果

    對寧夏地區(qū)規(guī)?;膛龅? 500份進行了BVD抗體的檢測,結(jié)果見表2。共檢出1 314份陽性血清樣品,陽性率為87.6%。銀川市感染率最高為94.80%,固原市感染率最低為59.87%。

    表2 寧夏地區(qū)不同地區(qū)血清抗體檢測陽性率

    2.1.2 不同生長時期牛群的BVD抗體陽性率

    根據(jù)奶牛的生長時期分為犢牛(0~6月齡)、青年牛(6~18月齡)和成年母牛(18月齡以上)。不同時期血清抗體檢查陽性率結(jié)果見表3。犢牛的血清抗體陽性率為83.33%,青年牛的血清抗體陽性率為84.08%,成母牛的血清抗體陽性率88.98%。

    表3 不同生長時期血清抗體檢測陽性率

    2.2 BVD病原檢測

    從寧夏回族自治區(qū)規(guī)?;膛龀闃訜o菌采集599頭具有腹瀉癥狀犢牛的糞便、鼻拭子、肛拭子、脾組織樣品經(jīng)過處理后,用RT-PCR進行BVD病原檢測,結(jié)果見表4。顯示抗原陽性樣品數(shù)為16份,陽性率為2.67%,其中吳忠市的陽性率最高為4.42%,固原市未檢出陽性。

    表4 不同地區(qū)的BVD抗原檢測結(jié)果

    2.3 示范防控場BVD監(jiān)測

    2019年8月對規(guī)模牧場300多頭未斷奶犢牛進行耳組織采集檢測,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性率為0.6%。PI牛的淘汰是規(guī)模化牧場防控病毒性腹瀉最好的防護方式,相對于接種疫苗預(yù)防而言,具有減少工作時間和減少經(jīng)濟支出的優(yōu)勢。2019年9月至11月對該牧場腹瀉死亡的病料進行熒光定量PCR檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性率為0,說明該牧場病毒性腹瀉的防控有效。

    3 討論

    改革開放以來,我國的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)生了翻天覆地的變化,從原始的小農(nóng)戶生產(chǎn)變成了初具規(guī)模的農(nóng)牧公司生產(chǎn)。其中,奶牛養(yǎng)殖變化明顯,從以前小農(nóng)戶養(yǎng)殖變成了規(guī)?;?、集約化的公司化養(yǎng)殖。由于我國原始品種不能充分滿足消費者的需求,因此大量從國外引種。貿(mào)易和集約化的養(yǎng)殖方式雖然提高了經(jīng)濟效益,但也加快了疾病傳播。牛病毒性腹瀉是一種以水平傳播為主的疾病,由于病毒特性,一旦在牧場存在便很難清除[16-18]。犢牛容易造成持續(xù)性感染,病牛初期沒有明顯的臨床癥狀,牧場獸醫(yī)很難通過臨床表現(xiàn)做出準(zhǔn)確的診斷。病牛持續(xù)向牧場排毒,造成牧場的永久性污染。病毒性腹瀉在牧場盛行,極大地降低了犢牛的成活率。BVD導(dǎo)致牛淘汰之后,牧場的牛不能得到及時補充,存欄量下降,而且本病一旦進入牧場便長期存在。

    本次試驗共檢測牛血清1 500份,其中血清抗體陽性的牛有1 314頭,抗體陽性率高達87.6%。其中犢牛抗體陽性率為83.33%,青年牛抗體陽性率為84.08%,成母牛抗體陽性率88.96%。對599份犢牛樣品應(yīng)用熒光定量PCR進行病原檢測,其中陽性16份,陽性率為2.67%。1999年對西北地區(qū)牛病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,寧夏地區(qū)病毒性腹瀉血清抗體陽性55.95%[16];2015年對寧夏地區(qū)病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),血清抗體陽性率高達64.92%[17];2016年對寧夏地區(qū)奶牛疑似病毒性腹瀉的牛采取了135份耳組織,進行抗原檢測,陽性率最高0.5%,平均0.01%[18]。說明我國規(guī)模化牛場BVD感染嚴(yán)重,并且逐年呈上升趨勢,制定有效的防控措施迫在眉睫。

    根據(jù)寧夏地區(qū)規(guī)?;膛鯞VD的流行情況來看,陽性率普遍較高。寧夏地區(qū)養(yǎng)牛在我國發(fā)展較早,國內(nèi)外畜牧交易多,加之該地區(qū)全年干旱,對于奶牛和肉牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著得天獨厚的優(yōu)勢。未免疫牛群的血清陽性率存在著地區(qū)性的差異,說明牛群的生長環(huán)境也是導(dǎo)致牛感染病毒性腹瀉的原因之一。本次研究結(jié)果表明,清除PI 牛有助于牧場從根本上預(yù)防BVD的大規(guī)模感染。進行PI牛檢測之后,對PI陽性犢牛的姐姐、媽媽進行了跟蹤調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)犢牛的媽媽和姐姐抗原檢測陰性,抗體檢測陽性,說明犢牛的抵抗力相對較差,容易感染疾病,造成發(fā)病。關(guān)于相關(guān)傳播機制還需要進一步研究。本次的研究為以后BVD的防控提供成功經(jīng)驗,要想徹底預(yù)防本病,還需要從生物安全的方面考慮,盡量減少外來病原的侵入,堅持自繁自養(yǎng)。

    綜上,從調(diào)查結(jié)果來看,規(guī)?;膛霾《拘愿篂a的感染率普遍較高,BVDV的感染導(dǎo)致免疫力下降,進而引發(fā)其他傳染病的發(fā)生,隨著養(yǎng)殖生產(chǎn)的不斷集中,規(guī)?;F(xiàn)代化牧場的不斷發(fā)展,疾病將會成為影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的決定因素。建立重大疾病預(yù)警體系,把疾病預(yù)防放在首位,是畜牧業(yè)發(fā)展的必然。從防控示范場的建設(shè)來看,清除PI牛是規(guī)模化牧場最經(jīng)濟的做法,也是減少規(guī)?;翀鲆卟》簽E最為有效的方法。

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