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    山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體及其構(gòu)建方法

    2020-12-09 08:31:10孟繁星樊懿萱鐘部帥王鋒
    畜牧與獸醫(yī) 2020年12期

    孟繁星,樊懿萱,鐘部帥,王鋒

    (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,動物科學(xué)類國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 江蘇 南京 210095)

    我國山羊普遍存在著生長速度慢、出欄體重輕、屠宰率低、肉品質(zhì)差等問題,是規(guī)模化舍飼養(yǎng)羊提質(zhì)增效面臨的重要瓶頸。因此,提高產(chǎn)肉性能及肉品質(zhì)是當(dāng)前山羊生產(chǎn)中要解決的重大問題之一。傳統(tǒng)的選育方法遺傳進(jìn)展緩慢,通過雜交導(dǎo)入外來品種的優(yōu)良等位基因,或者通過基因編輯技術(shù)模擬其他物種主效基因的突變能加速肉用新品種的培育。Fat-1基因編碼的不飽和脂肪酸脫氧酶能夠識別一系列16~20碳的n-6PUFAs底物,進(jìn)而能夠催化不同的n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的n-3PUFAs[1-2]。而n-3PUFAs是一類對人類有益的多不飽和脂肪酸,可降低血脂,預(yù)防多種疾病甚至癌癥等[3-6]。因此,生產(chǎn)轉(zhuǎn)Fat-1家畜,可為提高家畜的肉品質(zhì)及產(chǎn)肉能力提供思路[7-8]?;蚓庉嫾夹g(shù)使生產(chǎn)過表達(dá)Fat-1基因的肉羊新品種成為可能。

    在基因工程中,要獲得大量純化的目的蛋白質(zhì),需要構(gòu)建一種能夠高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。啟動子對外源基因的表達(dá)影響很大,是表達(dá)載體的一個(gè)重要元件。啟動子嚴(yán)格調(diào)控著基因表達(dá)的時(shí)間和空間位置。啟動子與受體細(xì)胞之間良好的兼容性對外源基因的表達(dá)有重要作用。同時(shí),出于高水平表達(dá)的要求,這種啟動子最好有較強(qiáng)的啟動活性,并具有良好的調(diào)控系統(tǒng)。因此,構(gòu)建包含合適啟動子的載體,可以提高外源基因表達(dá)效率?;蛑委煂δ康幕蛟诓∪梭w內(nèi)的表達(dá),要求嚴(yán)格的時(shí)間和空間位置,組織器官特異性啟動子的研究使基因治療方法有了很大進(jìn)步。根據(jù)需要來構(gòu)建合適的組織特異性啟動子載體,不僅便于研究新基因的功能,還可闡明生物的生長、發(fā)育、分化及繁殖的過程與機(jī)理,在特定的部位或發(fā)育階段生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)或其他代謝產(chǎn)物,以實(shí)現(xiàn)對外源基因表達(dá)定時(shí)、定點(diǎn)、定量的精確調(diào)控。

    利用肌肉特異性啟動子,通過構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體,能夠開啟基因固定于肌肉中表達(dá)。通過外源基因的蛋白或RNAs在山羊的骨骼肌中的表達(dá),可很好地研究肌肉的分化或功能,改善肌肉的風(fēng)味、質(zhì)量。例如可利用肌肉特異性的啟動子攜帶目的micRNA,特異性的靜默其靶基因在肌肉中的表達(dá)而不影響其他組織中此基因的正常表達(dá),有效獲得目的基因?qū)τ诩∪饨M織的作用;同時(shí),利用肌肉組織特異性啟動子,研究那些通過QTL圖譜定位及表達(dá)分析獲得的可用于提高肌肉量的候選基因。

    1 材料與方法

    1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞

    pEGFP-C1質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存,pMD19-T質(zhì)粒購自TaKaRa公司,TOP10菌株購自北京天根公司,293FT細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 主要儀器

    5417R型臺式冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf)、PCR擴(kuò)增儀(TaKaRa)、電泳儀 DYⅢ 3A 型(北京六一儀器廠)、全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清公司)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、熒光倒置顯微鏡(Nikon)、7300 型熒光定量PCR 儀(ABI)。

    1.3 主要試劑

    質(zhì)粒提取試劑盒(D6943-01和D6950-01)購自O(shè)mega公司,所有的工具酶均購自TaKaRa公司,DNA片段的凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物公司,PCR引物的合成及載體測序均由Life Technologies公司完成;細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶消化液、DPBS緩沖液、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購自Life Technologies公司;細(xì)胞總RNA提取試劑盒(RP1202)購自北京百泰克生物公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A)購自TaKaRa公司,熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司。

    1.4 主要溶液配制

    1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)基

    LB液體培養(yǎng)基:每升含有酵母提取物5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,NaCl 10.0 g,pH 7.0,121 ℃高壓滅菌30 min,室溫冷卻后放于4 ℃冰箱備用。

    LB固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂粉,高壓蒸汽滅菌20 min,無菌條件下鋪平板。若加抗生素,鋪板之前,加入抗生素,卡那霉素(kanamycin)終濃度為50 μg/mL,氨芐青霉素(ampicillin)終濃度為100 μg/mL。

    1.4.2 核酸電泳用試劑

    6×Loading Buffer:4.4 g EDTA,250 mg 溴酚藍(lán),250 mg Xylene Cyanol FF,180 mL 甘油,調(diào)節(jié)pH 至7.0,加去離子水定容至500 mL。

    50×Tris-乙酸(TAE):242 g Tris液,37.2 g Na2EDTA·2H2O,57.1 mL 冰乙酸,加去離子水定容至1 L。

    1.5 試驗(yàn)方法

    首先將Fat-1基因克隆入pEGFP-N1載體,然后將PCR擴(kuò)增得到的CMV增強(qiáng)子插入無啟動子和增強(qiáng)子的pEGFPN1-Fat-1載體,最后將骨骼肌特異性基因α肌動蛋白(α-actin)啟動子插入到上述載體中,構(gòu)建成α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體。骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1基因表達(dá)載體構(gòu)建示意圖(見圖1)。

    1.5.1 利用平末端連接構(gòu)建pEGFPN1-Fat-1載體

    經(jīng)過EcoRⅠ酶切,從PCAGGS-Fat-1質(zhì)粒獲得Fat-1片段。將10×buffer 2 μL,質(zhì)粒DNA 10 μL,EcoRⅠ 1 μL,ddH2O添加至20 μL進(jìn)行酶切。電泳后,切膠回收Fat-1片段。

    線性化pEGFP-N1載體。加10×buffer 2 μL,質(zhì)粒DNA 10 10 μL,BamHⅠ 1 μL,用ddH2O添加至20 μL,線性化處理pEGFP-N1載體。

    將切膠回收后的Fat-1和線性化pEGFP-N1的cDNA末端,按照如下體系72 ℃ 45 min 補(bǔ)平。

    反應(yīng)體系:Premix STAR 25 μL,F(xiàn)at-1的cDNA/pEGFP-N1的cDNA(已酶切) 20 μL,ddH2O添加至50 μL。

    平末端連接:Solution I 5 μL,F(xiàn)at-1補(bǔ)平產(chǎn)物1 μL,pEGFP-N1補(bǔ)平產(chǎn)物 4 μL,16 ℃過夜。

    圖1 骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1基因表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖

    1.5.2 pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體的構(gòu)建

    根據(jù)PCAGGS載體的CMV-Enhancer序列,設(shè)計(jì)一對含有特異性酶切位點(diǎn)的引物,通過PCR方法擴(kuò)增CMV-Enhancer基因。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。然后將上述產(chǎn)物與pMD?19-T Vector連接。對CMV-Enhancer基因進(jìn)行測序后,與PCAGGS載體CMV-Enhancer序列做Blast比對。擴(kuò)增山羊CMV-Enhancer基因的引物序列如下:

    Enhancer-F:GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC(引入AseⅠ位點(diǎn));

    Enhancer-R:GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG(引入SalⅠ位點(diǎn))。

    CMV-Enhance基因片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。分別利用SalⅠ和AseⅠ雙酶切pMD?19-T-CMV-enhancer和Fat1-pEGFP-N1載體并分別回收酶切產(chǎn)物CMV-Enhancer基因片段和線性化的Fat-1-pEGFP-N1載體。將酶切產(chǎn)物定向克隆到無啟動子和增強(qiáng)子的pEGFPN1-Fat-1載體質(zhì)粒中,構(gòu)建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體。

    1.5.3 α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體的構(gòu)建

    SalⅠ單酶切骨骼肌特異性基因α-actin啟動子的DNA,插入到線性化的pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體上,構(gòu)建成α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體。采用分段PCR擴(kuò)增的方法,分別從羊肌肉組織DNA中擴(kuò)增1 824 bp和1 347 bp兩片段Part1和Part2,首尾相連插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer質(zhì)粒同一位置。各片段引物設(shè)計(jì)如下:

    part1F: TCATCGCTATTACCAGTCGACAGCCCCC-CTCACTATTCTTTT;

    part1R: CTGGGCAGCAGTTTTCCT;

    part2F: GAAAACTGCTGCCCAGCCTACAGTGCA-ACGTCCTTGTCTT;

    part2R: CGGGCCCGCGGTACCGTCGACAGGCT-TCTCTCGGCGCTGTCCGCT。

    按照98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備兩段插入片段,膠回收備用。Part1不加任何添加劑,直接擴(kuò)增。Part2通過添加DMSO進(jìn)行擴(kuò)增優(yōu)化,在20 μL體系中,添加0.6 μL DMSO大量擴(kuò)增制備該片段。

    SalⅠ單酶切pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體,膠回收備用。線性化pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體和α-actin的兩部分片段在ExnaseTM 催化下,37 ℃,30 min重組。置于冰水浴中5 min后,進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取轉(zhuǎn)換平板10個(gè)克隆,搖菌提取質(zhì)粒并鑒定。然后挑取3個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測序。

    1.5.4 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體的功能驗(yàn)證

    以海腎熒光素酶報(bào)告基因PRL-TK做內(nèi)參質(zhì)粒(用以校正轉(zhuǎn)染效率),以LipofectamineTM2000做轉(zhuǎn)染試劑,將構(gòu)建的山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染山羊骨骼肌細(xì)胞,誘導(dǎo)分化的山羊骨骼肌細(xì)胞。用山羊心肌細(xì)胞和骨骼肌間充質(zhì)干細(xì)胞空轉(zhuǎn)做陰性對照,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒,對山羊骨骼肌特異性表達(dá)基因α-actin啟動子驅(qū)動Fat-1表達(dá)載體的活性及組織特異性進(jìn)行分析,啟動子活性大小用相對活性(螢火蟲熒光素酶的活性同內(nèi)參海腎熒光素酶的活性的比值)表示。

    1.5.5 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡

    按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書,將α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染羊耳皮膚成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×106個(gè)/mL,1 500 r/min離心5 min,棄上清,用PBS洗1次,離心得到細(xì)胞團(tuán),加入1 mL DNA染色液,漩渦混合5~10 s,室溫避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。采用Annexin V/PI染色法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

    1.5.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    所有試驗(yàn)重復(fù)至少3次。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,差異顯著性分析使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,不同字母代表差異顯著,P<0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體的構(gòu)建

    2.1.1 利用平末端連接構(gòu)建pEGFPN1-Fat-1載體

    PCAGGS-Fat-1質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切后電泳可見1.3 kb的目的條帶及PCAGGS載體條帶(圖2)。pEGFP-N1質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切后電泳可見線性化的載體條帶(圖3)。

    M. Marker;1. Fat-1

    M. Marker;1. 線性化pEGFP-N1

    將切膠回收后的Fat-1和線性化pEGFP-N1的cDNA末端補(bǔ)平,進(jìn)行平末端連接。pEGFPN1-Fat-1中Fat-1基因序列與EGFP連接處正確(圖4)。

    圖4 pEGFPN1-Fat-1中Fat-1序列與EGFP連接處測序結(jié)果

    2.1.2 pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體的構(gòu)建

    對CMV-Enhancer基因進(jìn)行測序后,與PCAGGS載體CMV-Enhancer序列做Blast比對,結(jié)果同源性為99.8%。CMV-Enhance基因片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,可見338 bp處明亮特異的目的條帶(圖5)。CMV-Enhancer基因測序結(jié)果與PCAGGS載體CMV-Enhancer序列一致(圖6)。利用pMD?19-T-CMV-enhancer載體上自帶的SalⅠ和AseⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),將酶切產(chǎn)物定向克隆到無啟動子pEGFPN1-Fat-1載體質(zhì)粒中,構(gòu)建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體(圖7和 圖8)。

    M. Marker;1. 目的條帶

    圖6 CMV-Enhancer基因測序結(jié)果

    M.Marker;1~3. 目的條帶圖7 AseⅠ、SalⅠ雙酶切 M.Marker;1~3. 目的條帶圖8 AseⅠ、SalⅠ雙酶切

    2.1.3 α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體的構(gòu)建

    SalⅠ單酶切骨骼肌特異性基因α-actin啟動子的NDA,插入線性化的pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體,構(gòu)建成α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體。從羊肌肉組織DNA中,擴(kuò)增1 824 bp和1 347 bp兩片段Part1和Part2,首尾相連插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增制備兩段插入片段(圖9)。

    A. PCR擴(kuò)增Part1;B. 添加DMSO擴(kuò)增優(yōu)化Part2

    PCR鑒定α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體(圖10)。而且,測序結(jié)果與GenBank 報(bào)道序列一致。說明α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體構(gòu)建成功。

    2.2 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體的生物學(xué)功能

    2.2.1 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體的功能驗(yàn)證

    如圖11所示,試驗(yàn)構(gòu)建的載體僅在誘導(dǎo)分化的山羊肌肉細(xì)胞中表達(dá),在未誘導(dǎo)分化的山羊骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中未檢測到熒光蛋白表達(dá),無啟動活性(圖11)。綜上所述,α-actin表達(dá)載體為骨骼肌特異性表達(dá)載體,能夠滿足下游基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求,為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。

    M. Maker,0. 空載對照質(zhì)粒;1~10. 克隆

    圖11 4種細(xì)胞中a-actin驅(qū)動下的LUC的相對活性檢測

    2.2.2 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體對耳成纖維細(xì)胞周期的影響

    通過流式細(xì)胞儀測定了波爾羊耳成纖維細(xì)胞(BG)、轉(zhuǎn)Fat-1羊成纖維細(xì)胞(BG-Fat-1)、杜泊羊耳成纖維細(xì)胞(DS)及轉(zhuǎn)Fat-1基因杜泊羊耳成纖維細(xì)胞(DS-Fat-1)的細(xì)胞周期,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)Fat-1基因細(xì)胞比相對應(yīng)非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的增殖能力強(qiáng),初步推測,F(xiàn)at-1基因促進(jìn)羊耳成纖維細(xì)胞增殖,為后續(xù)進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)(圖12)。

    2.2.3 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體對耳成纖維細(xì)胞凋亡的影響

    通過流式細(xì)胞儀測定了細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果見圖13A。BG-Fat-1組細(xì)胞凋亡率顯著低于BG組,DS和DS-Fat-1組差異不顯著,但凋亡率有下降趨勢(圖13B)。

    圖13 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

    轉(zhuǎn)Fat-1基因細(xì)胞的凋亡率低于相對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,初步推測Fat-1基因參與調(diào)節(jié)羊耳成纖維細(xì)胞凋亡。

    3 討論

    啟動子嚴(yán)格調(diào)控著基因表達(dá)的時(shí)間和空間位置。啟動子與受體細(xì)胞之間良好的兼容性對外源基因的表達(dá)有重要作用[9]。因此,選擇合適的特異性啟動子可以顯著影響所構(gòu)建的表達(dá)載體對外源基因的表達(dá)效率。另外,根據(jù)需要來構(gòu)建合適的組織特異性啟動子載體,不僅便于研究新基因的功能,還可闡明生物的生長、發(fā)育、分化及繁殖過程與機(jī)理,在特定的部位或發(fā)育階段生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)或其他代謝產(chǎn)物,以實(shí)現(xiàn)對外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)、定量精確調(diào)控。

    近年來, 隨著基因組測序等生物技術(shù)的飛速發(fā)展, 除了α肌動蛋白(α-actin)[10]、人們還分離了許多骨骼肌特異性啟動子, 如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(FATP1)、骨骼肌肌球蛋白輕鏈2(Mylpf)、肌肉肌酸激酶(CKM)、肌原調(diào)節(jié)蛋白1(Myoz1)和快肌肌鈣蛋白C(Tnnc2)等骨骼肌特異性基因啟動子,但是哪個(gè)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性及其對山羊骨骼肌細(xì)胞增殖、分化作用最顯著,目前還不得而知。

    本文利用骨骼肌特異性基因α-actin啟動子,構(gòu)建了一種山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體,不僅開啟了將基因局限于骨骼肌中表達(dá)的通路,而且滿足了下游基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求,為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。研究結(jié)果表明,選擇山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動子構(gòu)建的載體僅在誘導(dǎo)分化的山羊肌肉細(xì)胞中表達(dá),在未誘導(dǎo)分化山羊骨骼肌,心肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中并未檢測到熒光蛋白,無啟動活性。此外,研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)at-1基因促進(jìn)羊耳成纖維細(xì)胞增殖,抑制凋亡。初步預(yù)測得到的Fat-1轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞可作為后期體細(xì)胞核移植的優(yōu)良細(xì)胞核供體,為下一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物奠定了基礎(chǔ)。

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