梅山豬與杜洛克豬卵泡中circ0010513的鑒定及分析

公紅斌，黃濤，謝蘇，邱梅玉

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832000)

環(huán)狀RNA(circRNAs)是一種能夠形成共價閉合連續(xù)環(huán)的RNA[1-2]。circRNA大部分是非翻譯的，可出現(xiàn)在任何基因組區(qū)域，包括攜帶基因的區(qū)域和基因間區(qū)域，長度范圍從幾百到幾十億的核苷酸[3]。作為一種具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)，沒有5′和3′末端的非編碼RNA(ncRNA)[4-5]，它在許多生物體中廣泛存在，并表現(xiàn)出明顯的組織特異性[6-10]。許多研究發(fā)現(xiàn)，circRNA通過microRNA反應(yīng)元件(MRE)與miRNA結(jié)合，充當miRNA海綿競爭性地抑制miRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)下游靶基因的表達[11-12]。

circRNA在疾病發(fā)生過程中表現(xiàn)出重要的作用，其良好的物種保守性及組織特異性，再加上高度穩(wěn)定性，使其在作為疾病診斷標記物上具有明顯的優(yōu)勢[13]。circRNA作為miRNA-7、miR-17和miR-214的海綿提高體內(nèi)E3泛素(Ub)蛋白連接酶(ITCH)的表達水平，而ITCH的過表達可促進泛素化和Dishevelled 2 (Dvl 2)的磷酸化降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路[14]。Liu等[15]在骨關(guān)節(jié)炎細胞中發(fā)現(xiàn)，circRNA-CER可充當miR-136的分子“海綿”調(diào)控其靶基因MMP13的表達，從而影響軟骨胞外基質(zhì)(ECM)的形成，進而造成軟骨退化。近年來的研究報道顯示，外顯子circRNA亦可作為miRNA海綿體或是競爭內(nèi)源性RNA在哺乳動物中起作用[16]。此外,環(huán)狀RNA在調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成上也可能具有關(guān)鍵性的作用[17]。最新研究發(fā)現(xiàn),circRNA還具有存儲、定位RNA結(jié)合蛋白的功能[18]。

目前關(guān)于circRNA在動物繁殖中的調(diào)控作用研究較少。Jiang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0004904和hsa_circ_0001855 mi RNA海綿介導(dǎo)的妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)的表達，可作為妊娠20周前先兆子癇(PE)的潛在生物標志物。Yan等[20]通過新一代測序(NGS)對產(chǎn)生妊娠期糖尿病(GDM)和正常對照的無偏胎盤絨毛circRNA表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)227個circRNA顯著上調(diào)，255個circRNA顯著下調(diào)，表明circRNA在GDM中發(fā)揮著重要的糖代謝和脂代謝作用。Talhouarne等[21]在熱帶非洲爪蟾卵母細胞的細胞質(zhì)和細胞核中檢測到數(shù)千個來自大多數(shù)表達基因內(nèi)含子的穩(wěn)定RNA(sisRNAs)，其豐度從胚胎發(fā)育階段到胚胎發(fā)育的胚泡階段保持一致。此外，F(xiàn)an等[22]運用單細胞通用聚(A)非依賴性RNA測序(SUPe R-seq)技術(shù)檢測小鼠卵母細胞和早期胚胎(來自受精卵的囊胚)中發(fā)現(xiàn)2 891個circRNA，大多數(shù)小于2 kb的circRNA來自同一宿主基因的內(nèi)部外顯子。

本研究利用生物信息學(xué)方法篩選梅山豬與杜洛克豬M2卵泡中差異表達極顯著的circ0010513，通過qRT-PCR檢測差異表達的circRNA，并利用circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測其可能的調(diào)控機制，為進一步探究circRNA在豬卵泡發(fā)育過程中的表達情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集

試驗選取同一胎次、發(fā)情正常、繁殖表現(xiàn)符合品種特征的梅山和杜洛克成年母豬各3頭，以發(fā)情出現(xiàn)靜立反應(yīng)時記做發(fā)情周期第0天，發(fā)情周期第14天沿耳緣靜脈注射獸用氯前列烯醇注射液1支/頭，注射后第4天屠宰取不同級別卵泡樣，按直徑分類(M1卵泡：3.1～5.0 mm；M2卵泡5.1～7.0 mm)于液氮中凍存，同時取心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮和子宮角等組織，用錫紙包裹于液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol購自Invitrogen(貨號：10296010)； PrimerScriptTMRT regagent Kit購自寶生物(Takara，貨號：RR047A)；LightCycler 480 SYBR Green I購自Roche (貨號：04887352001)。CyclerTMThermal Cycler PCR 儀購自BIO-RAD；DKB-501A型超恒溫水浴鍋購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DYY-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

取兩品種豬的M2卵泡和不同組織100 mg于液氮中研磨，TRIzol法分別提取樣本總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA的完整性，NanoDrop 2000檢測濃度及純度，-80 ℃保存?zhèn)溆茫环崔D(zhuǎn)錄成cDNA參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。對部分總RNA進行RNase R(Epicenter, 貨號：RNR-07250)消化處理，并用RNA clean up(QIAGEN 公司，貨號：217004) 商品試劑盒對 RNA 進行回收，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計與合成

挑選差異表達的 circ0010513，設(shè)計特異性擴增反向剪切位點的引物，由新疆烏魯木齊昆泰銳公司合成(表1)。

表1 circ0010513及內(nèi)參引物序列

1.5 circ0010513 熒光定量PCR擴增

采用Deseq 2進行circRNA差異表達分析，比較梅山與杜洛克豬組，以|Fold Change|≥1.5和P<0.05作為差異表達閾值，并選取鑒定差異表達的circRNA。

反應(yīng)體系：SYBR?Green I PCR Mix 10 μL，上下游引物各1μL；cDNA模板2 μL；加dd H2O至20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min，35次循環(huán)(94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，5 min)。分別對梅山與杜洛克豬各3個樣本進行qRT-PCR試驗，每個試驗重復(fù)3次，取平均值作為分析所用數(shù)據(jù)。

1.6 circ0010513靶基因預(yù)測及功能分析

利用miRanda(http://miranda.org.uk/)、RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid)和targetscan(http：//www.targetscan.org)靶基因預(yù)測軟件對circ0010513的靶基因進行分析預(yù)測，并通過DAVID軟件和KOBAS軟件分別對circ0010513的靶基因進行GO和KEGG分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

分析各組織及梅山豬和杜洛克豬各級卵泡中circ0010513的相對表達量，利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，樣本間差異顯著性進行t檢驗或方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 circRNA鑒定

通過瓊脂糖凝膠電泳分析qRT-PCR產(chǎn)物，擴增出circ0010513的反向剪切位點(圖1)?；厥誔CR產(chǎn)物并送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果表明，所測片段與目的片段大小一致,進一步驗證了擴增結(jié)果的準確性(圖2)。

M.為DNA Maker DL 600；1～4. circ0010513擴增產(chǎn)物

圖2 circ0010513首尾鏈接序列測序峰圖

2.2 circ0010513在不同組織中的表達分析

通過qRT-PCR對circ0010513在杜洛克豬組織中的表達量分析，結(jié)果顯示其在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮和子宮角中均有不同程度的表達(圖3)，表明circ0010513在不同組織中的表達具有明顯的組織特異性。

圖3 circ0010513在杜洛克豬不同組織中相對表達量

2.3 circ0010513在不同時期卵泡中的表達

運用qRT-PCR檢測梅山與杜洛克豬不同級別卵泡中circ0010513的表達情況(圖4)。circ0010513在梅山豬中M1卵泡的表達量極顯著高于M2卵泡(P<0.01)，在杜洛克豬中M2卵泡中的表達量顯著高于M1卵泡(P<0.05)；梅山豬的M1卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克豬的M1卵泡(P<0.01)，梅山豬M2卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克M2卵泡(P<0.01)，揭示梅山豬具有較高的排卵。

注：同一品種不同時期比較,*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著,P<0.01；不同品種不同時期比較，不同大寫字母表示差異極顯著，P<0.01。下同

2.4 circ0010513靶基因預(yù)測及GO和KEGG分析

利用miRanda、 RNAhybrid和targetscan進行circ0010513靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)circ0010513-ssc-miR-1343-GADD45G這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑可用于后續(xù)研究(表2)。

表2 circ0010513靶基因預(yù)測

此外，對circ0010513進行GO和KEGG通路富集分析，circ0010513的靶基因參與凋亡(GO:0006915)、MAP激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性(GO:0017017)、細胞因子受體活(GO:0004896)和細胞周期調(diào)控(GO:0051726)等生物學(xué)過程(圖5)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)circ0010513參與動物繁殖調(diào)控的多條通路，如FoxO信號通路(ssc04068)，MAPK信號通路(ssc04010)和細胞周期信號通路(ssc04110)等。

2.5 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將高通量測序結(jié)果進行篩選，對具有較多miRNA結(jié)合位點的差異表達ssc-circ0010513進行miRNA及靶基因進行預(yù)測(圖6)，分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與豬的妊娠調(diào)控過程。

圖5 GO富集分析

注：紅色表示circ0010513；黃色表示miRNA；綠色表示靶基因

3 討論

由于高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的進步，一度被認為是剪接錯誤的副產(chǎn)物circRNA，最近被發(fā)現(xiàn)在人類細胞中廣泛表達并在許多生物過程中發(fā)揮作用[23-24]。雖然，circRNA通常被分為一類ncRNA，最近的研究表明，circRNA可以翻譯成蛋白質(zhì)可以豐富circRNAs在生命活動中的關(guān)鍵作用[25-26]。

Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)在大白豬和萊蕪豬皮下脂肪組織中鑒定出275個差異表達的circRNA。其中，萊蕪豬皮下脂肪組織中70個上調(diào)，205個下調(diào)。研究人類唾液中circRNA發(fā)現(xiàn)其可能具有細胞外功能，甚至可以作為此類樣本中的生物標記物[28]。研究發(fā)現(xiàn)，通過檢測癌癥細胞外泌體中的circRNAs并結(jié)合circRNAs在心血管病、癌癥等疾病中差異性表達的特征，提示其或許可作為臨床疾病診斷的生物標志物[29]。

生長阻滯和 DNA 損傷誘導(dǎo)蛋白45γ(Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 gamma，Gadd45g) 是GADD45 蛋白家族三成員之一，也叫做細胞因子應(yīng)答基因，可影響細胞周期，負調(diào)控細胞生長[30-31]。Gadd45g是抑制了STAT3的磷酸化，促進了胚胎干細胞中內(nèi)胚層的分化[32]。Lu等[33]研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激(OS)在女性生殖和女性生殖疾病中的發(fā)揮作用，包括多囊卵巢綜合征(PCOS)，子宮內(nèi)膜異位癥，子癇前期等。而Keap1-Nrf2，NF-κB，F(xiàn)oxO和MAPK通路也受OS的影響，影響生殖及生殖疾病。

本研究通過高通量測序檢測梅山豬和杜洛克豬M2時期卵泡中的circRNA，發(fā)現(xiàn)circ0010513在兩品種中差異極顯著，后期通過qRT-PCR驗證與高通量測序結(jié)果一致，進一步證明了測序結(jié)果的準確性。此外，通過構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測得到其潛在靶基因DUSP5和IL20RB，其可能通過MAPK信號通路和JAK STAT信號通路之間的關(guān)聯(lián)相互作用影響細胞的增殖、分化及凋亡等；LAMB3參與了PI3K-Akt信號通路調(diào)控哺乳動物卵巢發(fā)育[34-35]；靶基因GADD45G參與細胞周期及卵巢發(fā)育相關(guān)通路如FoxO信號通路可能參與了卵泡發(fā)育及排卵過程。因此circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與調(diào)控豬卵泡發(fā)育，這將為進一步研究其調(diào)控作用機制提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗通過高通量測序技術(shù)檢測梅山豬和杜洛克豬M2時期卵泡中的circRNA，運用miRanda、RNAhybrid和Targetscan篩選，發(fā)現(xiàn)circ0010513在兩品種中差異極顯著與測序結(jié)果趨于一致。進一步構(gòu)建circ0010513-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與調(diào)控豬卵泡發(fā)育，進而影響豬的繁殖性能。