吸氫對大鼠顱腦損傷引起的急性炎癥反應(yīng)的抑制作用

琚芳迪,謝飛*,郭大志,趙清輝,何晉,姚婷婷,趙鵬翔,潘樹義,馬雪梅*

1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 北京 100124; 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心, 北京 100048

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是由外力引起的大腦功能或病理學(xué)改變。每年全世界大約有1 000萬人遭受TBI，并且相當(dāng)多患者因此暫時或者永久殘疾、甚至死亡[1]。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，在我國TBI的致死率約為13例/10萬人口[2]，預(yù)計顱腦損傷將成為負擔(dān)最重的第三大疾病[3]。TBI發(fā)生后經(jīng)初始損傷和繼發(fā)性損傷導(dǎo)致腦功能障礙，其中繼發(fā)性損傷引起的腦水腫是造成患者殘疾和死亡的首要原因。臨床上用于治療TBI的藥物主要包括鈣拮抗劑、糖皮質(zhì)激素、甘露醇以及內(nèi)源性腦保護因子等，雖然這些藥物可以在一定程度上促進神經(jīng)功能的恢復(fù)，然而到目前為止還沒有一種藥物具有確切的臨床療效。

氫氣(hydrogen)是世界上已知最輕的氣體，無色、無嗅、無味，有還原性，在水中溶解度較低。人體腸道中某些細菌可通過代謝作用產(chǎn)生少量氫氣，并通過人體的消化、呼吸系統(tǒng)排出體外[4]。但正因為缺乏內(nèi)源性代謝途徑，氫氣的醫(yī)學(xué)作用長期以來并未得到重視。2007年，Ohsawa等[5]的研究表明，吸入2%的氫氣可顯著緩解腦缺血損傷，并提出氫氣可通過選擇性清除毒性氧自由基發(fā)揮生物學(xué)作用。隨后關(guān)于氫氣生物學(xué)作用的研究大量涌現(xiàn)。由于具有分子小、易滲透的特點，氫分子很容易穿過血腦屏障，為其在神經(jīng)系統(tǒng)尤其是腦損傷中發(fā)揮保護作用提供了有利條件。近年來的研究表明，通過吸氫、飲用富氫水或注射富氫生理鹽水等多種方式均可顯著緩解TBI后的腦功能損傷[6-11]。然而，關(guān)于氫氣的作用機理的研究目前還處于初級階段，其中抗氧化、抗炎癥、抗凋亡以及調(diào)節(jié)信號通路均只能部分解釋氫分子對某些疾病的保護作用[12-13]，因此深入探究氫分子的作用機理仍然是目前氫分子生物學(xué)研究亟需解決的問題。

以往研究曾報道富氫水可能通過抑制炎癥反應(yīng)來發(fā)揮其對TBI后腦損傷的保護作用[8-9]，然而關(guān)于吸入氫氣對TBI急性炎癥反應(yīng)的影響的研究較少。已有研究顯示，吸氫24 h即可顯著緩解TBI后的腦功能損傷，提示吸氫可能對TBI后急性炎癥反應(yīng)起到抑制作用[6]，因此本研究主要針對吸入氫氣對TBI急性期內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響進行深入研究。為了深入探索氫分子對TBI后急性炎癥反應(yīng)的影響，采用懸浮芯片技術(shù)監(jiān)測TBI后24 h內(nèi)血清中23種細胞因子水平的變化；TBI后24 h采用改良的神經(jīng)功能缺失評分法(modified neurological severity score，mNss)評估吸氫的神經(jīng)保護作用，同時取腦組織進行尼氏染色分析并對血清生化指標(biāo)進行檢測，以期為進一步研究氫分子對TBI保護作用的機理提供更多線索，同時也為未來氫氣在TBI臨床治療中的應(yīng)用提供更多理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

尼氏染色液(武漢博士德生物工程有限公司)；Bio-Plex ProTM大鼠23細胞因子多重檢測試劑盒(美國Bio-rad公司)。PCI3000精密打擊器(美國Hatteras Instruments公司)；SG-3000型氫氧氣霧化機；氣相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；懸浮芯片系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；2400全自動生化分析儀(西門子(中國)有限公司)。

1.2 實驗動物及分組

6周齡雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。大鼠自由飲水進食，飼養(yǎng)于22～25 ℃、12 h/12 h明暗交替的清潔級動物實驗室內(nèi)，建模前大鼠需要適應(yīng)環(huán)境1周時間。大鼠隨機分為3組(每組20只)：假手術(shù)組(僅開骨窗，未進行打擊；sham組)；顱腦損傷組(TBI組)；顱腦損傷后的氫氣治療組(HI組)。其中，每組8只大鼠用于TBI后24 h mNss評分、血清生化指標(biāo)檢測和尼氏染色分析，另外12只大鼠用于TBI后2、6和24 h細胞因子檢測(每個時間點4只大鼠)。

1.3 TBI模型的建立

TBI模型采用了目前比較公認的控制性皮層沖擊損傷(controlled cortical impact，CCI)模型[14]。具體方法如下：將大鼠放在誘導(dǎo)箱中采用3%異氟烷進行吸入麻醉后從誘導(dǎo)箱中取出，在面罩下繼續(xù)吸入異氟烷以維持麻醉。待大鼠后肢退縮反射消失后，將大鼠置于立體定向框架內(nèi)。沿中線切開頭皮約2.0 cm，鈍性分離骨膜，3% H2O2去除骨膜，暴露前囟和后囟。調(diào)節(jié)定位儀使打擊頭距前囟3.5 mm、距中線左側(cè)3.0 mm，用牙鉆鉆一個直徑為6.0 mm的骨孔，并保持硬腦膜的完整性。使用Hatteras Instruments PCI3000精密打擊器進行打擊，打擊頭直徑為5.0 mm，打擊速度為4.0 m·s-1，打擊深度為6.0 mm，滯留時間500 ms。打擊完成后觀察大鼠的呼吸情況，確認無誤后，用生理鹽水沖洗并用碘伏消毒后用骨蠟封閉，最后縫合頭皮。

1.4 吸氫處理

氫氣發(fā)生器由SG-3000型氫氧氣霧化機與氣體混合器組成，將氫氣發(fā)生器與透明封閉塑料箱(長×寬×高：72 cm×53 cm×45 cm)相連，測量箱內(nèi)氫氣濃度，并通過調(diào)節(jié)氣體流量使得箱內(nèi)氫氣濃度為4%，氧氣濃度約為21%。HI組大鼠在建模后立即進行吸氫處理，將大鼠放入箱中吸氫1 h，8 h后再吸氫1次。采用氣相色譜儀對密閉箱中的氫氣和氧氣濃度進行監(jiān)測。

1.5 神經(jīng)功能缺失評分

在顱腦損傷后24 h采用mNss評分法對各組大鼠進行評估，具體方法參考Chen等[15]的研究。mNss評分法包括對大鼠運動、感覺、平衡能力和反射功能進行評估，總分0～18分，分值越大說明大鼠的神經(jīng)功能缺失越嚴重，1～6分為輕度損傷、7～12分為中度損傷、13～18分為重度損傷。

1.6 腦組織神經(jīng)元尼氏染色

顱腦損傷后24 h取血后處死大鼠，取腦皮質(zhì)損傷區(qū)組織用甲醛固定后進行石蠟包埋。石蠟包埋組織行冠狀切片(厚度為4 μm)后用二甲苯脫蠟并進行梯度乙醇水化，然后將切片用尼氏染色液染色5 min。染色后再經(jīng)脫水和透明后進行封片鏡檢。

1.7 血清生化指標(biāo)和細胞因子檢測

1.7.1血液采集和處理方法 3%異氟烷大鼠麻醉后，用毛細管在眼眥靜脈叢取血約1 mL置于含促凝劑的采血管中，室溫放置30 min后，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清用于血清細胞因子和生化指標(biāo)檢測。

1.7.2細胞因子檢測 在Bio-rad懸浮芯片系統(tǒng)上采用Bio-Plex ProTM大鼠23細胞因子多重檢測試劑盒對血清中的細胞因子濃度變化進行監(jiān)測，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。23種細胞因子包括：白介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-2(interleukin-2，IL-2)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-5(interleukin-5，IL-5)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-7(interleukin-7，IL-7)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-12(interleukin-12，IL-12)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)、白介素-17(interleukin-17，IL-17)、白介素-18(interleukin-18，IL-18)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、生長相關(guān)致癌基因(growth-regulated oneogene-KC，GRO-KC)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)、巨噬細胞炎性蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α)、T細胞表達分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。

1.7.3生化指標(biāo)檢測 采用西門子全自動生化分析儀2400進行生化指標(biāo)檢測。操作方法嚴格按照儀器使用說明進行。生化指標(biāo)包括：空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、尿酸(uric acid，UA)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)和a-羥基丁酸脫氫酶(a-hydroxybutyrate dehydrogenase，HDB)。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用GraphPad Prism 8.0.2進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，兩組數(shù)據(jù)之間的比較使用非配對t-test方法，結(jié)果以Mean±SEM表示，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸氫對TBI后神經(jīng)功能損傷的影響

為了探究吸氫對TBI后神經(jīng)功能損傷的影響，在顱腦損傷后24 h采用mNss評分法對各組大鼠進行評估。mNss評分結(jié)果表明，與sham組相比，TBI組大鼠在TBI后24 h mNss評分明顯升高，而吸氫組(HI)mNss評分與TBI組相比顯著降低(P<0.05)，提示吸氫對TBI引起的神經(jīng)功能損傷具有保護作用(圖1)。

2.2 吸氫對TBI引起的神經(jīng)元損傷的保護作用

為了進一步驗證吸氫對TBI引起的神經(jīng)元損傷的保護作用，在顱腦損傷后24 h取血后處死大鼠，取腦皮質(zhì)損傷區(qū)組織切片進行尼氏染色分析。結(jié)果表明，與sham組相比，TBI組大鼠在TBI后24 h神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(P<0.001)，同時出現(xiàn)很多尼氏染色較深的神經(jīng)元(即為損傷神經(jīng)元)，提示神經(jīng)元受損嚴重。與TBI組相比，吸氫組(HI)神經(jīng)元數(shù)目顯著增多(P<0.05)，同時尼氏染色較深的神經(jīng)元(即為損傷神經(jīng)元)數(shù)目相對減少，提示吸氫對TBI引起的神經(jīng)元損傷有很好的保護作用(圖2)。

2.3 吸氫對血清細胞因子的影響

為了進一步研究TBI大鼠吸氫后對血清中細胞因子的影響，實驗中選取了TBI急性期的3個時間點(2、6和24 h)對血清中23種細胞因子的濃度變化進行了監(jiān)測。結(jié)果表明，大鼠TBI后24 h內(nèi)血清中細胞因子的變化主要呈現(xiàn)以下4種情況。①TBI后2 h細胞因子濃度升高，24 h內(nèi)隨時間的推移濃度逐漸下降。符合該變化趨勢的細胞因子包括：IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ、GRO-KC和MCP-1。②TBI后細胞因子濃度逐漸升高，到第6 h達到頂峰，然后又逐漸下降。符合該變化趨勢的細胞因子包括：IL-4、IL-12、TNF-α、G-CSF、M-CSF、MIP-3α和VEGF。③從TBI后2 h開始就呈現(xiàn)下降趨勢的，這類細胞因子包括：IL-18和RANTES。④在TBI后24 h內(nèi)無明顯變化的細胞因子，包括IL-1α、IL-7、GM-CSF和MIP-1α(圖3)。

A：大鼠腦組織神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果；B：單位面積神經(jīng)元數(shù)目；*和***分別表示處理組與Sham組間或處理組間(帶連接線)的差異在P<0.05和P<0.001水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖2 吸氫對TBI急性期神經(jīng)元的影響Fig.2 Effect of hydrogen inhalation on neurons in the acute phase after TBI

注：*、** 、*** 和**** 分別表示處理組與Sham組間或處理組間(帶連接線)的差異在P<0.05、P<0.01、P<0.001和P<0.000 1水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖3 吸氫對TBI急性期血清細胞因子的影響Fig.3 Effect of hydrogen inhalation on serum cytokines in the acute phase after TBI

與TBI組大鼠相比，吸氫組(HI)大鼠有7種促炎細胞因子在TBI后2 h明顯降低，其中包括IL-1β(59.81%)、IL-17(58.22%)、IL-6(51.56%，P= 0.0834)、IL-13(49.44%)、IFN-γ(37.53%)、IL-2(37.51%)和IL-5(16.11%)，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),以上細胞因子的血清濃度在6 h和24 h內(nèi)的變化均小于2 h;有7種細胞因子(主要是趨化因子)在TBI后2 h升高，其中包括M-CSF(137.13%，P=0.017 0)、GRO-KC(91.18%)、G-CSF(77.18%)、MIP-3α(75.21%)、IL-7(63.05%)、IL-12(45.88%)、IL-1α(40.61%)，除M-CSF外差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；除以上細胞因子外，VEGF在TBI后6 h明顯升高(33.31%，P>0.05)(圖3)。

2.4 吸氫對血清生化指標(biāo)的影響

研究中還對血清中的生化指標(biāo)進行了檢測。結(jié)果表明，TBI后24 h下列生化指標(biāo)呈現(xiàn)升高趨勢，包括FBG(22.03%，P=0.023 2)、TG(54.87%，P=0.093 5)、AST活性(69.70%，P>0.05)、ALT活性(80.51%，P>0.05)、LDL-C(15.89%，P>0.05)、CK活性(30.24%，P>0.05)、CK-MB活性(60.58%，P=0.038 1)和HDB活性(35.93%，P>0.05)。此外，UA水平有降低趨勢(27.03%，P=0.053 8)，而TC、HDL-C和LDH活性則無明顯變化。與TBI組相比，吸氫組(HI)TC(20.23%，P=0.052 2)、HDL-C(19.87%，P>0.05)、FBG(P>0.05)明顯升高，而TG(26.29%，P>0.05)、UA(P>0.05)、AST活性(23.04%，P>0.05)、ALT活性(26.47%，P>0.05)、LDL-C(16.16%，P>0.05)、LDH活性(46.08%，P=0.002 7)、CK活性(30.40%，P>0.05)、CK-MB活性(35.88%，P=0.034 3)以及HDB活性(59.13%，P=0.014 9)均明顯下降(圖4)。

3 討論

氫氣在創(chuàng)傷性顱腦損傷中的保護作用已有多篇報道，在這些研究中氫氣的攝入方式主要有3種：吸氫、飲用富氫水和注射富氫生理鹽水。其中，飲用富氫水和注射富氫生理鹽水均連續(xù)干預(yù)7 d[7-10]，而吸氫僅在TBI后5 h內(nèi)一次性干預(yù)[6, 11]，提示吸氫對TBI的保護作用可能更好。以往關(guān)于3種氫氣攝入方式的比較研究表明，采用吸氫方式攝入氫氣后腦組織中氫氣濃度可以維持1 h以上，而采用另外2種氫氣攝入方式腦組織中氫氣濃度僅能維持5～30 min[16]，這可能是吸氫對TBI保護作用更好的原因之一。本研究中，神經(jīng)功能評分表明，TBI大鼠吸氫后24 h內(nèi)神經(jīng)功能就有顯著改善，尼氏染色進一步驗證了吸氫對神經(jīng)元的保護作用。

注：*和**分別表示處理組與Sham組間或處理組間(帶連接線)的差異在P<0.05和P<0.01水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖4 吸氫對TBI后血清生化指標(biāo)的影響Fig.4 Effects of hydrogen inhaltion on biochemical indexes in serum after TBI

TBI后中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的重要原因之一[17-18]。TBI急性期由于炎癥反應(yīng)會分泌大量促炎因子，引起血管通透性增加，進而導(dǎo)致腦水腫和顱內(nèi)壓升高，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡。最近研究表明，TBI后患者外周血中IL-1、IL-6、IL-8、IL-10以及TNF-α水平明顯升高，且持續(xù)時間可長達3個月。其中，促炎因子IL-6與抗炎因子IL-10水平升高尤為明顯[19-20]。動物實驗結(jié)果表明，大鼠在TBI后24 h內(nèi)腦組織中多種細胞因子水平均顯著升高，其中包括10種細胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17α、IL-18、IFN-α和TNF-α)和4種生長因子(EGF、GM-CSF、Leptin和VEGF)[21]。與腦組織相比，TBI對外周血中細胞因子的影響相對較小，并且有些細胞因子的變化趨勢在不同研究中并不一致。如Keshavarzi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠TBI后24 h血清中IL-10水平并無顯著性變化，IL-1β水平則顯著降低。Ma等[23]的研究表明，大鼠在TBI后24 h內(nèi)，血清中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α水平均顯著升高，該結(jié)果與本研究基本一致。除以上4種細胞因子在TBI后24 h內(nèi)顯著升高外，本研究還發(fā)現(xiàn)其他9種細胞因子水平在TBI后明顯升高，該結(jié)果提示，TBI后24 h內(nèi)大鼠機體炎癥反應(yīng)明顯升高。

本研究的重要發(fā)現(xiàn)是，在TBI急性期，吸氫組有7種促炎細胞因子明顯降低，其中包括IL-1β、IL-6、IFN-γ等，說明氫分子對TBI后急性炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用?？紤]到TBI后在短時間內(nèi)(2 h)即有大量促炎因子水平急劇升高，而吸氫可以對這種促炎因子的集中爆發(fā)有明顯的抑制作用，由此推測吸氫可能對由病毒(如新冠病毒)感染等其他因素引起的細胞因子風(fēng)暴有一定的抑制作用。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)吸氫后有些細胞因子的血清濃度明顯升高，其中主要包括一些趨化因子，如M-CSF、G-CSF、GRO-KC和MIP-3α，這些趨化因子僅在TBI后2 h有升高趨勢，而在TBI后24 h吸氫組與TBI組無顯著差異。研究表明，M-CSF、G-CSF等趨化因子對腦損傷后的神經(jīng)恢復(fù)有保護作用[24-25]，推測在TBI早期氫分子可能通過上調(diào)這些趨化因子來發(fā)揮保護作用。

研究表明，TBI會導(dǎo)致兒茶酚胺的釋放，進而導(dǎo)致糖原分解增加同時胰島素分泌受到抑制，最終引起血糖水平升高[26-27]，同時血液中兒茶酚胺水平的升高還會導(dǎo)致心臟功能受損[27]。本研究中血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，TBI后24 h血清中FBG濃度顯著升高，此結(jié)果與以往報道[26-27]一致。同時，研究結(jié)果還表明，作為心臟功能的標(biāo)志物，LDH、CK、CK-MB以及HDB活性在TBI后明顯升高，提示TBI導(dǎo)致心臟功能受損。雖然吸氫并未抑制FBG水平的升高，但是與TBI組相比，以上4種心肌酶的活性在吸氫后均明顯下降，提示吸氫對TBI引起的心臟功能損傷有很好的保護作用。除以上4種酶外，以往研究中也報道過AST和ALT酶活的升高與腦損傷嚴重程度成正比[28]。作為肝臟功能的標(biāo)志物，吸氫后這2種酶的活性與TBI組相比也明顯下降，進一步說明吸氫后腦損傷程度有所緩解，同時也提示吸氫對TBI引起的肝臟功能損傷有保護作用。研究表明，血清中TC水平的升高與TBI后腦損傷的程度成反比[29]。本研究中與TBI組相比，吸氫后TC水平明顯升高(P=0.052 2)，進一步說明腦損傷程度明顯降低。同時吸氫后HDL-C水平也升高，而LDL-C水平則有所下降，提示TC水平的升高可能是由于HDL-C的升高引起的。此外有研究表明，TBI患者血清中TG水平顯著升高[30]，而在本研究中，大鼠TBI后血清TG水平也明顯升高，吸氫后這種升高趨勢得到了明顯緩解。有研究認為，血清中的低水平UA可能是TBI預(yù)后良好的標(biāo)志[31]。本研究中與TBI組相比，吸氫后血清UA水平有降低趨勢，說明吸氫對TBI具有一定的保護作用。

綜上所述，本研究對大鼠TBI急性期外周血中的細胞因子進行了監(jiān)測，并通過吸入氫氣的方式進行干預(yù)，與以往的氫氣攝入方式有所不同[8-9]。結(jié)果表明吸入氫氣可以明顯抑制TBI后的急性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為7種促炎細胞因子血清水平的降低。同時，吸氫還可緩解TBI引起的心臟和肝臟標(biāo)志物的升高，提示吸氫對TBI引起的心臟和肝臟功能損傷也有很好的保護作用。本研究不僅為氫氣對TBI的神經(jīng)保護作用機理研究提供了很多新的線索，同時也為其在TBI臨床治療中的進一步應(yīng)用提供了更加堅實的理論基礎(chǔ)。