動脈粥樣硬化相關(guān)血清生物化學(xué)及分子生物學(xué)檢測指標的最新研究進展

馬苑真,董 莉（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010050）

1 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)是一種人群中發(fā)病率很高的疾病，嚴重危害人群健康。傳統(tǒng)的AS 實驗室檢測包括血脂及載脂蛋白的測定，只能評估AS 的危險因素，特異度較差。隨著研究的深入和檢驗技術(shù)的發(fā)展，研究人員根據(jù)AS 的多種致病學(xué)說發(fā)現(xiàn)許多新的血清學(xué)檢測指標可以指導(dǎo)臨床診斷治療AS。本文就幾項新發(fā)現(xiàn)的與AS 相關(guān)的血清生物化學(xué)及分子生物學(xué)檢測指標的致病機制及應(yīng)用前景進行綜述，為將來AS 的定性檢測及靶向治療提供理論依據(jù)。

2 動脈粥樣硬化相關(guān)的血清生物化學(xué)及分子生物學(xué)檢測指標

2.1 S100 鈣結(jié)合蛋白 S100 鈣結(jié)合蛋白（S100 calcium binding protein，S100）是1965年在牛腦中提取出來的一類神經(jīng)蛋白質(zhì)，是鈣結(jié)合蛋白中最大的亞族，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)共有24 個組成成員，包括S100A1～16，S100B，S100P，S100Z，CALB 等[1]。其中S100A8 和A9 主要由活化或壞死的中性粒細胞和單核巨噬細胞釋放產(chǎn)生，在體內(nèi)或體外多以異二聚體的形式存在[3-4]。S100 鈣結(jié)合蛋白可以與多種配體結(jié)合，包括晚期糖基化終產(chǎn)物(receptor foradvanced glycation end products, RAGE) 受 體，Toll樣受體4(toll-like receptor,TLR-4)，高級糖基化終產(chǎn)物( advanced glycation end products, AGEs)，膜聯(lián)蛋白A2 和p53 等，參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等生物活動[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的S100A8 和A9通過RAGE 受體觸發(fā)下游信號包括絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，磷酸肌醇3- 激酶(phosphoinositol 3-kinase，PI3K)，Rho GTP 酶(Rho-GTPase)，細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle42, CDC42)， 小GTP 結(jié)合蛋白(rac family small GTPase 1，RAC1), 非受體酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1(activator protein1,AP-1)，可以激活核因子(nuclear factor，NF-κB）、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1） 和單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protien-1，MCP-1），增強中性粒細胞和單核細胞的募集和活化，促進動脈粥樣硬化的形成[5]。S100A8 和A9 的高表達還可以導(dǎo)致AGEs增加，而AGEs 可以與RAGE 結(jié)合促使巨噬細胞遷移增加，參與炎癥反應(yīng)，促進粥樣硬化的發(fā)展[6]。多個實驗還證實S100A8 和A9 可以通過TLR-4 誘導(dǎo)增加細胞因子、趨化因子和腫瘤壞死因子等炎癥因子的分泌，[7-8]TLR-4 的激活還可以增加S100A8，S100A9，S100A12，IL-1 和干擾素的表達，此雙向促進作用可以進一步放大炎癥反應(yīng)促進粥樣斑塊的形成，而S100A12 還與動脈鈣化呈正相關(guān)[9]。由此可見，S100A8/A9 主要通過RAGE 和TLR-4受體促進AS 形成過程中的炎癥反應(yīng)，有望成為新的血清學(xué)指標輔助診斷動脈粥樣硬化。

2.2 小分子RNA(miRNA) 小分子RNA(miRNA)是一類存在于真核生物中長度約21～23 個核苷酸的非編碼RNA，可以與mRNA 結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄后基因的表達影響生物合成。一個miRNA 可以或強或弱的與多個mRNA 的靶點相結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄及其穩(wěn)定性，一個mRNA 也同時受到多種miRNA 的調(diào)控，可見miRNA 可以廣泛參與各種生物活動，對生物體的生長發(fā)育發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人體中存在2 000 多種miRNA[10],且有多種miRNA 被證實與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

2.2.1 microRNA-21 研究發(fā)現(xiàn)microRNA-21 與冠狀動脈疾病患者（coronary artery diseases, CAD）斑塊的穩(wěn)定性呈正相關(guān)[11]，缺乏miR-21 的巨噬細胞其蛋白激酶（MKK3）基因過表達，促進p38-CHOP 和JNK 信號通路，使調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)膽固醇外排的轉(zhuǎn)運蛋白ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1 (ATP-binding cassette sub-family G member 1，ABCG1）發(fā) 生 降解影響泡沫細胞的形成[12]。miR-21 的過表達可顯著抑制炎性細胞因子IL-6 的分泌，還可以對TLR4的抗體以及NF-κB 的抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(ammonium pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)進行前處理，負向調(diào)控巨噬細胞中脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)[13]， 對粥樣斑塊起到一定的保護作用。

2.2.2 microRNA-126 WU 等[14]人的研究中發(fā)現(xiàn)miR-126 與CAD 患者的炎癥細胞因子[包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α),細胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)，CRP 及IL-6]呈負相關(guān)，可以預(yù)測CAD 患者的嚴重程度。miR-126 主要參與調(diào)節(jié)血管的生成，在成熟的血管內(nèi)皮細胞及成人的血管內(nèi)皮祖細胞中，它可以抑制增生，維持血管內(nèi)皮和血流微環(huán)境的穩(wěn)定[15]。研究發(fā)現(xiàn)miR-126 類似物可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路來恢復(fù)自噬流，從而減輕氧化修飾低密度脂蛋白（oxidation modifies LDL，ox-LDL）對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的損傷，可以作為逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化潛在的治療靶點[16]。

2.2.3 microRNA-155 LI 等[17]人研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者的血清及粥樣斑塊中的miR-155 表達明顯升高，TNF-α 可以通過激活核因子NF-κB 轉(zhuǎn)錄上調(diào)miR-155，高表達的miR-155 通過鈣調(diào)節(jié)熱穩(wěn)定蛋白1（calcium regulates heat stable protein 1 ，CARHSP1）負反饋下調(diào)TNF-α，從而抑制巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，研究還發(fā)現(xiàn)伴有miR-155 高表達的肥胖個體與缺乏miR-155 的單純肥胖個體相比較，更容易發(fā)生AS[18]。由此可見粥樣斑塊形成過程中可以伴隨miR-155 的高表達，而過量的miR-155 又可以負反饋抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述miR-21，miR-126 和miR-155 影響AS過程中泡沫細胞的形成、脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)等機制 ，可以作為新的檢測指標評估AS 的危險程度，其中miR-126 還有望作為一種新的治療靶點逆轉(zhuǎn)粥樣斑塊。除此之外目前人類發(fā)現(xiàn)與AS 相關(guān)的micro-RNA 還有很多種，包括miR-146，miR-145，miR-19，miR-195，miR-221/222，miR-10a 和let-7 家族等，將來可以為臨床指導(dǎo)AS 診療提供新的途徑[18]。

2.3 基質(zhì)金屬蛋白酶 基質(zhì)金屬蛋白酶(metallomatrix proteases， MMPs）是內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)產(chǎn)生可以降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)促進內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞增殖和遷移的蛋白水解酶，其活性受“金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloprotenase，TIMPs)”的調(diào)節(jié)，可以參與動脈粥樣硬化性病變、動脈重塑及心肌修復(fù)等過程[19]。MMPs 包括有MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-12 和MT1-MMP，它們可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子及其受體(vascular endothelial growth factor-vascular endothelial growth factorreceptor, VEGF-VEGFR)以及細胞-細胞黏附信號等因子使蛋白質(zhì)和其他非細胞外基質(zhì)發(fā)生水解，參與血管形成和重塑。

研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 濃度在穩(wěn)定的動脈粥樣硬化患者血清中顯著高于正常對照組[20]，同時還有研究表明丙烯醛可以通過MAPK 途徑上調(diào)MMP-9，從而影響動脈粥樣硬化相關(guān)的腸道菌群[21]。最新研究發(fā)現(xiàn)MMP- 9 在冠心病患者中發(fā)生急性動脈粥樣硬化血栓性心肌梗死時明顯升高，但在靜止期隨訪無明顯差異[22]。且有報道稱國外MMP-9 已經(jīng)在臨床中用于對易損斑塊的檢測[23]。由此可見MMP-9 在穩(wěn)定的冠心病患者中其應(yīng)用價值尚存在爭議，但可以作為檢測指標評估動脈粥樣硬化患者發(fā)生急性心肌梗死的風(fēng)險。

2.4 微粒 微粒（micropariticles, MPs）是一種膜脫落的細胞外囊泡，直徑在100～1 000nm 之間，存在于組織及體液（血液、滑膜液和唾液等）中，由細胞活化或凋亡時產(chǎn)生，MPs 可以運輸活化后的脂質(zhì)，可編碼RNA，microRNA，長非編碼RNA 和DNA等信號，作用于靶細胞的膜受體和胞質(zhì)受體，被認為是細胞間通訊的生物媒介[24]。實驗發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞來源的MPs（EMPs）及血小板來源的MPs(PMPs)均與動脈粥樣硬化的多種致病機制相關(guān)[25]。在促凝血方面，MPs 富含磷脂酰絲氨酸（PS）等信號分子可以激活促凝血因子TF，通過TF 的促凝血功能促進AS 的形成。在血管生成方面，EMPs 傳遞miR-126還可以使miR-126 的靶蛋白低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（LDL receptor associated protein 6, LRP6)表達降低,調(diào)節(jié)血管平滑肌的增殖和遷移以及新生內(nèi)膜的形成[26]。在內(nèi)皮功能方面，EMPs 通過抑制Akt 蛋白質(zhì)分子和內(nèi)皮型一氧化氮合酶-熱休克蛋白90（Akt and endothelial nitric oxide synthase -heat shock protein 90, Akt/eNOS-Hsp90)導(dǎo)致內(nèi)皮細胞NO 生成減少影響血管舒張[27]。在炎癥方面，MPs 可以通過JUN 蛋白氨基末端激酶1(JUN protein amino-terminal kinase 1, JNK1)和NF-κB 通路上調(diào)炎癥因子的表達，如IL-6，單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1）、 一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,iNOS）和環(huán)氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)。血小板來源的MPs 可以分泌花生四烯酸，通過蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)增加內(nèi)皮細胞中COX-2 和ICAM-1 的釋放[28]。除此之外，還有研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌的MPs表面還表達與AS 相關(guān)的MMP-2 和MMP-9。

ZABORO-WSKI 等人發(fā)現(xiàn)在急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者中，具有促凝功能的內(nèi)皮來源的MPs（EMPs）其血清水平會明顯高于健康人群，且高水平的EMPs 能促進冠脈內(nèi)血栓的形成[24]。經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在ACS 患者組的MPs 水平明顯高于穩(wěn)定性心絞痛組（stable angina，SA）患者，MPs 水平對于穩(wěn)定的AS 患者無太大影響。由此可見MPs 可以通過促進凝血，增加炎癥反應(yīng)，影響血管形成及內(nèi)皮功能等多種機制參與動脈粥樣斑塊的形成過程，其中EMPs 對動脈粥樣硬化的影響作用更為明確，有望作為檢測指標評估動脈粥樣硬化患者發(fā)生急性冠脈事件的危險程度。

2.5 白細胞介素-33 白細胞介素-33(interleukin-33, IL-33)是IL-1 家族的一員，當(dāng)細胞發(fā)生損傷或壞死后被釋放，作為一種損傷相關(guān)分子與生長刺激表達基因2 蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)結(jié)合參與動脈粥樣硬化、心肌纖維化和心室重構(gòu)等過程[29-30]。研究表明IL-33 主要參與TH2 相關(guān)的免疫反應(yīng)，同時還可以促進自然殺傷細胞分泌γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)，增強肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的黏附能力以及促進該類細胞釋放細胞因子，還可以促進巨噬細胞分泌TNF-α, IL-6 和IL-1β[31]參與免疫炎癥反應(yīng)。并有報道指出IL-33 還可以促進EMPs 增加其表面TF 相關(guān)信號的表達，共同參與動脈粥樣硬化的形成過程[32]。

有研究提出β 受體阻滯劑在治療心室重構(gòu)過程中可能是通過IL-33/ST2 信號通路的調(diào)節(jié)起到有益的作用[30]。目前研究發(fā)現(xiàn)IL-33/ST2 在心衰患者的心肌組織中高表達，其表達量與心肌纖維化和促纖維化的信號蛋白包括結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF) 和轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor factorβ1，TGFβ1) 具有相關(guān)性，提示IL-33/ST2 具有促進心肌纖維化的作用[33]。STANKOVIC A 等[34]人發(fā)現(xiàn)頸內(nèi)動脈粥樣斑塊切除術(shù)(carotid endarterectomy ，CEA)患者IL-33血清水平、sST2 血清水平明顯高于健康對照組，通過大量數(shù)據(jù)證明IL-33/ST2 與動脈粥樣硬化的發(fā)生具有相關(guān)性，并提出IL-33 可能作為促炎因子來促進粥樣斑塊病變的發(fā)展促進病變血管的纖維化。還有部分研究表明在PCI 術(shù)后患者中，IL-33 血清水平的增加與支架內(nèi)再狹窄的高發(fā)病率有關(guān)?？梢奍L-33可以通過促進纖維化，增加炎癥反應(yīng)等機制促進動脈粥樣硬化過程，將來有望作為血清檢測指標提示AS 病變程度及支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生風(fēng)險。

3 展望

動脈粥樣硬化在人群中的發(fā)病率較高而且并發(fā)癥種類多、危害大，嚴重影響人類的健康。目前，AS 的診斷僅憑影像學(xué)來完成，血清標記物的測定僅限于科研，且為單項研究。與傳統(tǒng)影像學(xué)相比，血清檢測具有無創(chuàng)、可批量等優(yōu)點，還可以根據(jù)相應(yīng)的檢測指標進行早期干預(yù)減少并發(fā)癥的產(chǎn)生。為達到這一目標，就要求我們發(fā)現(xiàn)越來越多新的與動脈粥樣硬化相關(guān)的血清學(xué)指標，著力于尋找一種特異性較強的指標或幾種指標聯(lián)合預(yù)測動脈粥樣硬化病變發(fā)展情況，提高其診斷的靈敏度和特異度，同時還可以根據(jù)其在粥樣斑塊的發(fā)生發(fā)展過程中的作用研發(fā)新的靶點，為精準治療提供理論依據(jù)。