葉生小皮傘不同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)偏頭痛大鼠的抗炎、鎮(zhèn)痛作用

王 歡,婁 玲,步洪石,陳長(zhǎng)寶,*,王淑敏,*,李 玉

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林長(zhǎng)春 130117;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部食藥用菌工程研究中心,吉林長(zhǎng)春 130118)

偏頭痛是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)血管性疾患,這種疾病具有很強(qiáng)的遺傳背景[1],并導(dǎo)致頭痛、畏光、聲音恐懼癥等癥狀。這種疾病在20世紀(jì)時(shí)被認(rèn)為由血管引起的[2],全世界受偏頭痛困擾的人數(shù)日益增多。目前,偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中,以三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)在偏頭痛病理生理機(jī)制中占主導(dǎo)地位[3-4]。而偏頭痛的發(fā)生與一氧化氮(NO)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、多巴胺(dopamine,DA)等單胺類遞質(zhì)的水平密切相關(guān)[5-7]。在偏頭痛發(fā)作前期,血小板的5-HT釋放因子水平升高,使血小板釋放5-HT,血清中5-HT水平增加,引起顱內(nèi)血管收縮,引起偏頭痛先兆的前驅(qū)癥狀[8-9]。研究表明無(wú)先兆偏頭痛發(fā)作間歇期,DA水平明顯升高,發(fā)作期血小板去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)水平上升[10]。目前,臨床上的治療藥物有非甾體類抗炎藥、阿片類、曲普坦類、麥角類制劑;經(jīng)皮磁刺激、經(jīng)皮直流電刺激等非藥物治療[11]。但往往存在副作用,或效果不佳,因此急需開(kāi)發(fā)出有效、安全、耐受良好的新型治療藥物[12]。

硝酸甘油在體內(nèi)分解為一氧化氮(nitric oxide,NO),NO能激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶,使環(huán)鳥(niǎo)苷酸增高,使血管平滑肌和血管舒張,從而引起神經(jīng)性的炎癥反應(yīng),刺激神經(jīng)元,參與體內(nèi)疼痛感覺(jué)的傳遞,引發(fā)痛覺(jué)的發(fā)生[8]。因而本實(shí)驗(yàn)采用硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠模型,以大鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA,血清中炎癥因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及NO的含量作為衡量大鼠偏頭痛的指標(biāo)[13],研究了葉生小皮傘(Marasmiusepiphyllus)不同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛的作用,填補(bǔ)葉生小皮傘在藥理研究方面的空白,豐富小皮傘屬真菌的藥用資源,為偏頭痛新藥的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株ME-1 采自長(zhǎng)春凈月國(guó)家森林公園,經(jīng)組織分離純化得到,長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為葉生小皮傘(Marasmiusepiphyllus(Pers.)Fr.);SD大鼠(180～220 g) SPF級(jí),雄性,于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001;硝酸甘油注射液 河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司,批號(hào)A180310 G-2;鹽酸氟桂利嗪膠囊 吉林省七星山藥業(yè)有限公司,批號(hào)20170605;水合三氯乙醛 沈陽(yáng)市試劑三廠;生理鹽水注射液 遼寧民康制藥有限公司;Rat ELISA kit、一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA) 上海源葉生物技術(shù)公司。

ELX-800酶標(biāo)儀 濟(jì)南卓奧醫(yī)療器械有限公司;F6/10勻漿機(jī) 上海凈信科技;5417R冷凍離心機(jī) 德國(guó)eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵物提取物的制備 葉生小皮傘菌株ME-1經(jīng)固體發(fā)酵,發(fā)酵條件為薏米∶麥麩=2∶1,含水量為80%、接種塊數(shù)為6塊,自然pH,發(fā)酵溫度(27±1) ℃,發(fā)酵20 d,60 ℃烘干備用。固體發(fā)酵產(chǎn)物水提物(WESF):葉生小皮傘干燥固體發(fā)酵產(chǎn)物,粉碎,加10倍量的水煎煮提取30 min,取其濾液,再加8 倍量的水煎煮提取20 min,取其濾液,最后加6 倍量的水煎煮提取10 min,取其濾液,合并三次濾液,減壓濃縮、蒸干,備用。

葉生小皮傘菌株ME-1經(jīng)液體發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基為3%麥芽糖,2%酵母粉,0.15% KH2PO4,0.1% MgSO4·7H2O;發(fā)酵條件為:在溫度為(27±1) ℃,轉(zhuǎn)速為150 r/min,適宜的pH為5～6,最佳裝量為140 mL/500 mL,發(fā)酵天數(shù)為10 d,60 ℃烘干備用[14]。葉生小皮傘菌絲體水提物(WEM):將液體發(fā)酵后所得菌絲,加10倍量的水煎煮提取30 min,濾過(guò),殘?jiān)偌?倍量的水煎煮提取20 min,濾過(guò),殘?jiān)?倍量的水煎煮提取10 min,合并三次濾液,減壓濃縮,蒸干,備用。葉生小皮傘發(fā)酵液(LFP):將液體發(fā)酵后的所得的發(fā)酵液,減壓濃縮,干燥至恒重。

1.2.2 造模、分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)后,將SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)等分成9組,每組10只,空白對(duì)照組:生理鹽水1 mL/100 g;模型對(duì)照組:生理鹽水1 mL/100 g;陽(yáng)性藥組(鹽酸氟桂利嗪flunarizine hydrochloride 1.2 mg/kg);葉生小皮傘固體發(fā)酵物水提物低劑量組(WESF 200 mg/kg);固體發(fā)酵物水提物高劑量組(WESF 400 mg/kg);菌絲體水提物低劑量組(WEM 200 mg/kg);菌絲體水提物高劑量組(WEM 400 mg/kg);發(fā)酵液低劑量組(LFP 200 mg/kg);發(fā)酵液高劑量組(LFP 400 mg/kg),各組連續(xù)灌胃給藥7 d,末次給藥前12 h,禁食不禁水。最后一次給藥1 h后,除空白組皮下給與同樣體積的生理鹽水外,模型組皮下給予硝酸甘油注射液(10 mg/kg)[15-17]。造模30 min后,觀察大鼠行為,觀察頻繁撓頭、雙耳發(fā)紅、爬籠情況等現(xiàn)象,判斷造模是否成功[18-19]。

1.2.3 腦組織中5-HT、NE、DA含量測(cè)定 取血后,迅速將活體大鼠在冰盤上斷頭,解剖大鼠頭部,并完整取出腦,迅速將大腦、小腦、腦干進(jìn)行分離,并迅速放入冰盒中,待剝離出完整的腦干組織后,制成10%組織勻漿液,用于測(cè)定腦組織中5-HT、NE、DA的含量。

1.2.4 血清中NO、IL-6、IL-β含量測(cè)定 在給予造模藥后開(kāi)始計(jì)時(shí),計(jì)時(shí)4 h后,將大鼠進(jìn)行統(tǒng)一處理,腹腔給予10%水合三氯乙醛(0.06 mL/kg)用來(lái)將大鼠麻醉,用血管及采血針對(duì)麻醉好的大鼠用進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血,采血后將采血管靜置2 h,在4 ℃的高速冷凍離心機(jī)內(nèi)低溫離心10 min(3500 r/min),取上清用于NO、IL-6、IL-1β含量測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠搔頭反應(yīng)的影響

由表1可看出,與空白對(duì)照組相比,模型組大鼠的搔頭次數(shù)顯著增加(P<0.001)。與模型組相比,WESF高劑量組、WEM高劑量組及LFP低、高劑量組大鼠的搔頭次數(shù)顯著減少(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且LFP高劑量組大鼠搔頭次數(shù)抑制率最高,可達(dá)52.6%。

表1 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠搔頭反應(yīng)的影響

2.2 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠腦組織中血管活性物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA水平的影響

2.2.1 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠腦組織中5-HT水平的影響 NO、5-HT、DA等單胺類遞質(zhì)與偏頭痛的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。偏頭痛發(fā)作前,血漿中5-HT水平急劇升高,顱內(nèi)血管收縮,偏頭痛發(fā)作時(shí),5-HT被單胺氧化酶A迅速代謝為 5-HIAA,引起血管病理性擴(kuò)張性頭痛[20-21]。

從圖1可以看出,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠腦組織中5-HT的水平顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組和WESF低、高劑量組、WEM低、高劑量組、LFP低、高劑量組大鼠腦組織中5-HT水平均顯著升高(P<0.001),且各給藥組之間無(wú)顯著差異,說(shuō)明葉生小皮傘發(fā)酵產(chǎn)物可有效提高偏頭痛發(fā)作時(shí)血管活性物質(zhì)5-HT的含量,減輕血管擴(kuò)張引起的偏頭痛。

圖1 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠腦組織中5-HT水平的影響

2.2.2 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠腦組織中NE水平的影響 神經(jīng)遞質(zhì)DA和NE的水平與偏頭痛有著密切的聯(lián)系,腦血管活動(dòng)受中樞DA能神經(jīng)末梢支配。NE和DA代謝紊亂會(huì)加劇偏頭痛的發(fā)展[22]。從圖2可看出,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠腦組織中NE的水平顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組和WESF低、高劑量組、WEM低、高劑量組、LFP低、高劑量組大鼠腦組織中NE水平均顯著升高(P<0.001,P<0.05),且各組之間無(wú)顯著差異,說(shuō)明葉生小皮傘發(fā)酵產(chǎn)物可以促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)NE的分泌。

圖2 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠腦組織中NE水平的影響

2.2.3 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠腦組織中DA水平的影響 從圖3可看出,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠腦組織中DA的水平顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組和WESF低、高劑量組、WEM低、高劑量組、LFP低、高劑量組大鼠腦組織中DA水平均顯著升高(P<0.01,P<0.001),其中WEM對(duì)DA水平的影響最大,LFP次之,WESF影響相對(duì)最低,說(shuō)明不同的發(fā)酵方式及提取方法對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA的分泌有著很大的影響,本研究中菌絲體水提物對(duì)DA的分泌具有很好的促進(jìn)作用。

圖3 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠腦組織中DA水平的影響

2.3 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠血清中NO水平的影響

NO具有神經(jīng)毒性,還可使環(huán)鳥(niǎo)苷酸增高,使血管平滑肌和血管舒張,從而引起神經(jīng)性的炎癥反應(yīng),引發(fā)痛覺(jué)的發(fā)生。從圖4可看出,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中NO的水平顯著升高(P<0.001)。與模型組比較,除WESF低劑量組、WEM低劑量組外,陽(yáng)性藥組和WESF高劑量組、WEM高劑量組、LFP低、高劑量組大鼠血清中NO水平均顯著降低(P<0.05,P<0.001),葉生小皮傘發(fā)酵物可有效降低血清中NO的水平,緩解神經(jīng)炎癥及疼痛。

圖4 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠血清中NO水平的影響

2.4 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠血清中IL-6和IL-1β水平的影響

2.4.1 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠血清中IL-6水平的影響 研究表明,腦膜血管擴(kuò)張及炎癥反應(yīng)是偏頭痛發(fā)病機(jī)制中的重要因素,IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要因素[23]。從圖5可看出,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中IL-6的水平顯著升高(P<0.001)。與模型組比較,除WEM低劑量組、LFP低劑量組外,陽(yáng)性藥組和WESF低、高劑量組、WEM高劑量組、LFP高劑量組大鼠血清中IL-6水平均顯著降低(P<0.05,P<0.001),且各給藥組無(wú)顯著差異。

圖5 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠血清中IL-6水平的影響

2.4.2 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠血清中IL-1β水平的影響 從圖6可看出,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中IL-1β的水平顯著升高(P<0.001)。與模型組比較,除LFP高劑量組外,陽(yáng)性藥組和WESF低、高劑量組、WEM低、高劑量組、LFP低劑量組大鼠血清中IL-1β水平均顯著升高(P<0.05,P<0.001),各給藥組無(wú)顯著差異,這說(shuō)明用葉生小皮傘菌發(fā)酵提取物治療后,可顯著降低炎癥反應(yīng)。

圖6 葉生小皮傘對(duì)偏頭痛大鼠血清中IL-1β水平的影響

綜上所述,葉生小皮傘不同發(fā)酵方式及提取方法對(duì)實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠腦組織中血管活性物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA水平均有顯著的影響,對(duì)5-HT及NE水平的影響,各組無(wú)顯著差異,而對(duì)DA的分泌,WEM具有良好的促進(jìn)作用,效果優(yōu)于其他給藥組。而WESF高劑量組對(duì)偏頭痛大鼠血清中IL-6、IL-1β和NO水平顯示出較好的抑制作用。

3 結(jié)論

偏頭痛是一種與5-HT和DA及其受體有關(guān)的神經(jīng)血管疾病[24],血清素(5-HT)及其受體在偏頭痛的發(fā)作期和間歇期起著重要作用[25]。在偏頭痛發(fā)作時(shí),5-HT的代謝物5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)在尿液中增加,血中5-HT濃度降低,5-HT的降低可引起血管擴(kuò)張性疼痛以及頭皮血管反彈[26]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),NO在偏頭痛中起到極為重要的作用,是引發(fā)頭痛發(fā)生和發(fā)展的始動(dòng)因子[27],導(dǎo)致血管擴(kuò)張,也可通過(guò)激活三叉神經(jīng)末梢釋放CGRP誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)引起偏頭痛[20],釋放IL-1β、IL-6等炎癥因子。

本文初步研究了葉生小皮傘不同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)偏頭痛大鼠的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。研究結(jié)果表明,與模型組相比,給藥組可以顯著降低血清中NO含量,進(jìn)而減輕血管擴(kuò)張,緩解偏頭痛。葉生小皮傘不同發(fā)酵物可顯著(P<0.05,P<0.001)降低偏頭痛大鼠血清中炎癥因子IL-1β和IL-6的水平,減輕神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。同時(shí),與模型組相比,葉生小皮傘各給藥組可顯著(P<0.05,P<0.001)提高下丘腦組織中5-HT、NE、DA的水平。說(shuō)明葉生小皮傘發(fā)酵產(chǎn)物可調(diào)節(jié)血管收縮及機(jī)體的神經(jīng)遞質(zhì)分泌,抑制傷害感受信息的傳遞,對(duì)偏頭痛大鼠具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用,具有開(kāi)發(fā)新藥的可能,為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、利用提供理論依據(jù)。