急性髓細(xì)胞白血病患者血漿中PD-L1 和IFN-γ 的表達(dá)及臨床意義

王今，田黎明，張純，王為光，曲影，周芳，霍梅，周穎，張淑英*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾)

0 引言

急性髓系白血病是一組正常骨髓造血干/袓細(xì)胞生成減少并伴有細(xì)胞分化受阻，是具有正常造血功能但被抑制的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，它的發(fā)病率逐年增高。在成人白血病中最常見的白血病類型之一就是AML，其死亡人數(shù)最多。化療作為目前治療的主要手段己取得較大進(jìn)展，然而微小殘留白血病細(xì)胞，仍然可以生存、增殖、播散遷移，導(dǎo)致復(fù)發(fā)以及浸潤其他組織。

程序性死亡因子配體-1(PD-L1) 是一種I 型跨膜糖蛋白，同時它也是可以抑制T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子。毫無疑問的現(xiàn)已經(jīng)證實PD-L1 在各種人類實體瘤中會高度表達(dá)，它在腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的逃逸中起著非常重要的作用。干擾素-γ(IFN-γ)是一種由病毒和細(xì)菌產(chǎn)物誘導(dǎo)的功能性調(diào)節(jié)蛋白。它是由活化的CD4+T 細(xì)胞，CD8+T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)產(chǎn)生的典型Th1 型細(xì)胞因子。它使Th0 細(xì)胞→Th1 細(xì)胞方向分化得以促進(jìn)，令人感興趣的是它不但基于細(xì)胞免疫力促進(jìn)Th1 細(xì)胞的增殖，同時還可以抑制Th2 細(xì)胞的增殖。在這項研究中，通過ELISA 方法檢測AML患者的血漿PD-L1 和IFN-γ 水平，探討二者表達(dá)及相關(guān)性，目的在初診時通過尋找敏感的可以聯(lián)合檢測得標(biāo)志物，來預(yù)測白血病的發(fā)生，觀察治療效果，判斷預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入36 例2019 年11 月至2020 年5 月在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院血液科新診斷并住院治療的急性髓細(xì)胞白血病患者作為初診組，男性20 人，女性16 人，年齡29-84 歲，平均年齡(55.17±15.67)歲，中位年齡56.00 歲。依據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[1]及《WHO 造血和淋巴組織腫瘤分類法》(2016 年更新版)MICM 分型的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，按FAB 分型標(biāo)準(zhǔn)，其中M1有2 例，M2有12 例，M3有8 例，M4有4 例，M5有8 例，M6有2 例。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化療完全緩解(組)26 例，未完全緩解(組)10 例。對照組為20 例我院健康管理體檢中心同時期進(jìn)行體檢的無其他基礎(chǔ)疾病的健康人，男性有10人，女性有10 人，年齡24-75 歲，平均(54.45±11.99) 歲，中位年齡58.50 歲。其性別、年齡等具有可比性。

1.2 化療方法

AML 初診患者(除M3 外)采用DA、IA、HA 等方案誘導(dǎo)緩解治療，M3 以全反式維A 酸+亞砷酸誘導(dǎo)緩解。

1.3 實驗方法

在清晨采集AML 患者和健康志愿者的空腹外周血3mL，加入抗凝劑EDTA。每分鐘1500 轉(zhuǎn)離心15min，收集上清液，置于EP 管中，做好病人編號及標(biāo)記。-80℃保存樣品，防止反復(fù)凍融。血漿中PD-L1 與IFN-γ 表達(dá)的水平由ELISA 法檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0 軟件統(tǒng)計分析。計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表現(xiàn)，計量資料符合正態(tài)分布。兩組間采用t檢驗和Pearson 相關(guān)性分析，P值＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 初診組與對照組血漿PD-L1 及IFN-γ 表達(dá)水平比較

AML 患者在初診時血漿中PD-L1 水平高于對照組，AML患者在初診時血漿中IFN-γ 的表達(dá)程度低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)上的意義(P＜0.05)。具體見表1。

表1 初診組與對照組血漿PD-L1 及IFN-γ 表達(dá)水平比較

2.2 各組血漿中PD-L1 及IFN-γ 表達(dá)水平比較

AML 完全緩解組血漿PD-L1 和IFN-γ 表達(dá)水平分別與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)上的意義(P＞0.05)。初始未醫(yī)治組和不完全緩解組在統(tǒng)計學(xué)上分別與對照組和完全緩解組有差異。(P＜0.05)；初始未醫(yī)治組和不完全緩解組之間相比較差異無統(tǒng)計學(xué)上的意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組血漿中PD-L1 及IFN-γ 表達(dá)水平比較

2.3 AML 患者初診血漿中PD-L1 及IFN-γ 相關(guān)性分析

通過Pearson 相關(guān)分析，AML 患者初診血漿中，PD-L1及IFN-γ 表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.420，P＜0.05)。

3 討論

3.1 PD-L1 在AML 中的表達(dá)及意義

程序性死亡因子配體-1(PD-L1)，是I型跨膜糖蛋白之一，又稱為B7-H1，屬于B7 家族[2]。PD-1 作為PD-L1 的受體之一，屬于CD28 家族。PD-1/PD-L1 受體- 配體對同屬

于免疫共抑制分子。PD-L1 為一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子，它毫無疑問的能抑制T 細(xì)胞增殖與細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此毋庸置疑的它在腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的逃逸中起著緊要的作用。令人感興趣的是PD-L1 與PD-1 聯(lián)合還能發(fā)生多種生物學(xué)作用，例如上訴所說的發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)因子的作用，來抑制CD4+T 細(xì)胞→Th1 等細(xì)胞方向分化、最終抑制IFN-γ、IL-2 等炎性細(xì)胞因子的釋放，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃逸。PD-L1 除了在多種實體瘤中過度表達(dá)外，現(xiàn)已證明PD-L1 與AML、淋巴瘤及慢性粒細(xì)胞白血病等多種血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生和疾病進(jìn)展具有關(guān)系。TaghilooS[3]等采用實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測Pd-L1 基因的相對表達(dá)PD-L1 在慢性白血病中的過度表達(dá)也已被證實，并且可以預(yù)后評估；吳福群等[4]通過用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測AML 患者中血清sPD-L1 蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)sPD-L1 在AML 患者高表達(dá)，并且與不良預(yù)后相關(guān)。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測急性髓系白血病(AML) 患者和健康人血漿PD-L1 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AML 患者和不完全緩解組PD-L1 水平高于完全緩解組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)上的意義，而AML 完全緩解組與對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)上的意義。揭示PD-L1 與白血病的產(chǎn)生有一定的關(guān)系，并與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。AML 患者初診未治或治療未緩解時在血漿中濃度較高，化療達(dá)完全緩解時濃度減低，揭示PD-L1可作為評估急性髓系白血病治療療效和預(yù)后的標(biāo)志物。

3.2 IFN-γ 在AML 中的表達(dá)及意義

干擾素-γ(IFN-γ)是一種由病毒和細(xì)菌產(chǎn)物誘導(dǎo)的功能性調(diào)節(jié)蛋白[5]。毫無疑問的已經(jīng)很早就發(fā)現(xiàn)了IFN-γ 是由活化的CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞(NK)產(chǎn)生的Th1 類細(xì)胞因子，它同時具有多種抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用。除抗病毒、抗增殖作用外，還具有巨噬細(xì)胞激活劑的作用，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用；促成Th0 細(xì)胞→Th1 細(xì)胞方向分化，毫無疑問的增強(qiáng)了Th1 細(xì)胞增殖，抑制Th2 細(xì)胞增殖。馬靜靜等[6]通過用ELISA 檢測AML 患者中血清IFN-γ 蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)IFN-γ1 在AML 患者表達(dá)水平降低，并與AML病情變化有一定的相關(guān)性。本實驗同樣證明AML 患者初診未治、未完全緩解時IFN-γ 低表達(dá)，完全緩解時與健康人無差異。表明IFN-γ 與病情變化有一定水平上的相關(guān)性，同時可以作為觀測的標(biāo)志物。

3.3 PD-L1 及IFN-γ 在AML 中表達(dá)的關(guān)系及意義

在AML 發(fā)生發(fā)展過程中，白血病細(xì)胞會發(fā)生免疫編輯，指在疾病進(jìn)展過程中，白血病細(xì)胞會利用各種各樣的破壞性過程來維持自身的生存。在白血病中，其中一個過程取決于白血病細(xì)胞表面PD-L1 的高表達(dá)，該分子激活了外周血T 淋巴細(xì)胞上的共受體PD-1 并且抑制T 細(xì)胞反應(yīng)，從而通過使用PD-1/PD-L1 受體-配體對允許腫瘤的進(jìn)展和增殖[7]。PD-1/PD-L1 受體-配體對結(jié)合，抑制了T 細(xì)胞的活化，致使T 細(xì)胞功能耗竭，衰竭的T 細(xì)胞喪失了產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 和IFN-γ 等細(xì)胞因子的能力，令人心痛的是它同時也失去增殖和殺傷細(xì)胞的能力，因此實現(xiàn)了白血病細(xì)胞的免疫逃逸[8]。當(dāng)PD-L1/PD-1 受體- 配體對相結(jié)合時，酪氨酸在PD-1 結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化，并募集酪氨酸磷酸酶(SHP-1 和SHP-1)，抑制TCR 下游的信號傳導(dǎo)，最終抑制T 細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、分化和存活，毫無疑問的抑制了IFN-γ 等炎癥分子的釋放和抑制CD4+T 淋巴細(xì)胞→Th1等細(xì)胞因子方向分化，并傳遞抑制信號[9]。Th1/Th2 漂移發(fā)生在大多數(shù)腫瘤患者中，這主要由Th2 細(xì)胞因子占主要優(yōu)勢的狀態(tài)表現(xiàn)出來。Th1/Th2 比例的這種不平衡會導(dǎo)致人體的免疫抑制，并有利于腫瘤細(xì)胞逃逸[10]。本實驗研究證實PD-L1及IFN-γ 在急性髓細(xì)胞白血病中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，IFN-γ作為顯著的Th1 細(xì)胞因子之一。毫無疑問PD-L1/PD-1 結(jié)合作用可以抑制IFN-γ 的分泌，引起AML 相關(guān)的Th2 偏移，導(dǎo)致白血病細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的監(jiān)控，同時促進(jìn)疾病的產(chǎn)生和進(jìn)展。

綜上，PD-L1 和IFN-γ 與AML 的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。監(jiān)測血漿PD-L1 和IFN-γ 濃度有助于了解病情變化，觀察療效，判斷預(yù)后?？僧?dāng)作急性髓系白血病潛在治療靶點與敏銳的生物學(xué)評價指標(biāo)。