水凝膠在脊髓損傷動物實驗中的應用研究進展

吳培琪 洪冬純 黃思源 翁崇蓉 宋江濤 姚穎 白璐 汪校帥*

脊髓損傷是脊髓遭受外力打擊后，損傷節(jié)段以下運動、感覺功能不完全或完全喪失的一種高致殘率的損傷。近年來，脊髓損傷的發(fā)生率逐漸升高[1]，如何有效修復脊髓損傷成為當今臨床研究的熱門課題。

脊髓損傷可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。脊髓損傷后，損傷部位神經(jīng)元壞死，誘發(fā)炎癥反應，隨后神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生形成膠質(zhì)瘢痕，損傷部位還可形成大小不等的囊腫腔。炎癥反應、膠質(zhì)瘢痕、囊腫腔均可抑制軸突生長，形成永久性損傷。相關研究表明，損傷后利用水凝膠進行治療，可以抑制炎癥反應，減少膠質(zhì)瘢痕形成，減小囊腫腔體積，促進髓鞘再生等，減少繼發(fā)性損傷帶來的傷害。

水凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的功能高分子材料，在吸收大量水或組織液后溶脹，具有良好的生物相容性。臨床上可利用水凝膠搭載細胞、細胞因子、小分子藥物等。在脊髓損傷的治療中，水凝膠可以模擬細胞外基質(zhì)，為神經(jīng)細胞或干細胞提供黏附位點，促進其增殖、分化，搭載細胞因子或藥物，促進脊髓損傷處神經(jīng)纖維再生，甚至恢復部分功能。

本文回顧了2015—2018 年水凝膠及其相關的細胞治療、分子治療在脊髓損傷治療領域的研究進展，重點關注其促進神經(jīng)元再生、抑制膠質(zhì)瘢痕增生等方面的作用，對水凝膠注射時間進行相關討論。

1 水凝膠在脊髓損傷類型中的應用

目前，應用水凝膠治療脊髓損傷僅限于動物實驗階段，動物模型多為大鼠，少量為小鼠和狗。在實驗過程中，研究者普遍先手術切開大鼠椎板，構(gòu)建脊髓損傷模型（全橫斷、半橫斷和挫傷），移植搭載有特定物質(zhì)（如細胞因子、多能干細胞等）的水凝膠，隨后評估其運動功能恢復情況，并取原損傷節(jié)段脊髓進行免疫組化、形態(tài)學分析等方面的研究。

1.1 搭載細胞的水凝膠

脊髓損傷可破壞原有解剖結(jié)構(gòu)，造成局部組織的缺損、壞死和瘢痕組織的形成。單純移植細胞，由于缺乏足夠的空間和有效支撐，細胞遭到擠壓破壞，生長成雜亂的細胞團，難以與周圍組織形成突觸結(jié)構(gòu)[2]。Führmann 等[3]用RGD肽和血小板衍生生長因子修飾透明質(zhì)酸甲基纖維素水凝膠。體外實驗表明，經(jīng)修飾的水凝膠可通過提高與細胞的黏附能力，促進移植細胞的早期存活和整合。此外，Caron 等[4]用3D 細胞外基質(zhì)涂覆生物材料作為載體，搭載骨髓間充質(zhì)干細胞，顯著調(diào)節(jié)小鼠脊髓損傷模型中的促炎環(huán)境，增加M2巨噬細胞數(shù)量，促進原位再生環(huán)境的形成。

Gomes 等[5]在實驗中，對小鼠的L1水平脊髓進行半橫斷，并在損傷部位注射不同物質(zhì):實驗組，注射含有脂肪組織來源干細胞（adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs）和嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）的GRGDS 肽修飾的結(jié)冷膠（gellan gum hydrogel）;注射ASCs 和OECs;注射GRGDS 肽修飾的結(jié)冷膠;脊髓損傷后未處理組;僅椎板切除、無脊髓損傷組。與其他組相比，實驗組的小鼠在BBB 評分（Basso，Beattie，Bresnahan Locomotor Rating Scale，BBB）中得分更高，軀體運動能力有較大改善。組織學檢查中，實驗組小鼠損傷部位的神經(jīng)絲蛋白表達水平顯著高于未處理組，并減少膠質(zhì)瘢痕形成，促進軸突再生。免疫組化結(jié)果表明，實驗組小鼠損傷部位的CD11b/c 及膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白表達水平均有降低，炎癥反應減弱。與單獨注射細胞組相比，實驗組在損傷部位觀察到更多脂肪組織來源干細胞聚集。

此外，在Raynald 等[6]的實驗中，搭載人骨髓基質(zhì)干細胞的水凝膠可通過促進軸突再生顯著恢復脊髓損傷小鼠的運動功能。

2.2 搭載細胞因子或藥物的水凝膠

Wang 等[7]以甲基丙烯酸羥乙酯-三甲基氯化銨水凝膠作為藥物遞送系統(tǒng)，向脊髓損傷部位持續(xù)釋放堿性生長因子，促進脊髓損傷后的神經(jīng)組織再生和功能恢復。此外，Zhao 等[8]合成了神經(jīng)生長因子-肝素泊洛沙姆溫敏水凝膠，顯著提高細胞對神經(jīng)生長因子的攝取效率，對脊髓損傷大鼠模型中膠質(zhì)瘢痕的形成有明顯的抑制作用。

Nguyen 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與僅注射水凝膠的對照組相比，搭載神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 以及miR-222 的水凝膠可以在損傷部位持續(xù)釋放藥物和核酸分子，促進軸突再生以及再髓鞘化，促進脊髓損傷小鼠的功能恢復。

Wen 等[10]的實驗中，搭載腦源性生長因子、血管內(nèi)皮生長因子的聚乳酸乙醇酸[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]水凝膠混和抗Nogo 受體的抗體，通過下調(diào)Rho GTP酶的活性，降低損傷部位Rho 相關激酶以及膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白的表達水平，抑制星形膠質(zhì)細胞在損傷邊緣聚集，減少膠質(zhì)瘢痕的形成。

近年來的研究證明，海藻酸鹽水凝膠可顯著減少損傷部位對側(cè)脊髓白質(zhì)的脫髓鞘化[11]，還可通過激活M2 型巨噬細胞，促進其增生，減少損傷部位炎癥反應[12]。纖維蛋白水凝膠對內(nèi)源神經(jīng)元細胞遷移及增殖具有誘導作用，并可作為生物活性連接引導軸突生長[13]。

2 水凝膠在脊髓損傷模型中的使用時間

Hejcl 等[14]在不同時期使用帶正電荷的聚甲基丙烯酸羥乙酯樹脂（2-hydroxyethyl methacrylate，HEMA）水凝膠治療脊髓損傷大鼠模型。結(jié)果 顯示，損傷后1 周使用水凝膠較損傷后立即使用水凝膠形成的假性囊腫腔體積更小，促進神經(jīng)軸突和血管的再生與連接。

Chen 等[15]參考了Hejcl 等的實驗結(jié)果，同時考慮了生長因子的釋放時間，選定術后5 d 移植水凝膠。經(jīng)檢測，堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在全橫斷發(fā)生3 d 后達到峰值，出現(xiàn)峰值后（術后5 d）植入搭載bFGF 的水凝膠，使bFGF 平穩(wěn)保持較高水平。實驗結(jié)果顯示，實驗組大鼠相較對照組而言，前者在BBB 運動評估系統(tǒng)中獲得更高的分數(shù)，但并未有效減少瘢痕增生。

Tavakol 等[16]在大鼠T9節(jié)段構(gòu)建挫傷模型，術后10 d移植含層粘連蛋白基序CQAASIKVAV（CQIK）的水凝膠，并搭載人類子宮內(nèi)膜源性基質(zhì)細胞。挫傷形成后第42 d，檢測到移植上述水凝膠的大鼠在BBB 運動評估系統(tǒng)中比只注射PBS 的對照組大鼠獲得更高分數(shù)，有效促進損傷位點的軸突再生，抑制膠質(zhì)瘢痕和炎癥的形成，促進脊髓損傷修復。

3 討論

常見的脊髓損傷模型有3 種: 挫傷、全橫斷、半橫斷。挫傷是生活中常見的脊髓損傷類型，可以在不破壞硬脊膜的情況下造成脊髓大范圍損傷并形成囊腫[17]。全橫斷模型由于局部脊髓損傷范圍大，且破壞血液運輸，增加繼發(fā)變性，影響脊髓損傷修復療效的評估，較少在動物實驗中應用。半橫斷模型具有與健側(cè)對照的優(yōu)點，本文納入的實驗大部分都采用半橫斷脊髓損傷模型。

水凝膠作為一種新型功能高分子材料，可作為支架搭載細胞、細胞因子、小分子藥物等至脊髓損傷部位。相較于普通的細胞支架而言，水凝膠可以在原位注射，快速由液態(tài)轉(zhuǎn)化為固態(tài)，以適應不同形狀的脊髓損傷位點。常用水凝膠可分為以下幾類:天然高分子類水凝膠;合成類水凝膠;經(jīng)修飾的水凝膠;自組裝肽。天然水凝膠具有良好的生物相容性，在脊髓損傷動物實驗中得到廣泛應用。不同種類的天然水凝膠有不同的特點，如透明質(zhì)酸水凝膠可明顯減少脊髓損傷處膠質(zhì)瘢痕形成[18]，海藻酸鹽水凝膠可顯著減少損傷部位對側(cè)脊髓白質(zhì)的脫髓鞘化[11]，殼聚糖水凝膠可激活巨噬細胞，促進其增生，減少炎癥反應[12]，瓊脂糖類水凝膠可搭載小分子藥物，維持損傷部位有效藥物濃度[19]。合成類水凝膠可根據(jù)需要對其化學結(jié)構(gòu)做出調(diào)整，使其更適宜脊髓損傷微環(huán)境。合成類水凝膠可用于搭載細胞，搭載施旺細胞的寡聚（乙二醇）延胡索酸酯水凝膠可促進脊髓損傷部位軸突再生和髓鞘形成[20]。對水凝膠進行修飾可增加水凝膠與細胞的黏附，RGD 肽修飾的透明質(zhì)酸甲基纖維素水凝膠可促進少突膠質(zhì)細胞祖細胞的早期存活和整合[3]。自組裝肽可因其交替排列的正負電荷發(fā)生原位組裝，具有良好的吸水性。RADA16-Ⅰ是常見的自組裝肽，但因其使用所需pH較低而受到限制，而基于SAP改良的納米纖維水凝膠-IKVAV/-RGD（神經(jīng)突增生肽/細胞黏附肽）在動物實驗中被證明較RADA16-Ⅰ更有效地促進軸突再生和髓鞘形成[21]。水凝膠種類多，且各有特性，研究時需根據(jù)動物實驗方案和實驗目的選擇相應的水凝膠，也可根據(jù)實驗需要對水凝膠進行修飾。

Gomes 等[5]在損傷位點移植搭載脂肪組織來源干細胞、嗅鞘細胞的水凝膠，相較僅移植水凝膠的對照組而言，前者在組織學檢查和功能檢查中均有更好的表現(xiàn)。而在Elizalde-Pe?a 等[22]的實驗中，僅對損傷小鼠注射了水凝膠，小鼠運動功能未得到明顯恢復。大量動物實驗結(jié)果表明，在脊髓損傷治療中，水凝膠需要與細胞、細胞因子或藥物等結(jié)合，才能發(fā)揮顯著的治療作用。水凝膠可搭載具有分化能力或分泌細胞因子的細胞，促進血管生成，減少炎癥反應，而搭載細胞因子、小分子藥物的水凝膠可緩慢釋放細胞因子、小分子藥物，促進脊髓修復。

總體而言，水凝膠可作為支架提供細胞黏附位點，減少細胞凋亡，促進神經(jīng)元再生; 改善局部微環(huán)境，減少炎癥細胞聚集及膠質(zhì)瘢痕形成; 持續(xù)釋放所搭載藥物或細胞因子，延長藥物作用時間。

4 結(jié)論

脊髓損傷可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感覺運動功能的不可逆性損傷，脊髓損傷的救治和康復問題是醫(yī)學發(fā)展的重大挑戰(zhàn)。目前，改善局部再生微環(huán)境以有效支持神經(jīng)再生是治療脊髓損傷的重要研究方向。水凝膠不僅可為所搭載細胞提供支持，同時可維持所搭載細胞因子的持續(xù)局部釋放，調(diào)節(jié)細胞活動，減少炎癥反應和瘢痕增生。

目前，水凝膠的研究仍停留在動物實驗階段，水凝膠的最佳使用時間仍有待進一步探討，如何實現(xiàn)水凝膠在脊髓損傷中的臨床轉(zhuǎn)化也是未來水凝膠研究的一個重要方向。