兩種驅(qū)蟲(chóng)方式對(duì)阿勒泰羊繁殖母羊體內(nèi)外寄生蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)效果及驅(qū)蟲(chóng)后對(duì)腸道菌群的影響

鐘池，李鑫，舒展，陳卓，馮雷喜、馬義誠(chéng)，趙紅瓊，郝智慧，姚剛*

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾控中心，新疆 阿勒泰 836500；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100000)

家畜寄生蟲(chóng)病是危害畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要疾病。家畜寄生蟲(chóng)病在防治上主要采用藥浴、投喂驅(qū)蟲(chóng)藥、體表澆潑、注射等方式驅(qū)除體內(nèi)外寄生蟲(chóng)[1]。伊維菌素是一種廣譜、高效、低毒的抗寄生蟲(chóng)藥物，對(duì)體內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)和體外節(jié)肢動(dòng)物均有驅(qū)蟲(chóng)活性，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出多種獸醫(yī)臨床使用的制劑產(chǎn)品如注射劑、澆潑劑等，并廣泛用于防治多種動(dòng)物的線(xiàn)蟲(chóng)病和節(jié)肢動(dòng)物寄生蟲(chóng)病[2-3]。

人類(lèi)和動(dòng)物機(jī)體的腸道菌群(gut microbiota)與其宿主的健康關(guān)系密切，腸道菌群通過(guò)影響宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、生理功能、免疫和行為等來(lái)改變宿主的健康[4]。已有研究報(bào)道證明，寄生蟲(chóng)等環(huán)境因素可影響宿主的腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)，反之亦然[5]。Knutie[6]對(duì)寄生飛絨蠅(Philornisdownsi)的加拉帕戈斯嘲鶇(Galapagosmockingbirds)和達(dá)爾文雀(Darwin’sfinches)雛鳥(niǎo)腸道菌群組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)飛絨蠅的寄生降低了加拉帕戈斯嘲鶇雛鳥(niǎo)的腸道菌群的生境內(nèi)多樣性。給新生工蜂感染Lotmariapassim原蟲(chóng)后導(dǎo)致其腸道核心菌群組成發(fā)育不全[7]。Gilchrist等[8]研究發(fā)現(xiàn)，人體溶組織菌阿米巴(Entamoebiasishistolytica)感染后，腹瀉癥狀的發(fā)生與寄生蟲(chóng)侵害加重和糞普氏菌(Prevotellacopri)的增加有關(guān)[8]。被線(xiàn)蟲(chóng)感染的兔和被鞭蟲(chóng)感染的小鼠，在感染急性期的腸道菌群 Alpha 多樣性顯著減少[9-11]。在靈長(zhǎng)動(dòng)物中，腸道寄生蟲(chóng)(線(xiàn)蟲(chóng)和美洲鉤蟲(chóng))的自然或?qū)嶒?yàn)性感染使腸道菌群的 Alpha 多樣性普遍增加[12-14]。但郭歆巖[15]研究表明，腸道菌群的 Alpha 多樣性在寄生蟲(chóng)感染后沒(méi)有改變。因此，腸道內(nèi)寄生蟲(chóng)和與之共生的龐大腸道菌群可能有著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，值得深入研究。對(duì)不同驅(qū)蟲(chóng)劑型作用下，腸道菌群結(jié)構(gòu)是否會(huì)發(fā)生改變尚未有明確報(bào)道。本試驗(yàn)采用伊維菌素澆潑劑和注射劑作為驅(qū)蟲(chóng)藥，使用澆潑和注射兩種驅(qū)蟲(chóng)方式對(duì)綿羊進(jìn)行的驅(qū)蟲(chóng)效果試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)兩種驅(qū)蟲(chóng)方式作用下的腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究，探索兩種伊維菌素劑型是否會(huì)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)有影響，也籍此對(duì)兩種伊維菌素驅(qū)蟲(chóng)劑的安全性提供胃腸功能方面的間接支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

取自阿勒泰地區(qū)某肉羊養(yǎng)殖合作社放牧加補(bǔ)飼的健康母羊75只，年齡為4～5歲，體重為(50.96±7.27)kg。

1.2 藥品與試劑

0.5%伊維菌素澆潑劑，1 mL含伊維菌素5 mg，每瓶 200 mL裝，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。主要成分為伊維菌素，藥物批號(hào)為20191216。

1%伊維菌素注射劑，1 mL含伊維菌素10 mg，每瓶200 mL裝，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供，藥物批號(hào)為20191220。

糞便DNA提取試劑盒(Stool Genomic DNA Kit，50 preps)，貨號(hào)CW2092，生產(chǎn)日期為2018年9月，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組處理

通過(guò)篩選的阿勒泰大尾羊75只，隨機(jī)分為3組，注射驅(qū)蟲(chóng)組、澆潑驅(qū)蟲(chóng)組和不驅(qū)蟲(chóng)對(duì)照組，每組25只。不驅(qū)蟲(chóng)對(duì)照組(Ctr)不進(jìn)行用藥；注射驅(qū)蟲(chóng)組(Inj)劑量按 0.02 mL/kg，皮下一次注射給藥；澆潑驅(qū)蟲(chóng)組(Spi)劑量按 0.1 mL/kg，羊背部澆潑一次給藥。分別于用藥前(第0天)和用藥后(第21天)觀察檢查體表寄生蟲(chóng)，測(cè)定羊體溫、呼吸、脈搏等生命體征，并采集糞便。糞便采集2份，分別用于觀察體內(nèi)蟲(chóng)卵(低溫保存)和高通量測(cè)序(采集的糞便液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生理指標(biāo)測(cè)定

體溫測(cè)定：采用電子數(shù)字溫度計(jì)將溫度計(jì)置于羊后肢股內(nèi)側(cè)并讀數(shù)，或者獸用紅外測(cè)溫儀測(cè)量，獸用紅外線(xiàn)測(cè)溫儀測(cè)定羊的體溫3～5 s，測(cè)3次取平均值；

呼吸測(cè)定：通過(guò)觀察羊胸腹部的起伏動(dòng)作測(cè)定，秒表記錄每分鐘呼吸次數(shù)；

脈搏測(cè)定：通過(guò)觸壓后肢股內(nèi)側(cè)部股動(dòng)脈，秒表記錄每分鐘脈次數(shù)。

呼吸、脈搏秒表計(jì)數(shù)15 s，測(cè)定3次，取平均值，算出每分鐘呼吸、脈搏數(shù)。

1.4.2 體表寄生蟲(chóng)檢查

疥螨、癢螨和蜱蟲(chóng)的采樣方法參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行采集，檢查方法參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。虱子的采樣和檢查鑒定方法參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

1.4.3 體內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)卵檢查

采用麥克馬斯特氏法進(jìn)行蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)。按照楊希菊[19]的方法制備飽和鹽水 (100 mL水加食鹽 35～40 g) 1 L于錐形瓶中，從糞便不同的部位挑起 2 g的糞便塊，加入飽和鹽水 58 mL，將糞便充分震蕩搗碎，與鹽水?dāng)噭?，使成均勻糞液[19]。用吸管吸取糞汁注入麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)室中，靜置 1～2 min，然后再鏡下計(jì)數(shù) 1 cm2方格內(nèi)的蟲(chóng)卵總數(shù)，求出兩個(gè)刻度室中的蟲(chóng)卵平均數(shù)，乘以200即為每克糞便蟲(chóng)卵數(shù)(EPG)。

1.4.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便樣品中DNA，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)[20]等所述方法進(jìn)行。

采用16S rDNA序列擴(kuò)增、測(cè)序、分析。測(cè)序分析由深圳微生太科技有限公司完成。按照流程操作準(zhǔn)備樣品，提取糞便DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以能夠反映菌群組成和多樣性的目標(biāo)序列為靶點(diǎn)，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，并在添加測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣本的標(biāo)簽序列(Barcode)，進(jìn)而對(duì)rRNA基因可變區(qū)(單個(gè)或連續(xù)的多個(gè))或特定基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)。最后上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序，由于MiSeq測(cè)序讀長(zhǎng)較短的特性，同時(shí)也為了保證測(cè)序質(zhì)量，設(shè)定目標(biāo)片段的測(cè)序長(zhǎng)度為 200～450 bp。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)腸道菌群物種操作分類(lèi)單元(Operational taxonomic unit，OTU)進(jìn)行豐度、維恩(Venn)圖、Alpha多樣性、Beta多樣性等分析。所測(cè)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件GraphPad Prism 8.0.1進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)外驅(qū)蟲(chóng)情況

在驅(qū)蟲(chóng)第0天和驅(qū)蟲(chóng)第21天，對(duì)各試驗(yàn)組羊體表寄生蟲(chóng)和體內(nèi)蟲(chóng)卵統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，經(jīng)注射、澆潑方式驅(qū)蟲(chóng)后對(duì)體內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)卵、體外寄生蟲(chóng)總數(shù)較驅(qū)蟲(chóng)前具有極顯著差異(P<0.01)，驅(qū)蟲(chóng)效果明顯(表1)。

表1 各試驗(yàn)組羊在使用藥物前后體外寄生蟲(chóng)總數(shù)和體內(nèi)蟲(chóng)卵情況統(tǒng)計(jì)

2.2 生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)各試驗(yàn)組羊的體溫、呼吸和脈博次數(shù)測(cè)定結(jié)果如表2所示。2個(gè)驅(qū)蟲(chóng)組與對(duì)照組間體溫、呼吸和脈搏數(shù)值均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 各試驗(yàn)組羊生命體征測(cè)定結(jié)果

2.3 腸道菌群測(cè)定結(jié)果

2.3.1 腸道微生物物種組成分析

2.3.1.1 腸道菌群OTU組成Venn分析

基于腸道菌群物種操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit, OTU)進(jìn)行Venn法初步分析，結(jié)果如圖1所示。Ctr、Inj和Spi 3組共有的OTU為42個(gè)，Ctr組特有OTU為517個(gè)，Inj組特有OTU為561個(gè)，Spi組特有OTU為655個(gè)(圖1)。

圖1 各組羊腸道微生物共有OTUs的數(shù)量Venn圖

2.3.1.2 差異物種Lefse分析

根據(jù)差異物種Lefse分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)梭菌科(Clostridiaceae)和梭菌屬(Clostridium)為Ctr組綿羊腸道菌群的差異表達(dá)特征菌屬。Ctr組中該菌屬平均相對(duì)豐度為0.01%，而經(jīng)Inj和Spi方法驅(qū)蟲(chóng)處理后，腸道菌群中沒(méi)有檢測(cè)到梭菌科(Clostridiaceae)和梭菌屬(Clostridium)的菌屬存在(圖2)。LDA值分布柱狀圖(顯著差異物種影響程度)顯示出梭菌科、梭菌屬為Ctr組的差異物種。

圖2 LEfSe分析進(jìn)化分支圖和差異物種影響

2.3.1.3 門(mén)和屬水平菌群豐度及物種組成

在3個(gè)試驗(yàn)組羊的腸道菌群門(mén)水平上，共檢出15個(gè)菌門(mén)，如圖3A所示。相對(duì)豐度大于等于0.1% 的菌門(mén)有8個(gè)，這8個(gè)門(mén)水平的細(xì)菌是這3個(gè)組羊中的核心菌群。相對(duì)豐度大于等于10% 的菌門(mén)有2個(gè)，它們分別為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，是這3個(gè)組羊的優(yōu)勢(shì)菌群。將2個(gè)驅(qū)蟲(chóng)組與不驅(qū)蟲(chóng)的對(duì)照組比較，結(jié)果見(jiàn)表3。3個(gè)試驗(yàn)組門(mén)水平OTU相對(duì)豐度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

注：未譯中文的英文菌名，暫無(wú)合適中文譯名

表3 各組羊腸道菌群中相對(duì)豐度最高的15個(gè)門(mén)

在腸道菌群屬水平上，共檢出92個(gè)菌屬，并對(duì)前20的菌屬(共包含了90% 以上的相對(duì)豐度)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)制圖(圖3B)。在圖3B中大于10% 的2個(gè)菌屬分別為疣微菌科未明確分類(lèi)的屬(Unspecified_Ruminococcaceae)和擬桿菌目未明確分類(lèi)的屬(Unspecified_Bacteroidales)，它們是3個(gè)試驗(yàn)組羊的優(yōu)勢(shì)菌群。將不同驅(qū)蟲(chóng)方式的2個(gè)組與不驅(qū)蟲(chóng)對(duì)照組比較，結(jié)果顯示(表4)，屬水平OTU相對(duì)豐度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 各組羊腸道菌群中相對(duì)豐度最高的20個(gè)屬

2.3.2 Alpha多樣性分析

如表5所示，注射驅(qū)蟲(chóng)組、澆潑驅(qū)蟲(chóng)組觀測(cè)到的群落豐富度指數(shù)(Chao1)、群落多樣性指數(shù)(Shannon)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(Faith’s_pd)，均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 Alpha多樣性指數(shù)分析

2.3.3 Beta多樣性

通過(guò)不同樣品間的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較，主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示，不同驅(qū)蟲(chóng)模式下的樣品聚集在一起，微生物群落結(jié)構(gòu)相似度高(圖4A)。非度量多維尺度分析(NMDS)中樣本間距離與主坐標(biāo)分析結(jié)果類(lèi)似，微生物群落結(jié)構(gòu)相似度高(圖4B)。Permanova檢驗(yàn)分析表明(表6)，不同驅(qū)蟲(chóng)模式作用下菌群結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差(P>0.05)。

注：括號(hào)中百分比表示對(duì)應(yīng)坐標(biāo)軸所解釋的樣本差異數(shù)據(jù)比例

表6 Permanova檢驗(yàn)

3 討論

本次驅(qū)蟲(chóng)試驗(yàn)采用了伊維菌素注射和澆潑兩種驅(qū)蟲(chóng)方式，均對(duì)綿羊的體外寄生蟲(chóng)驅(qū)蟲(chóng)效果明顯。消化道蟲(chóng)卵檢測(cè)結(jié)果也表明，兩種方式對(duì)體內(nèi)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵數(shù)也有一定的驅(qū)除作用。本試驗(yàn)與王文龍等[21]的澆潑、注射方法一樣，結(jié)果也一致；同時(shí)與魏彩艷[22]伊維菌素澆潑結(jié)果也一致。

人和動(dòng)物的腸道內(nèi)有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的微生物，包括細(xì)菌、古生菌、病毒和真菌等，其中數(shù)量最多的是細(xì)菌。這些微生物與宿主共代謝、共進(jìn)化，形成互惠共利的復(fù)雜關(guān)系。腸道菌群能為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)和能量、調(diào)節(jié)免疫、頡抗病原微生物、參與代謝，甚至能影響宿主的行為[23-24]。機(jī)體的腸道菌群受遺傳因素、飲食和環(huán)境(如使用驅(qū)蟲(chóng)藥)等多因素的影響。這種共生關(guān)系可能會(huì)因?yàn)榧膊《黄茐?，諸如寄生蟲(chóng)感染能夠影響宿主腸道菌群組成，進(jìn)而影響宿主健康；而腸道菌群也能夠影響寄生蟲(chóng)的活力與感染力[25]。有研究表明在腸道微生物與寄生蟲(chóng)相互作用，腸道菌群的穩(wěn)定是宿主健康的關(guān)鍵因素之一[26]。Coyte等[27]發(fā)現(xiàn)，蛔蟲(chóng)的感染會(huì)對(duì)宿主造成嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)不良，損害了宿主的認(rèn)知、記憶等功能，同時(shí)也引起腸道菌群發(fā)生變化，與感染寄生蟲(chóng)的糞樣相比較，未感染寄生蟲(chóng)的糞樣顯示出腸道菌群物種的豐度更高。寄生蟲(chóng)和腸道菌群間的作用是相互的，通過(guò)改變腸道菌群的組成可能增加黏膜部位對(duì)寄生蟲(chóng)感染的抵抗力，并提升宿主對(duì)這些寄生蟲(chóng)的全身免疫能力[28]。分析人類(lèi)感染寄生蟲(chóng)過(guò)程中腸道微生物的特定成分中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌(Bifidobacterium)和鏈球菌(Streptococcus)豐度較高的宿主對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的抗感染能力更高[29]。在胃腸道寄生蟲(chóng)入侵后，急性發(fā)作的炎癥是伴隨著初始腸道菌群Alpha多樣性減少，并且隨著慢性感染的建立而恢復(fù)[30-31]。

目前研究表明，抗生素藥物大量應(yīng)用于多種疾病的治療，同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致腸道微生物群生態(tài)失調(diào)，多樣性發(fā)生改變等[32]。試驗(yàn)證實(shí)小鼠飼喂萬(wàn)古霉素、新霉素等抗生素后腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，多樣性指數(shù)(Chao 1，Shannon，Simpson)均顯著下降[33]。本試驗(yàn)?zāi)c道菌群測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)兩種驅(qū)蟲(chóng)方法處理后，綿羊腸道菌群結(jié)構(gòu)整體沒(méi)有被影響，不同驅(qū)蟲(chóng)方式屬水平OTU相對(duì)豐度無(wú)顯著差異，Alpha多樣性分析顯示均無(wú)顯著差異，Beta多樣性分析顯示，不同驅(qū)蟲(chóng)模式作用下菌群結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差異。這可能與本文試驗(yàn)所用藥物與前述研究不同、給藥方式不同和用藥濃度較低，澆潑和注射給藥并未直接接觸動(dòng)物消化道等因素有關(guān)。另外，鄭舟琴等[34]在分析抗生素對(duì)小鼠糖代謝及腸道菌群的影響試驗(yàn)中，每周對(duì)小鼠糞便做16S rDNA基因測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)抗生素組較對(duì)照組腸道菌群Shannon指數(shù)顯著下降。萬(wàn)有娣等[33]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其中一組感染第9天時(shí)，小鼠腸道菌群和微生物代謝已基本恢復(fù)。而本試驗(yàn)結(jié)果的觀察測(cè)定時(shí)間為驅(qū)蟲(chóng)后第21天，顯著長(zhǎng)于上述文獻(xiàn)的第9天，也可能是未發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著變化的另一個(gè)原因。

梭菌屬是一群革蘭陽(yáng)性菌，能產(chǎn)生芽胞，對(duì)外界抵抗力強(qiáng)。其廣泛分布于環(huán)境、人和動(dòng)物腸道中，該屬中有許多種可產(chǎn)生外毒素的致病菌，對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生危害，其常見(jiàn)致病厭氧芽胞梭菌主要有破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌(Clostridiumdifficile)等。研究表明，纖維攝入量過(guò)低均可能形成有利于梭狀芽胞桿菌生長(zhǎng)的腸道環(huán)境，從而增加梭狀芽孢桿菌感染導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[35-36]。調(diào)節(jié)腸道的微生物群的平衡，可以抑制梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)，從而達(dá)到降低結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)[37]。本試驗(yàn)根據(jù)物種差異Lefse分析發(fā)現(xiàn)，梭菌科和梭狀屬為不驅(qū)蟲(chóng)對(duì)照組中的優(yōu)勢(shì)差異菌屬，顯著高于經(jīng)兩種驅(qū)蟲(chóng)方式驅(qū)蟲(chóng)的給藥組。兩種驅(qū)蟲(chóng)方式降低了梭菌科和梭狀屬的相對(duì)豐度可能對(duì)于其腸道菌群結(jié)構(gòu)的改善有益。

本試驗(yàn)采用伊維菌素的兩種劑型的驅(qū)蟲(chóng)方式均顯示良好效果，且對(duì)出宿主腸道菌群整體組成結(jié)構(gòu)幾無(wú)影響，而梭菌科、梭菌屬相對(duì)豐度的顯著下降可能對(duì)動(dòng)物健康有益。兩種驅(qū)蟲(chóng)方式未對(duì)綿羊正常生理功能造成不利影響，也間接支持其安全性較好。