牛乳中常見(jiàn)熱敏性生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展

扶曉菲，邢倩倩，游春蘋(píng)

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海200436）

0 引 言

牛乳，尤其是牛初乳，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富并與人乳組成相似，是一種來(lái)源天然且經(jīng)濟(jì)高效的滋補(bǔ)食品[1]。除乳糖，蛋白質(zhì)（主要是酪蛋白、乳清蛋白），乳脂肪，礦物質(zhì)（如鈣、鐵），維生素等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)素外，牛乳中還存在諸多生物活性物質(zhì)，例如β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）、α-乳白蛋白(α-lactoalbumin, α-La)、乳鐵蛋白(Lactoferrin, Lf) 、免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig)、乳過(guò)氧化物酶(lactoperoxidase, LPO)、溶菌酶(Lysozyme, LZM)、酪蛋白源和乳清蛋白源的生物活性肽，不飽和脂肪酸，如亞油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)、反式脂肪酸(Trans fatty acids , TFA)、激素（如褪黑素）及細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素）等，這些生物活性物質(zhì)的攝入對(duì)人體健康有益，在抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化，防控慢性病、調(diào)節(jié)免疫等方面均發(fā)揮潛在價(jià)值[2]。特別是在兒童常見(jiàn)傳染性疾病的日常防控中，牛乳及其發(fā)酵乳制品也一直被備受推崇，牛奶等高蛋白食物的攝入對(duì)于提高免疫力而言是必要的[3]。

對(duì)生牛乳進(jìn)行適度的熱處理，有助于殺滅牛乳中的致病微生物，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。但過(guò)度的熱處理，則會(huì)導(dǎo)致牛乳中乳糖結(jié)構(gòu)改變，蛋白質(zhì)變性，β-Lg、α-La、Lf、Ig、LPO、LZM 等活性物質(zhì)失活，甚至可能產(chǎn)生通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生糠氨酸、糠醛類(lèi)化合物、糖基化終產(chǎn)物等有害物質(zhì)，既改變了乳品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，也影響了產(chǎn)品的品質(zhì)[4]。一般生牛乳經(jīng)均質(zhì)（65 ℃）、升溫后進(jìn)入殺菌階段，較為多見(jiàn)的4 類(lèi)分別是：低溫長(zhǎng)時(shí)（Low temperature long time, LTLT）巴氏 殺 菌（61.1～65.6 ℃, 30 min），高溫短時(shí)（High temperature short time, HTST）巴氏殺菌（75～85 ℃, 15 s），超巴氏殺菌（125～138 ℃, 2 s）和超高溫滅菌（Ultra high-temperature sterilized, UHT, 135～140 ℃ , 4 s），也有經(jīng)包裝后再滅菌（115～120 ℃，20～30 min）[5]得到商業(yè)無(wú)菌產(chǎn)品。牛乳中很多生物活性物質(zhì)是熱敏性的，不同的熱處理方式對(duì)生物活性物質(zhì)的影響大不相同，既有報(bào)道指出均質(zhì)化處理提高了乳清蛋白的乳化穩(wěn)定性，巴氏殺菌在有效殺菌的同時(shí)對(duì)活性物質(zhì)影響有限，而超高溫滅菌則對(duì)活性物質(zhì)的保留相對(duì)不利，因此這些生物活性物質(zhì)具備成為牛乳熱損指標(biāo)來(lái)衡量乳品質(zhì)量的潛力[6-7]。本文歸納了牛乳熱敏性的生物活性物質(zhì)的常見(jiàn)生理功能，探究不同熱處理方式對(duì)其產(chǎn)生的影響，嘗試為牛乳熱敏指標(biāo)的篩選和牛乳加工工藝優(yōu)化及乳品質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的完善作出理論參考。

1 常見(jiàn)生物活性物質(zhì)及其功能特性

1.1 活性蛋白及常見(jiàn)酶類(lèi)

酪蛋白和乳清蛋白是牛乳中主要的蛋白，pH 為4.6 時(shí)，不溶性酪蛋白約占80%，熱變性溫度范圍約為160～200 ℃，在常見(jiàn)的幾種熱處理溫度下相對(duì)穩(wěn)定[8]。而可溶性的乳清蛋白則約占乳蛋白的20%，但更具熱敏性，其中牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)在牛初乳及常乳中均少量存在，本文不再過(guò)多討論BSA[9]。乳清蛋白又包含β-Lg、α-La、Lf、Ig 等具有生物活性的乳蛋白，以及與之相互作用的LPO 及LZM等，乳清蛋白多自65 ℃起開(kāi)始變性，變性率與溫度正相關(guān)，變性后的乳清蛋白之間，乳清蛋白與酪蛋白膠束也會(huì)發(fā)生熱凝聚，進(jìn)而影響牛乳品質(zhì)和功能特性[10-11]。

β-Lg 和α-La 是牛乳清蛋白的主要成分，β-Lg 常與脂肪酸或維生素等疏水性配體結(jié)合而具備營(yíng)養(yǎng)特性，其他功能特性尚未完全明確，可能與輸送脂肪酸至腸細(xì)胞有關(guān)[12]。一項(xiàng)針對(duì)白藜蘆醇的功能特性改進(jìn)的研究指出，在巴氏殺菌的加工工藝條件下，白藜蘆醇和β-Lg 的相互作用，顯示出了β-Lg 對(duì)白藜蘆醇熱損傷導(dǎo)致的化學(xué)變化的保護(hù)作用，進(jìn)而表現(xiàn)出提高其的抗氧化性和熱穩(wěn)定性[13]。α-La 則具有最佳的氨基酸配比，作為一種色氨酸含量最為豐富的乳清蛋白，在抗氧化、提升認(rèn)知，改善癲癇具有明顯作用，它在牛乳和人乳中的含量存在差異，因此也被運(yùn)用到嬰兒配方食品中來(lái)保證嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育[14-15]。

Lf 和Ig 是牛乳兩類(lèi)主要的生物活性物質(zhì)，Lf 是一種與鐵離子結(jié)合的多功能乳活性蛋白，最初于1939 年被發(fā)現(xiàn)且在牛初乳中較為豐富的存在，乳鐵蛋白的功能特性有抗菌抗炎、參與局部免疫以及與Ig 發(fā)揮協(xié)同作用[16]。此外，Svetlana[17]等也首次在7 只不同品種的乳牛中分離并證實(shí)了在Lf 具備過(guò)氧化物酶、蛋白酶、磷酸酶等催化活性。常見(jiàn)Ig 種類(lèi)有IgG、IgM、IgA、IgD 及 IgE 5 種，其中 IgA 是人乳中主要免疫蛋白，Ig 作為牛乳中關(guān)鍵抗菌蛋白，在免疫防御機(jī)制中不可或缺[18-19]。報(bào)道指出，Lf 和Ig 類(lèi)乳抗菌蛋白的水平直接影響著乳牛對(duì)乳腺炎的易感性，進(jìn)而可能影響牛乳品質(zhì)及貨架期[20]。

LPO 是牛乳抗菌系統(tǒng)中含量最高的基礎(chǔ)酶之一，借助乳過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的硫氰酸鹽和H2O2，催化多類(lèi)微生物失活，由于其廣泛的抗菌性能而對(duì)免疫系統(tǒng)具有保護(hù)作用，并在延長(zhǎng)乳品貨架期壽命存在潛在應(yīng)用前景[21-22]。例如Manabu 等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較單獨(dú)作用組，LPO 和Lf 的聯(lián)合使用在改變白念珠菌的細(xì)胞活性和菌絲形態(tài)中都更加顯著，并展現(xiàn)出了良好的協(xié)同抗菌活性[23-24]。當(dāng)然，LZM 作為可與免疫球蛋白和乳鐵蛋白發(fā)生協(xié)同作用的酶蛋白，也對(duì)多種細(xì)菌表現(xiàn)出抗菌活性[25]。除了牛乳，人體口腔及淚液中也檢測(cè)到LPO 和LZM，一項(xiàng)針對(duì)老年人口腔微生物群的研究表明，牙菌斑中革蘭氏陰性菌數(shù)量在經(jīng)干預(yù)后顯著減少，提示了LPO 和LZM 添加至口腔衛(wèi)生制劑用于口腔健康管理的潛在意義[26]。

根據(jù)溶解度歸納得到的乳活性蛋白一般變性順序是ALAC、β-Lg、Ig，但也在其他報(bào)道中見(jiàn)到不同熱敏性大小排序，如Ig、β-Lg、α-La，既有報(bào)道關(guān)于常見(jiàn)活性物質(zhì)及功能特性詳見(jiàn)表1[4]。此外，牛乳中的生物活性物質(zhì)也會(huì)在熱處理過(guò)程中發(fā)生乳清蛋白之間、乳清蛋白與酪蛋白、乳清蛋白與乳糖的相互結(jié)合及凝集，因此對(duì)牛乳熱敏性生物活性物質(zhì)的充分研究，有利于充分保留熱處理過(guò)程中的活性物質(zhì)，從而進(jìn)一步拓展乳清蛋白在功能性食品配料中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用[10,27]。

1.2 生物活性肽

酪蛋白和乳清蛋白經(jīng)水解得到的各類(lèi)生物活性肽是近些年來(lái)備受關(guān)注的又一大類(lèi)生物活性物質(zhì)，其中以免疫活性肽、降血壓肽、抗血凝肽等為代表的的酪蛋白生物活性肽來(lái)源最為豐富和廣泛，此外還包括Ig、Lf 在內(nèi)的其他乳清蛋白源抗菌肽等[28]。這些乳源性生物活性肽經(jīng)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)中表現(xiàn)出提高天然免疫、抗氧化抗菌、防控動(dòng)脈粥樣硬化等慢性疾病的潛在價(jià)值，乳蛋白衍生肽也逐漸成為功能性食品和藥物的研發(fā)方向[29-30]。

酪蛋白源生物活性肽研究領(lǐng)域多聚焦于4 個(gè)方面：（1）抗菌活性、是有效的細(xì)菌抑制劑；（2）免疫調(diào)節(jié)作用，例如酪蛋白水解物對(duì)人體T 細(xì)胞具有抗炎作用，可降低促炎核心細(xì)胞因子IL-6的釋放；（3）降血壓作用，作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑來(lái)發(fā)揮作用；（4）促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，經(jīng)水解的多肽表現(xiàn)出顯著的增殖效應(yīng)[31-33]。除此之外，還包括促進(jìn)鐵鈣鋅等礦物質(zhì)吸收、影響神經(jīng)放松以及抵抗細(xì)胞凋亡等潛在功能特性，酪蛋白源生物活性肽的生物活性受水解作用后生成肽的大小和序列影響[32,34]。

表1 常見(jiàn)的活性物質(zhì)及功能特性

乳清蛋白源生物活性肽同樣表現(xiàn)出諸多類(lèi)似的生理功能[28]。由于抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和二肽基肽酶是治療糖尿病和高血壓的有效途徑，Lacroix 等[35]借助體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳清蛋白水解物表現(xiàn)出了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和二肽基肽酶的抑制活性，且對(duì)前者的抑制作用更為明顯，體現(xiàn)了乳清蛋白源生物活性肽的藥物應(yīng)用潛力。Lf 對(duì)糞腸球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等一系列細(xì)菌和真菌產(chǎn)生抗菌作用，而以Lf 為前體經(jīng)胃蛋白酶水解生成后的乳源生物活性小肽，抗菌活性更強(qiáng)[28,36]。

1.3 乳脂類(lèi)及其他

除乳活性蛋白和生物活性肽外，牛乳中的一些其他活性物質(zhì)也同樣作為調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體內(nèi)表達(dá)生理功能。例如激素、多種生長(zhǎng)因子，不飽和脂肪酸（CLA、TFA）、細(xì)胞因子、核苷和核苷酸等。乳脂類(lèi)中典型的活性物質(zhì)是CLA 和TFA，二者含量變化呈現(xiàn)正相關(guān)性，CLA 被報(bào)道具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗癌等特性，但尚有待更多的研究佐證，乳脂肪中還含有許多必需氨基酸以及神經(jīng)鞘磷脂等脂類(lèi)，均參與多種生化反應(yīng)，并在人體心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮積極作用[37]。牛乳中激素含量不高但種類(lèi)豐富，常提及的有雌激素、褪黑素以及由垂體、腺體分泌的各類(lèi)激素，具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等作用，例如對(duì)于不能分泌褪黑素的嬰兒而言，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素增補(bǔ)具有改善嬰兒的睡眠和減少嬰兒絞痛的潛在效果，當(dāng)然激素也可以協(xié)同各類(lèi)生長(zhǎng)因子來(lái)表達(dá)特定性能[38-39]。Yuen 等[40]指出胰島素樣生長(zhǎng)因子-I 具有類(lèi)胰島素的特性，在諸如糖尿病等類(lèi)型的胰島素敏感性的防治中具有應(yīng)用前景。

2 熱處理對(duì)生物活性物質(zhì)的影響

熱處理導(dǎo)致的活性物質(zhì)的改變主要體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)兩方面的改變，本節(jié)主要從均質(zhì)、巴氏殺菌、超高溫瞬時(shí)滅菌、熱噴霧干燥4 個(gè)典型熱處理工藝考量活性物質(zhì)的改變。熱加工過(guò)程中，牛乳中發(fā)生的一系列變化包括乳清蛋白變性及相互熱凝聚（如α-La 和β-Lg 之間）、酪蛋白與乳清蛋白通過(guò)疏水鍵或氫鍵聚集并隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步加強(qiáng)、乳糖和蛋白的相互作用導(dǎo)致美拉德褐變、巰基化合物及不溶性物質(zhì)形成[41]。既有文獻(xiàn)報(bào)道中常見(jiàn)熱處理工藝導(dǎo)致的活性物質(zhì)熱損詳見(jiàn)表2。

2.1 均質(zhì)

均質(zhì)是乳品加工過(guò)程中必不可少的工藝之一，其目的是得到合適粒徑的乳脂肪球，充分乳化牛乳體系并使之穩(wěn)定，65 ℃、20 MPa是一個(gè)理想的均質(zhì)工藝參數(shù)，一般的預(yù)熱和均質(zhì)條件下僅少數(shù)乳清蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即少數(shù)蛋白變性，無(wú)需擔(dān)心過(guò)度均質(zhì)對(duì)健康產(chǎn)生不利影響，均質(zhì)熱損害的相關(guān)報(bào)道并不多見(jiàn)[42-43]。值得一提的是，Pereda 等[44]通過(guò)比較經(jīng)超高壓均 質(zhì)（200～300 MPa，30～40 ℃）和高 溫巴 氏殺 菌（90 ℃, 15 s）兩種殺菌工藝得到的奶樣中變性β-Lg和340 nm 的吸光度值，證實(shí)前者作為一種非熱或低熱處理工藝，其對(duì)牛奶中生物活性物質(zhì)的熱損害更小，提出了超高壓均質(zhì)技術(shù)代替高溫巴氏殺菌技術(shù)的可能性。類(lèi)似的，一項(xiàng)研究超高壓均質(zhì)工藝對(duì)乳過(guò)氧化物酶體系影響的研究也指出，LPO 對(duì)超高壓均質(zhì)表現(xiàn)出耐熱性，即在100 ～250 MPa 的壓力下，觀察到酶活性增加約20%，而當(dāng)壓力升為300 MPa 時(shí)，酶活性減少約30%[45]。

2.2 巴氏殺菌

傳統(tǒng)的熱巴氏殺菌有2 種類(lèi)型，LTLT 巴氏殺菌和HTST 巴氏殺菌，熱巴氏殺菌對(duì)牛乳中各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)和活性物質(zhì)具有不同程度的影響。整體可歸納如下，（1）酪蛋白膠束直徑與熱加工溫度呈正相關(guān)，并可與變性的乳清蛋白相互作用[4]；（2）Ig 對(duì)溫度變化最為敏感，IgG、IgA、IgM的熱穩(wěn)定性呈遞減趨勢(shì)，IgG在pH為5.5 時(shí)變性最快，酸介質(zhì)可能對(duì)IgG 變性影響最小[46]；（3）乳清蛋白中β-Lg 對(duì)溫度變化敏感，72～75 ℃左右開(kāi)始去折疊化，暴露巰基的同時(shí)伴隨著或輕或重的蒸煮味道[9]；（4）α-La 是一種金屬結(jié)合蛋白，熱敏性較β-Lg 弱，經(jīng)78 ～94 ℃的熱處理，熱損失程度隨溫度和處理時(shí)間的增加而增加，油酸可能通過(guò)改變?chǔ)?La的三級(jí)結(jié)構(gòu)而對(duì)該蛋白的活性產(chǎn)生影響[47]；（5）LPO的變性終點(diǎn)溫度為85 ℃，因此可以作為衡量殺菌強(qiáng)度的熱敏性指標(biāo)[4]；（6）巴氏殺菌過(guò)程一定程度上也會(huì)影響Lf，變性趨勢(shì)與Ig 較為接近，容易受溫度和pH 的影響，當(dāng) pH 為 5.5 時(shí)牛乳熱損率最高，Wakabayashi 等人也補(bǔ)充報(bào)道了在pH 為4，90～100 ℃熱處理?xiàng)l件下Lf相對(duì)穩(wěn)定[46]，Lf作為一種糖基化蛋白，與之結(jié)合的特異聚糖的主要結(jié)構(gòu)也決定了其熱穩(wěn)定性；（7）對(duì)比發(fā)現(xiàn)，LTLT 巴氏殺菌較 HTST 巴氏殺菌對(duì)β-Lg 和α-La 兩類(lèi)蛋白的熱損傷小[9]。另外一項(xiàng)比較微波巴氏殺菌和傳統(tǒng)巴氏殺菌的研究，也報(bào)道了80 ℃的高溫條件下，仍可以在經(jīng)微波殺菌的奶樣檢測(cè)到過(guò)氧化物酶的酶活[48]。

2.3 超高溫瞬時(shí)滅菌

超高溫瞬時(shí)滅菌處理工藝對(duì)活性物質(zhì)的熱損程度要高于巴氏殺菌，多數(shù)常見(jiàn)活性物質(zhì)熱損率高，熱變性明顯。具體表現(xiàn)為：（1）酪蛋白膠束直徑繼續(xù)擴(kuò)大[4]；（2）乳清蛋白在不同溫度下的變性程度各不相同，一般認(rèn)為乳清蛋白在60 ℃或65 ℃起開(kāi)始少量變性，在85 ℃或95 ℃就已完全變性，但也有報(bào)道指出α-La 相對(duì)而言較為耐熱，有時(shí)在超高溫滅菌條件下仍可少量存在，其他乳清蛋白如Ig，Lf 在超高溫條件下熱變性報(bào)道不多見(jiàn)，這可能與乳清蛋白在高溫下完全變性有關(guān)[4,49]；（3）Datta 等[41]歸納前人關(guān)于超高溫處理工藝的報(bào)道中提及，相較間接加工，直接加工方式更有利于保留牛乳中非變性的β-Lg。此外也有研究指出，保溫時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)的二次滅菌工藝，盡管熱處理溫度稍低于超高溫滅菌，該工藝對(duì)牛乳品質(zhì)造成的過(guò)度褐變等不良影響更甚，因此需要綜合考慮溫度和時(shí)間兩因素對(duì)活性物質(zhì)保留的不同影響[8]。

表2 常見(jiàn)熱處理工藝導(dǎo)致的活性蛋白熱損傷 %

2.4 熱噴霧干燥

嬰幼兒配方奶粉常見(jiàn)有濕法、干法、干濕復(fù)合3 種加工工藝，熱噴霧干燥一種常見(jiàn)的濕法乳粉最常見(jiàn)加工過(guò)程之一，通過(guò)霧化液體物料蒸發(fā)水分來(lái)生產(chǎn)乳粉，熱處理溫相對(duì)較高可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，但由于噴霧干燥通常發(fā)生在數(shù)秒內(nèi)，產(chǎn)生的熱損害相對(duì)有限[50]。一項(xiàng)經(jīng) 130、160、190 ℃ 3 種不同噴霧干燥溫度來(lái)探究的其對(duì)乳清蛋白變性率的研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)噴霧干燥前濃縮液的乳清蛋白變性率，3 種加工溫度均未對(duì)乳清蛋白變性率產(chǎn)生顯著性影響，尤其是β-Lg[51]。溶解性是乳清蛋白功能行為的一個(gè)重要性質(zhì)，蛋白質(zhì)變性及聚集是乳清蛋白溶解度降低的先決條件，進(jìn)而也會(huì)影響牛乳的加工特性特性。另一項(xiàng)研究乳清蛋白經(jīng)噴霧干燥后溶解度差異的研究表明，低出風(fēng)溫度(60～80 ℃)下的α-La 和β-Lg 溶解度沒(méi)有顯著影響，但在高出風(fēng)溫度(100～120 ℃)下，二者溶解度有顯著下降，且β-Lg 的溶解度損失明顯高于α-La[52]。此外，wang 等[53]也證實(shí)了與液態(tài)Lf 物料相比，噴霧干燥后制備的牛乳鐵蛋白粉中粉體變性程度和構(gòu)象變化可忽略不計(jì)。

3 結(jié) 論

乳生物活性物質(zhì)種類(lèi)豐富，功能特性諸多，目前已借助許多體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抗菌、抗炎、防治慢性疾病等潛在生理功能。根據(jù)既有報(bào)道，牛乳中豐富的活性物質(zhì)作為潛在新型功能性原料，在嬰兒配方奶粉等功能性乳制品和保健食品、口腔衛(wèi)生制劑及慢性疾病防治藥物中展現(xiàn)應(yīng)用前景，但實(shí)際應(yīng)用相對(duì)有限，值得進(jìn)一步推進(jìn)臨床實(shí)驗(yàn)，深入探究乳活性物質(zhì)在人體健康方面的應(yīng)用價(jià)值。

相對(duì)于酪蛋白，牛乳中的乳清蛋白，尤其是β-Lg、α-La 對(duì)熱處理方式更為敏感，可以作為熱敏性指標(biāo)來(lái)反推乳品加工強(qiáng)度和品質(zhì)，衡量牛乳熱處理強(qiáng)度的熱敏性指標(biāo)及乳制品質(zhì)量安全評(píng)價(jià)指標(biāo)需要進(jìn)一步明確和完善。理想的牛乳熱處理方式需要平衡好貨架期和生物活性物質(zhì)保留這兩大因素，已有報(bào)道證實(shí)巴氏殺菌工藝活性蛋白熱損相對(duì)較低，較為適宜，而近年來(lái)的報(bào)道指出了蒸汽注入式加工工藝在活性蛋白熱損傷中展現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)，此外諸如超聲波、微波處理等熱替代性殺菌工藝的研究也有待進(jìn)一步探討和應(yīng)用。