CO2氣腹對結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖侵襲能力的影響

雷 宇 陳永軍 黃 俊 趙 波 蔡小勇

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科，廣西南寧市 530007)

1991年Jacobs等成功實(shí)施了世界首例腹腔鏡乙狀結(jié)腸切除術(shù)[1]，隨著腹腔鏡技術(shù)和設(shè)備的不斷發(fā)展，腹腔鏡結(jié)直腸癌切除術(shù)的應(yīng)用亦越來越廣泛，然而腹腔鏡手術(shù)是否增加惡性腫瘤的侵襲能力仍存在爭議[2]。有研究顯示，腹腔鏡手術(shù)所需的氣腹不僅改變了腹腔的原有壓力，同時高濃度CO2也改變了結(jié)直腸癌細(xì)胞原有的生存環(huán)境，提高了腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的能力，同時氣腹介質(zhì)是導(dǎo)致癌細(xì)胞經(jīng)trocar切口轉(zhuǎn)移的重要因素，CO2可增加癌細(xì)胞經(jīng)trocar切口轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，而氦氣可減少癌細(xì)胞經(jīng)trocar切口的轉(zhuǎn)移[3-4]。本研究通過模擬腹腔鏡CO2氣腹環(huán)境，探討CO2氣腹的壓力與結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29生長及侵襲能力的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 腸癌細(xì)胞株的選擇：選取人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29，放置在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，48 h換液1次，換液均在弱光條件下進(jìn)行操作，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體的選擇：鼠抗人E-cadherin單克隆抗體及通用型二抗，購于長島公司。實(shí)驗(yàn)動物的選擇：擇取6～7周齡雌性裸鼠60只，體重(20±2)g，購于上海市腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動物部。將60只裸鼠按隨機(jī)化原則分為0 mmHg組、5 mmHg組、10 mmHg組和15 mmHg組4組，每組15只。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29培養(yǎng)液pH值 取對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29，用PBS緩沖液漂洗，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，重懸后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，分別取1.0 mL加入24孔培養(yǎng)板中，置于5 mmHg、10 mmHg、15 mmHg的壓力箱中，維持孵育時間3 h后排氣，繼續(xù)放在與0 mmHg組相同的環(huán)境中(37 ℃、5% CO2飽和濕度)培養(yǎng)。分別于處置前和處置后0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h取各組培養(yǎng)液用電子pH計(jì)測定pH值。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測 按上述方法取對數(shù)生長期結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29分別在0 mmHg、5 mmHg、10 mmHg、15 mmHg CO2氣腹壓力下作用3 h，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，結(jié)直腸癌細(xì)胞株通過高速離心、涂片、固定，然后以蘇木素染色檢測E-cadherin水平。

1.2.3 裸鼠氣腹模型的建立 各組裸鼠腹部皮膚均用0.3%碘伏消毒，1 mL皮試針頭腹腔內(nèi)接種結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29懸液0.2 mL，每只裸鼠注射細(xì)胞量約為5×105個，選用濃度為99.5%的醫(yī)用CO2建立氣腹。將HT-29細(xì)胞株分為4組，分別于5 mmHg、10 mmHg及15 mmHg CO2氣腹中及免氣腹(5% CO2、37 ℃)孵育，均維持1 h。實(shí)驗(yàn)完畢，各組裸鼠腹腔注射4 000 U/mL青霉素稀釋液0.2 mL抗感染。給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食物、自由飲水，所有裸鼠每周稱重，觀察裸鼠精神、覓食情況及腹壁腫瘤出現(xiàn)時間和腫瘤大小。30 d后，用頸椎脫臼法處死小鼠。

1.3 觀察指標(biāo) 處死后的裸鼠縱行剖開腹腔，觀察成瘤裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量(直徑>1 mm納入計(jì)數(shù))，剖檢腹腔后，見腹腔內(nèi)無明顯腹水，依次查找腹腔器官。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織后盡量完整分離，去除周圍結(jié)締組織，稱重比較各組瘤體的平均重量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，不同時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用重復(fù)測量資料的方差分析；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分率[n(%)]表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同CO2氣壓環(huán)境對結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29培養(yǎng)液pH值的影響 處理前，各組培養(yǎng)液pH值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理后0 h、0.5 h、1 h，5 mmHg組、10 mmHg組、15 mmHg組細(xì)胞培養(yǎng)液pH值均低于0 mmHg組(均P<0.05)；處理后2 h，10 mmHg組、15 mmHg組pH值低于0 mmHg組和5 mmHg組(P<0.05)，而0 mmHg組和5 mmHg組pH值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；處理后3 h，15 mmHg組pH值明顯低于0 mmHg組(P<0.05)，其余各組pH值兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29培養(yǎng)液pH值比較 (x±s)

2.2 裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤增殖情況 腹腔內(nèi)腫瘤生長情況顯示腫瘤結(jié)節(jié)最易生長部位為腹壁的壁腹膜。隨著氣腹壓力增高，腫瘤種植數(shù)量明顯增多，腫瘤質(zhì)量顯著增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤增殖情況比較

2.3 不同CO2氣腹壓力對結(jié)直腸癌組織中E-cadherin表達(dá)的影響 各組E-cadherin陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組裸鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29在不同氣腹壓力下E-cadherin表達(dá)情況

3 討 論

腹腔是由臟壁腹膜包繞的一個密閉腔隙，pH值為弱堿性。在腹腔鏡結(jié)直腸癌手術(shù)中我們使用干燥、高濃度、溫度為21 ℃的CO2氣體注入腹腔制造氣腹后會導(dǎo)致一系列微環(huán)境的改變。氣腹會導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時會增加脫落腫瘤細(xì)胞黏附和擴(kuò)散的機(jī)會[5]。CO2氣體有組織低溶性、血液高溶性的物理特征，容易改變微環(huán)境的酸堿度，對細(xì)胞的生理代謝功能有干擾作用。Kuntz等[6]研究認(rèn)為酸性環(huán)境中，腹腔內(nèi)局部血供減少同時增加了血管通透性，可能CO2氣腹由此促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生長與種植[6]。我們構(gòu)建的體外模擬腹腔鏡在不同CO2氣腹壓力下暴露3 h，發(fā)現(xiàn)處置后0 h、0.5 h、1 h，5 mmHg組、10 mmHg組、15mmHg組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞培養(yǎng)液pH值與0 mmHg組相比下降明顯，而且氣腹壓力越大其值下降越明顯?？赡苁怯捎谠谀M較高壓力且高濃度醫(yī)用CO2氣腹環(huán)境下，CO2溶解度增加，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液中的碳酸含量增加、pH值下降 。因此，體外模擬不同CO2氣腹壓力環(huán)境對細(xì)胞培養(yǎng)液pH值有明顯的影響，這種pH的改變可能打破了腫瘤細(xì)胞局部微環(huán)境、干擾了腹腔局部微環(huán)境抗腫瘤能力，從而促進(jìn)腫瘤的增殖生長。

CO2氣腹是否會促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖及生長，從而影響手術(shù)療效一直是學(xué)術(shù)界爭論的問題之一。正常細(xì)胞的增殖生長依賴于生長因子的調(diào)節(jié)，然而惡性腫瘤往往生長速度快、保持高代謝狀態(tài)，其本身存在對缺血缺氧調(diào)節(jié)與適應(yīng)的能力，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的增殖及生長。有研究認(rèn)為CO2氣腹具有促進(jìn)惡性腫瘤增殖的作用，Lee等[7]通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)，模擬腹腔鏡氣腹組腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯高于空氣對照組，認(rèn)為CO2能刺激腫瘤細(xì)胞生長，CO2氣腹在惡性腫瘤手術(shù)的應(yīng)用中存在安全隱患。缺氧誘導(dǎo)因子-1α可以介導(dǎo)組織細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)，同時還能調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子等相關(guān)腫瘤基因的表達(dá)，在CO2氣腹下缺氧誘導(dǎo)因子-1α表現(xiàn)明顯升高，繼而促進(jìn)腫瘤的增殖生長[8]。Takiguchi等[9]研究認(rèn)為CO2氣腹對腫瘤細(xì)胞有毒性作用并不提升其增殖分裂的能力。Lin等[10]也通過模擬腹腔鏡手術(shù)環(huán)境暴露人卵巢癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞的研究，認(rèn)為CO2氣腹能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和生長。Cai等[11]通過體外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為濕潤的CO2可以減少結(jié)直腸癌的腹腔種植——?dú)w因于氣腹作用下pH值的改變、缺氧及CO2氣體的物理特性對腫瘤細(xì)胞生長存在抑制作用。由此可知，CO2氣腹對腫瘤細(xì)胞的影響機(jī)制極為復(fù)雜。本研究結(jié)果顯示，隨著CO2氣腹壓力升高，腹腔內(nèi)種植的腫瘤質(zhì)量增大，腹腔內(nèi)種植轉(zhuǎn)移灶數(shù)目增多(均P<0.05)。尤其在15 mmHg氣腹組中，其對腫瘤生長增殖的影響最大，術(shù)后腹腔內(nèi)腫瘤平均質(zhì)量最大。本研究結(jié)果提示，氣腹壓力的大小對腫瘤生長具有一定影響。在模擬不同腹腔鏡氣腹壓力下，腫瘤腹壁種植遠(yuǎn)高于其他種植方式，可能是由于腹膜間皮細(xì)胞的改變及腹腔內(nèi)理化環(huán)境的改變等，在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的腹膜種植轉(zhuǎn)移。以上研究提示，行腹腔鏡手術(shù)時應(yīng)注意控制氣腹壓力不宜過高，以減少惡性腫瘤術(shù)后生長和種植轉(zhuǎn)移機(jī)會，然而CO2氣腹對惡性腫瘤增殖的影響程度及具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

腹腔鏡結(jié)直腸癌手術(shù)目前雖已廣泛應(yīng)用于臨床，然而腹腔鏡手術(shù)是否增加癌細(xì)胞侵襲能力仍是基礎(chǔ)研究中有爭議的問題之一[12]，E-cadherin在細(xì)胞與組織構(gòu)架中起著信息黏附等至關(guān)重要的作用，它的異常表達(dá)或功能缺失可導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和加速腫瘤進(jìn)展。有學(xué)者在結(jié)直腸癌和胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)E-cadherin發(fā)生突變導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[13]。 E-cadherin通過與α/β/λ-cadherin相互連接使結(jié)直腸癌細(xì)胞相互黏附，E-cadherin出現(xiàn)破壞或缺失可導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，增加了癌細(xì)胞的侵襲能力，然而研究證明E-cadherin須在細(xì)胞膜上才能發(fā)揮其黏附作用。Leister等[14]通過小鼠和結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT116構(gòu)建腹腔鏡手術(shù)模型，發(fā)現(xiàn)E-cadherin通常在正常細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定，然而在癌細(xì)胞株中表達(dá)不穩(wěn)定，常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞容易脫落導(dǎo)致侵襲性轉(zhuǎn)移，然而氣腹可以抑制β-cadherin的表達(dá)，減少結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究中不同氣腹壓力下E-cadherin表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究結(jié)果支持高濃度醫(yī)用CO2氣體介質(zhì)及不同的氣腹壓力對E-cadherin的表達(dá)影響不明顯，環(huán)境的改變可能并不增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲性。

綜上所述，腹腔鏡CO2氣腹改變了腹腔的微環(huán)境： 局部血管通透性的改變、酸堿度的變化及腹膜間皮細(xì)胞的破壞。這些改變可能增加結(jié)直腸癌細(xì)胞在腹腔內(nèi)增殖生長的能力，然而對結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲性影響不明顯。我們在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)腹腔鏡結(jié)直腸癌手術(shù)，尤其是直腸癌手術(shù)中有著空間大、視野清晰等較明顯的優(yōu)點(diǎn)，隨著新輔助放化療的實(shí)施和腹腔鏡技術(shù)及設(shè)備的不斷更新改進(jìn)，腹腔鏡結(jié)直腸癌手術(shù)的潛在風(fēng)險會得到很好的控制，有更廣的應(yīng)用前景。