郭啟勇,柳國(guó)鎖,黃海碧,吳心華*
(1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750000;2. 金宇保靈生物藥品有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)
牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的一種傳染病[1-2]。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬的成員[3-4]。BVD病程復(fù)雜,臨床癥狀和亞臨床癥狀多樣,主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生產(chǎn)性能等機(jī)能破壞,并導(dǎo)致免疫抑制[5-6]。BVDV主要感染牛、綿羊、山羊、鹿等動(dòng)物,多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染。新生犢牛經(jīng)常因?yàn)楦篂a而死亡[7-8]。牛病毒性腹瀉在臨床上經(jīng)常表現(xiàn)為混合感染,由于病毒感染后,導(dǎo)致牛群排毒造成持續(xù)性感染,臨床表現(xiàn)多樣,在不同的時(shí)期感染具有不同的臨床表現(xiàn),懷孕母牛感染BVDV可以通過(guò)胎盤(pán)傳給胎兒[9-10]。BVDV感染牧場(chǎng)之后,由于防控困難。給牧場(chǎng)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi),世界上每年每頭牛損失50~500美元,平均大約46.5美元;歐洲的經(jīng)濟(jì)損失大概每年達(dá)到87美元[11-12]。中國(guó)目前為止沒(méi)有關(guān)于經(jīng)濟(jì)損失方面的研究和分析。BVDV 1946年在紐約州首次發(fā)現(xiàn)[13],該病毒屬的病毒具有交叉感染性,豬的豬瘟病毒可以傳染給牛,牛的病毒性腹瀉可以傳染給豬、綿羊、山羊、駱駝、鹿、羚羊等[14-15]。
國(guó)外分為3個(gè)階段進(jìn)行逐步凈化:第一個(gè)階段,加強(qiáng)牧場(chǎng)生物安全的防范措施,對(duì)周?chē)h(huán)境做定時(shí)、定期、定量的消毒,對(duì)引進(jìn)的牛群嚴(yán)格按照OIE標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè),對(duì)于陽(yáng)性牛立即淘汰,減少損失。做到安全隔離,禁止和牧場(chǎng)的接觸,預(yù)防出現(xiàn)持續(xù)性感染牛(PI)。第二階段有計(jì)劃有目標(biāo)的嚴(yán)格篩查PI牛,篩查之后,應(yīng)該盡快清除。第三階段,對(duì)健康牛進(jìn)行檢測(cè)??偨Y(jié)各國(guó)經(jīng)驗(yàn),清除PI牛是整個(gè)防控中最為嚴(yán)格和重要的一步。疫苗免疫雖然是提高牛的免疫力,但是無(wú)法阻止PI牛的出現(xiàn)和排毒。疫苗免疫有兩種形式存在,一種是篩查和淘汰,存在于奧地利、瑞士以及北歐的一些國(guó)家;另外一種就是免疫和淘汰,在養(yǎng)殖密集區(qū)域、疫病高發(fā)區(qū)域、動(dòng)物流動(dòng)率高的地區(qū)多進(jìn)行疫苗免疫。
為了解BVD在規(guī)?;膛?chǎng)中的流行情況,采用ELISA檢測(cè)對(duì)奶牛養(yǎng)殖密集區(qū)域的銀川市、中衛(wèi)市、吳忠市、石嘴山市、固原市等規(guī)模化奶牛場(chǎng)的奶牛血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè),對(duì)599份犢牛樣品采用熒光定量PCR進(jìn)行病原檢測(cè),為規(guī)?;膛?chǎng)的防控工作提供數(shù)據(jù)參考。同時(shí)選擇一個(gè)規(guī)模化牧場(chǎng)做防控示范場(chǎng)研究,為以后本病的防控提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。
2018年9月到2019年6月,采集寧夏30個(gè)未進(jìn)行疫苗免疫牧場(chǎng)的1 500份血樣,599份腹瀉犢牛的糞便、鼻拭子、肛拭子及死亡犢牛的脾臟組織樣品。
牛病毒性腹瀉抗體檢測(cè)試劑盒和抗原快速檢測(cè)卡(美國(guó)愛(ài)德士公司)、AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)、Premix TaqTM(TaKaRa)、無(wú)酶水、無(wú)水乙醇等。
嚴(yán)格按照愛(ài)德士ELISA抗體試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
在生物安全柜內(nèi)處理。取大約5 mg的組織病料放置到2 mL帶有鋼珠的離心管中,用剪子盡可能剪碎。用組織研磨儀研磨裂解組織。加入PBS進(jìn)行稀釋?zhuān)? mL放入2 mL離心管中。編號(hào),置于-20 ℃冰箱中。鼻拭子和肛拭子樣品在超凈工作臺(tái)中加入定量的PBS溶液,漩渦振蕩,吸取1 mL放入離心管中編號(hào),置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.1 病料的總DNA提取
采用TaKaRa MinBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒,提取病料組織中的總RNA。
1.4.2 熒光定量PCR
根據(jù)GenBank中登陸的BVDV的基因序列,利用DNAStar軟件MegAlign模板分析選擇Ⅰ型的5'UTR保守序列,引物由北京華大基因工程公司合成,探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。
表1 熒光定量PCR引物與探針
1.4.3 擴(kuò)增體系
以已獲得的DNA為模板,加入RT-PCR buffer Ⅲ 12.5 μL,ExTaqHS 0.5 μL, PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL,上下游引物(20 μmol/L) 各 1.0 μL,Ⅰ型1.0 μL,模板核酸 2 μL,加無(wú)酶水補(bǔ)充至 25 μL。擴(kuò)增條件為:反轉(zhuǎn)錄 51 ℃ 15 min;94 ℃ 2 min;PCR 反應(yīng) 94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。經(jīng)優(yōu)化后熒光定量PCR檢測(cè)方法的陰性對(duì)照無(wú)Ct值,BVDV陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于30,擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型曲線。
結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):(1)陰性、陽(yáng)性對(duì)照成立,R2>0.990,試驗(yàn)成立。(2)結(jié)果判定:若被檢樣品出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線,且Ct值為10~35,則結(jié)果為陽(yáng)性;若35
選擇寧夏吳忠的一個(gè)3 000頭規(guī)模未進(jìn)行疫苗免疫的血清學(xué)陽(yáng)性奶牛場(chǎng),使用愛(ài)德士公司生產(chǎn)的BVDV抗原快速檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)。無(wú)菌采集未斷奶犢牛耳組織,根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
全群BVDV抗原檢測(cè),成年母牛使用ELISA方法檢測(cè),犢牛使用快速檢測(cè)卡檢測(cè)。陰性?;貧w群體,陽(yáng)性牛隔離,21 d后重復(fù)送樣檢測(cè),陰性?;貧w群體,陽(yáng)性牛淘汰。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
2.1.1 不同地區(qū)抗體檢測(cè)結(jié)果
對(duì)寧夏地區(qū)規(guī)?;膛?chǎng)的1 500份進(jìn)行了BVD抗體的檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表2。共檢出1 314份陽(yáng)性血清樣品,陽(yáng)性率為87.6%。銀川市感染率最高為94.80%,固原市感染率最低為59.87%。
表2 寧夏地區(qū)不同地區(qū)血清抗體檢測(cè)陽(yáng)性率
2.1.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期牛群的BVD抗體陽(yáng)性率
根據(jù)奶牛的生長(zhǎng)時(shí)期分為犢牛(0~6月齡)、青年牛(6~18月齡)和成年母牛(18月齡以上)。不同時(shí)期血清抗體檢查陽(yáng)性率結(jié)果見(jiàn)表3。犢牛的血清抗體陽(yáng)性率為83.33%,青年牛的血清抗體陽(yáng)性率為84.08%,成母牛的血清抗體陽(yáng)性率88.98%。
表3 不同生長(zhǎng)時(shí)期血清抗體檢測(cè)陽(yáng)性率
從寧夏回族自治區(qū)規(guī)?;膛?chǎng)抽樣無(wú)菌采集599頭具有腹瀉癥狀犢牛的糞便、鼻拭子、肛拭子、脾組織樣品經(jīng)過(guò)處理后,用RT-PCR進(jìn)行BVD病原檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表4。顯示抗原陽(yáng)性樣品數(shù)為16份,陽(yáng)性率為2.67%,其中吳忠市的陽(yáng)性率最高為4.42%,固原市未檢出陽(yáng)性。
表4 不同地區(qū)的BVD抗原檢測(cè)結(jié)果
2019年8月對(duì)規(guī)模牧場(chǎng)300多頭未斷奶犢牛進(jìn)行耳組織采集檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為0.6%。PI牛的淘汰是規(guī)?;翀?chǎng)防控病毒性腹瀉最好的防護(hù)方式,相對(duì)于接種疫苗預(yù)防而言,具有減少工作時(shí)間和減少經(jīng)濟(jì)支出的優(yōu)勢(shì)。2019年9月至11月對(duì)該牧場(chǎng)腹瀉死亡的病料進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為0,說(shuō)明該牧場(chǎng)病毒性腹瀉的防控有效。
改革開(kāi)放以來(lái),我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)生了翻天覆地的變化,從原始的小農(nóng)戶生產(chǎn)變成了初具規(guī)模的農(nóng)牧公司生產(chǎn)。其中,奶牛養(yǎng)殖變化明顯,從以前小農(nóng)戶養(yǎng)殖變成了規(guī)?;?、集約化的公司化養(yǎng)殖。由于我國(guó)原始品種不能充分滿足消費(fèi)者的需求,因此大量從國(guó)外引種。貿(mào)易和集約化的養(yǎng)殖方式雖然提高了經(jīng)濟(jì)效益,但也加快了疾病傳播。牛病毒性腹瀉是一種以水平傳播為主的疾病,由于病毒特性,一旦在牧場(chǎng)存在便很難清除[16-18]。犢牛容易造成持續(xù)性感染,病牛初期沒(méi)有明顯的臨床癥狀,牧場(chǎng)獸醫(yī)很難通過(guò)臨床表現(xiàn)做出準(zhǔn)確的診斷。病牛持續(xù)向牧場(chǎng)排毒,造成牧場(chǎng)的永久性污染。病毒性腹瀉在牧場(chǎng)盛行,極大地降低了犢牛的成活率。BVD導(dǎo)致牛淘汰之后,牧場(chǎng)的牛不能得到及時(shí)補(bǔ)充,存欄量下降,而且本病一旦進(jìn)入牧場(chǎng)便長(zhǎng)期存在。
本次試驗(yàn)共檢測(cè)牛血清1 500份,其中血清抗體陽(yáng)性的牛有1 314頭,抗體陽(yáng)性率高達(dá)87.6%。其中犢牛抗體陽(yáng)性率為83.33%,青年??贵w陽(yáng)性率為84.08%,成母??贵w陽(yáng)性率88.96%。對(duì)599份犢牛樣品應(yīng)用熒光定量PCR進(jìn)行病原檢測(cè),其中陽(yáng)性16份,陽(yáng)性率為2.67%。1999年對(duì)西北地區(qū)牛病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,寧夏地區(qū)病毒性腹瀉血清抗體陽(yáng)性55.95%[16];2015年對(duì)寧夏地區(qū)病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),血清抗體陽(yáng)性率高達(dá)64.92%[17];2016年對(duì)寧夏地區(qū)奶牛疑似病毒性腹瀉的牛采取了135份耳組織,進(jìn)行抗原檢測(cè),陽(yáng)性率最高0.5%,平均0.01%[18]。說(shuō)明我國(guó)規(guī)模化牛場(chǎng)BVD感染嚴(yán)重,并且逐年呈上升趨勢(shì),制定有效的防控措施迫在眉睫。
根據(jù)寧夏地區(qū)規(guī)?;膛?chǎng)BVD的流行情況來(lái)看,陽(yáng)性率普遍較高。寧夏地區(qū)養(yǎng)牛在我國(guó)發(fā)展較早,國(guó)內(nèi)外畜牧交易多,加之該地區(qū)全年干旱,對(duì)于奶牛和肉牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。未免疫牛群的血清陽(yáng)性率存在著地區(qū)性的差異,說(shuō)明牛群的生長(zhǎng)環(huán)境也是導(dǎo)致牛感染病毒性腹瀉的原因之一。本次研究結(jié)果表明,清除PI 牛有助于牧場(chǎng)從根本上預(yù)防BVD的大規(guī)模感染。進(jìn)行PI牛檢測(cè)之后,對(duì)PI陽(yáng)性犢牛的姐姐、媽媽進(jìn)行了跟蹤調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)犢牛的媽媽和姐姐抗原檢測(cè)陰性,抗體檢測(cè)陽(yáng)性,說(shuō)明犢牛的抵抗力相對(duì)較差,容易感染疾病,造成發(fā)病。關(guān)于相關(guān)傳播機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本次的研究為以后BVD的防控提供成功經(jīng)驗(yàn),要想徹底預(yù)防本病,還需要從生物安全的方面考慮,盡量減少外來(lái)病原的侵入,堅(jiān)持自繁自養(yǎng)。
綜上,從調(diào)查結(jié)果來(lái)看,規(guī)?;膛?chǎng)病毒性腹瀉的感染率普遍較高,BVDV的感染導(dǎo)致免疫力下降,進(jìn)而引發(fā)其他傳染病的發(fā)生,隨著養(yǎng)殖生產(chǎn)的不斷集中,規(guī)?;?、現(xiàn)代化牧場(chǎng)的不斷發(fā)展,疾病將會(huì)成為影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的決定因素。建立重大疾病預(yù)警體系,把疾病預(yù)防放在首位,是畜牧業(yè)發(fā)展的必然。從防控示范場(chǎng)的建設(shè)來(lái)看,清除PI牛是規(guī)?;翀?chǎng)最經(jīng)濟(jì)的做法,也是減少規(guī)?;翀?chǎng)疫病泛濫最為有效的方法。