公紅斌,黃濤,謝蘇,邱梅玉
(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院, 新疆 石河子 832000)
環(huán)狀RNA(circRNAs)是一種能夠形成共價閉合連續(xù)環(huán)的RNA[1-2]。circRNA大部分是非翻譯的,可出現(xiàn)在任何基因組區(qū)域,包括攜帶基因的區(qū)域和基因間區(qū)域,長度范圍從幾百到幾十億的核苷酸[3]。作為一種具有閉環(huán)結(jié)構(gòu),沒有5′和3′末端的非編碼RNA(ncRNA)[4-5],它在許多生物體中廣泛存在,并表現(xiàn)出明顯的組織特異性[6-10]。許多研究發(fā)現(xiàn),circRNA通過microRNA反應(yīng)元件(MRE)與miRNA結(jié)合,充當(dāng)miRNA海綿競爭性地抑制miRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)下游靶基因的表達[11-12]。
circRNA在疾病發(fā)生過程中表現(xiàn)出重要的作用,其良好的物種保守性及組織特異性,再加上高度穩(wěn)定性,使其在作為疾病診斷標(biāo)記物上具有明顯的優(yōu)勢[13]。circRNA作為miRNA-7、miR-17和miR-214的海綿提高體內(nèi)E3泛素(Ub)蛋白連接酶(ITCH)的表達水平,而ITCH的過表達可促進泛素化和Dishevelled 2 (Dvl 2)的磷酸化降解,從而抑制Wnt/β-catenin信號通路[14]。Liu等[15]在骨關(guān)節(jié)炎細胞中發(fā)現(xiàn),circRNA-CER可充當(dāng)miR-136的分子“海綿”調(diào)控其靶基因MMP13的表達,從而影響軟骨胞外基質(zhì)(ECM)的形成,進而造成軟骨退化。近年來的研究報道顯示,外顯子circRNA亦可作為miRNA海綿體或是競爭內(nèi)源性RNA在哺乳動物中起作用[16]。此外,環(huán)狀RNA在調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成上也可能具有關(guān)鍵性的作用[17]。最新研究發(fā)現(xiàn),circRNA還具有存儲、定位RNA結(jié)合蛋白的功能[18]。
目前關(guān)于circRNA在動物繁殖中的調(diào)控作用研究較少。Jiang等[19]研究發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0004904和hsa_circ_0001855 mi RNA海綿介導(dǎo)的妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)的表達,可作為妊娠20周前先兆子癇(PE)的潛在生物標(biāo)志物。Yan等[20]通過新一代測序(NGS)對產(chǎn)生妊娠期糖尿病(GDM)和正常對照的無偏胎盤絨毛circRNA表達譜進行分析,發(fā)現(xiàn)227個circRNA顯著上調(diào),255個circRNA顯著下調(diào),表明circRNA在GDM中發(fā)揮著重要的糖代謝和脂代謝作用。Talhouarne等[21]在熱帶非洲爪蟾卵母細胞的細胞質(zhì)和細胞核中檢測到數(shù)千個來自大多數(shù)表達基因內(nèi)含子的穩(wěn)定RNA(sisRNAs),其豐度從胚胎發(fā)育階段到胚胎發(fā)育的胚泡階段保持一致。此外,F(xiàn)an等[22]運用單細胞通用聚(A)非依賴性RNA測序(SUPe R-seq)技術(shù)檢測小鼠卵母細胞和早期胚胎(來自受精卵的囊胚)中發(fā)現(xiàn)2 891個circRNA,大多數(shù)小于2 kb的circRNA來自同一宿主基因的內(nèi)部外顯子。
本研究利用生物信息學(xué)方法篩選梅山豬與杜洛克豬M2卵泡中差異表達極顯著的circ0010513,通過qRT-PCR檢測差異表達的circRNA,并利用circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測其可能的調(diào)控機制,為進一步探究circRNA在豬卵泡發(fā)育過程中的表達情況奠定基礎(chǔ)。
試驗選取同一胎次、發(fā)情正常、繁殖表現(xiàn)符合品種特征的梅山和杜洛克成年母豬各3頭,以發(fā)情出現(xiàn)靜立反應(yīng)時記做發(fā)情周期第0天,發(fā)情周期第14天沿耳緣靜脈注射獸用氯前列烯醇注射液1支/頭,注射后第4天屠宰取不同級別卵泡樣,按直徑分類(M1卵泡:3.1~5.0 mm;M2卵泡5.1~7.0 mm)于液氮中凍存,同時取心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮和子宮角等組織,用錫紙包裹于液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
TRIzol購自Invitrogen(貨號:10296010); PrimerScriptTMRT regagent Kit購自寶生物(Takara,貨號:RR047A);LightCycler 480 SYBR Green I購自Roche (貨號:04887352001)。CyclerTMThermal Cycler PCR 儀購自BIO-RAD;DKB-501A型超恒溫水浴鍋購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司;DYY-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一儀器廠。
取兩品種豬的M2卵泡和不同組織100 mg于液氮中研磨,TRIzol法分別提取樣本總RNA,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA的完整性,NanoDrop 2000檢測濃度及純度,-80 ℃保存?zhèn)溆?;反轉(zhuǎn)錄成cDNA參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。對部分總RNA進行RNase R(Epicenter, 貨號:RNR-07250)消化處理,并用RNA clean up(QIAGEN 公司,貨號:217004) 商品試劑盒對 RNA 進行回收,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
挑選差異表達的 circ0010513,設(shè)計特異性擴增反向剪切位點的引物,由新疆烏魯木齊昆泰銳公司合成(表1)。
表1 circ0010513及內(nèi)參引物序列
采用Deseq 2進行circRNA差異表達分析,比較梅山與杜洛克豬組,以|Fold Change|≥1.5和P<0.05作為差異表達閾值,并選取鑒定差異表達的circRNA。
反應(yīng)體系:SYBR?Green I PCR Mix 10 μL,上下游引物各1μL;cDNA模板2 μL;加dd H2O至20 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃變性5 min,35次循環(huán)(94 ℃,30 s;54 ℃,30 s;72 ℃,30 s;72 ℃,5 min)。分別對梅山與杜洛克豬各3個樣本進行qRT-PCR試驗,每個試驗重復(fù)3次,取平均值作為分析所用數(shù)據(jù)。
利用miRanda(http://miranda.org.uk/)、RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid)和targetscan(http://www.targetscan.org)靶基因預(yù)測軟件對circ0010513的靶基因進行分析預(yù)測,并通過DAVID軟件和KOBAS軟件分別對circ0010513的靶基因進行GO和KEGG分析。
分析各組織及梅山豬和杜洛克豬各級卵泡中circ0010513的相對表達量,利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,樣本間差異顯著性進行t檢驗或方差分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析qRT-PCR產(chǎn)物,擴增出circ0010513的反向剪切位點(圖1)?;厥誔CR產(chǎn)物并送上海生工生物工程有限公司測序,測序結(jié)果表明,所測片段與目的片段大小一致,進一步驗證了擴增結(jié)果的準(zhǔn)確性(圖2)。
M.為DNA Maker DL 600;1~4. circ0010513擴增產(chǎn)物
圖2 circ0010513首尾鏈接序列測序峰圖
通過qRT-PCR對circ0010513在杜洛克豬組織中的表達量分析,結(jié)果顯示其在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮和子宮角中均有不同程度的表達(圖3),表明circ0010513在不同組織中的表達具有明顯的組織特異性。
圖3 circ0010513在杜洛克豬不同組織中相對表達量
運用qRT-PCR檢測梅山與杜洛克豬不同級別卵泡中circ0010513的表達情況(圖4)。circ0010513在梅山豬中M1卵泡的表達量極顯著高于M2卵泡(P<0.01),在杜洛克豬中M2卵泡中的表達量顯著高于M1卵泡(P<0.05);梅山豬的M1卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克豬的M1卵泡(P<0.01),梅山豬M2卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克M2卵泡(P<0.01),揭示梅山豬具有較高的排卵。
注:同一品種不同時期比較,*表示差異顯著,P<0.05;**表示差異極顯著,P<0.01;不同品種不同時期比較,不同大寫字母表示差異極顯著,P<0.01。下同
利用miRanda、 RNAhybrid和targetscan進行circ0010513靶基因預(yù)測,發(fā)現(xiàn)circ0010513-ssc-miR-1343-GADD45G這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑可用于后續(xù)研究(表2)。
表2 circ0010513靶基因預(yù)測
此外,對circ0010513進行GO和KEGG通路富集分析,circ0010513的靶基因參與凋亡(GO:0006915)、MAP激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性(GO:0017017)、細胞因子受體活(GO:0004896)和細胞周期調(diào)控(GO:0051726)等生物學(xué)過程(圖5)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)circ0010513參與動物繁殖調(diào)控的多條通路,如FoxO信號通路(ssc04068),MAPK信號通路(ssc04010)和細胞周期信號通路(ssc04110)等。
將高通量測序結(jié)果進行篩選,對具有較多miRNA結(jié)合位點的差異表達ssc-circ0010513進行miRNA及靶基因進行預(yù)測(圖6),分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與豬的妊娠調(diào)控過程。
圖5 GO富集分析
注:紅色表示circ0010513;黃色表示miRNA;綠色表示靶基因
由于高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的進步,一度被認(rèn)為是剪接錯誤的副產(chǎn)物circRNA,最近被發(fā)現(xiàn)在人類細胞中廣泛表達并在許多生物過程中發(fā)揮作用[23-24]。雖然,circRNA通常被分為一類ncRNA,最近的研究表明,circRNA可以翻譯成蛋白質(zhì)可以豐富circRNAs在生命活動中的關(guān)鍵作用[25-26]。
Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)在大白豬和萊蕪豬皮下脂肪組織中鑒定出275個差異表達的circRNA。其中,萊蕪豬皮下脂肪組織中70個上調(diào),205個下調(diào)。研究人類唾液中circRNA發(fā)現(xiàn)其可能具有細胞外功能,甚至可以作為此類樣本中的生物標(biāo)記物[28]。研究發(fā)現(xiàn),通過檢測癌癥細胞外泌體中的circRNAs并結(jié)合circRNAs在心血管病、癌癥等疾病中差異性表達的特征,提示其或許可作為臨床疾病診斷的生物標(biāo)志物[29]。
生長阻滯和 DNA 損傷誘導(dǎo)蛋白45γ(Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 gamma,Gadd45g) 是GADD45 蛋白家族三成員之一,也叫做細胞因子應(yīng)答基因,可影響細胞周期,負調(diào)控細胞生長[30-31]。Gadd45g是抑制了STAT3的磷酸化,促進了胚胎干細胞中內(nèi)胚層的分化[32]。Lu等[33]研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激(OS)在女性生殖和女性生殖疾病中的發(fā)揮作用,包括多囊卵巢綜合征(PCOS),子宮內(nèi)膜異位癥,子癇前期等。而Keap1-Nrf2,NF-κB,F(xiàn)oxO和MAPK通路也受OS的影響,影響生殖及生殖疾病。
本研究通過高通量測序檢測梅山豬和杜洛克豬M2時期卵泡中的circRNA,發(fā)現(xiàn)circ0010513在兩品種中差異極顯著,后期通過qRT-PCR驗證與高通量測序結(jié)果一致,進一步證明了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外,通過構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測得到其潛在靶基因DUSP5和IL20RB,其可能通過MAPK信號通路和JAK STAT信號通路之間的關(guān)聯(lián)相互作用影響細胞的增殖、分化及凋亡等;LAMB3參與了PI3K-Akt信號通路調(diào)控哺乳動物卵巢發(fā)育[34-35];靶基因GADD45G參與細胞周期及卵巢發(fā)育相關(guān)通路如FoxO信號通路可能參與了卵泡發(fā)育及排卵過程。因此circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與調(diào)控豬卵泡發(fā)育,這將為進一步研究其調(diào)控作用機制提供理論依據(jù)。
本試驗通過高通量測序技術(shù)檢測梅山豬和杜洛克豬M2時期卵泡中的circRNA,運用miRanda、RNAhybrid和Targetscan篩選,發(fā)現(xiàn)circ0010513在兩品種中差異極顯著與測序結(jié)果趨于一致。進一步構(gòu)建circ0010513-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與調(diào)控豬卵泡發(fā)育,進而影響豬的繁殖性能。