大蒜粉薄層色譜鑒別方法的建立

鄧麗娟 劉睿婷 胡小霞 黃瓊 李新霞

【摘?要】?目的：建立大蒜粉薄層色譜鑒別方法。方法：以蒜氨酸為對照品，考察不同供試品制備方法、展開系統(tǒng)、顯色劑、點樣量、薄層板、溫度和濕度等因素對大蒜粉薄層色譜的影響，確定大蒜粉的最佳薄層色譜條件。結果：采用薄層色譜硅膠G板，以蒜氨酸為對照品，甲醇為提取溶劑制備供試品溶液，點樣量5 μL，正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開系統(tǒng)，以茚三酮為顯色劑，105℃下加熱至斑點清晰，置日光下檢視，所得薄層色譜圖斑點清晰，分離度較好。結論：該方法簡便易行，專屬性強，重現(xiàn)性好，可用于大蒜粉的質量控制。

【關鍵詞】?大蒜粉;蒜氨酸;薄層色譜鑒別

【中圖分類號】R284.1?【文獻標志碼】 A?【文章編號】1007-8517（2020）19-0027-06

Abstract：Objective To develop a thin-layer chromatography（TLC）method for identification of garlic powder. Methods?Alliin was used as reference substance to determine the best TLC conditions of garlic powder，and several factors were investigated，including different sample preparation methods， development systems， chromogenic agents， spotting sample volumes， thin layer chromatography plates， temperature and humidity. Results?5 μL of the sample which was extracted by methanol and alliin solution were loaded into TLC silica gel G-plate respectively. N-butanol-glacial acetic acid-water（4∶1∶1）was used as developing system.， Ninhydrin solution was sprayed after development， and TLC plate was heated at 105 ℃ till spots were clearly shown.Conclusion The method was feasible， specific and reproducible， which can be used for qualitative analysis of garlic powder.

Key?words：Garlic Powder; Alliin; Thin-layer Chromatography Identification

大蒜（Allium sativum L.）是世界公認的藥食兩用植物，也是為數(shù)不多以鮮品形式收錄于中國藥典的藥材，能解毒消腫、殺蟲、止痢，用于癰腫瘡瘍、疥癬、肺癆、頓咳、泄瀉、痢疾等疾病治療[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明大蒜功效成分具有抗感染[2]、抗腫瘤[3]、防治心腦血管疾病[4]、保護肝臟[5]、提高機體免疫力[6]、降三高[7-8]等作用。但是新鮮大蒜保質期太短，即使存放在2～8 ℃的冷庫中超過10個月也會變質。文獻研究證實將新鮮大蒜冷凍干燥，加工成蒜片或蒜粉，在冷庫中可保質5年以上，有較強的蒜辣味，且殺菌的效果與新鮮大蒜一致[9]。由于大蒜凍干粉具有：制備工藝簡單、零添加、生產(chǎn)成本低、儲存運輸方便，尤其是完整的保留大蒜的功效成分等優(yōu)勢，被美國藥典[10]、英國藥典[11]和歐盟藥典[12]收錄作為膳食補充劑，而中國藥典僅收錄大蒜藥材標準，缺少大蒜粉這一品種，嚴重限制了大蒜藥用及保健制劑的開發(fā)。因此，急需建立大蒜粉相關質量標準，為制備安全、有效、質量可控的大蒜類保健食品和藥品提供科學依據(jù)。

世界公認大蒜的活性成分是蒜酶催化蒜氨酸產(chǎn)生的大蒜辣素，大蒜辣素極不穩(wěn)定，可進一步分解產(chǎn)生系列含硫化合物[13]。蒜氨酸是大蒜辣素的前體物質，化學性質相對穩(wěn)定，美國藥典以蒜氨酸和甲硫氨酸作為大蒜粉的薄層鑒別成分，英國藥典和歐盟藥典大蒜粉的薄層鑒別以丙氨酸替代蒜氨酸，現(xiàn)有文獻僅報道了大蒜原藥材、有效部位蒜氨酸薄層鑒別方法[14-16]，對大蒜粉薄層鑒別方法的研究鮮有報道。本研究參考美國藥典、歐盟藥典、英國藥典大蒜粉質量標準及相關文獻，建立大蒜粉薄層鑒別方法，為大蒜粉的質量控制提供依據(jù)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?電子天平（AB135-S，梅特勒-托利多國際貿易有限公司），硅膠G薄層板（青島海洋化工分廠，德國Merk公司，安徽良臣硅源材料有限公司）。

1.2?試藥?甲醇（分析純，天津百世化工）、正丁醇（分析純，天津永晟精細化工）、正丙醇（分析純，西安化學試劑廠）、冰乙酸（分析純，天津富宇精細化工）、無水乙醇（分析純，天津富宇精細化工）、茚三酮（分析純，上海試劑三廠）。

蒜氨酸對照品（批號AL080428，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司）。

大蒜粉為來自不同產(chǎn)地的大蒜鱗莖經(jīng)去皮，切碎、真空冷凍干燥加工制成，其中Y201811001批次來源于新疆皮山縣桑珠鄉(xiāng)，Y201811004、Y201811005和2018110006來源于新疆皮山縣克里昂鄉(xiāng)，Y201904003批次來源于新疆吉木薩爾縣，Y201901021批次來源于新疆且末縣。生產(chǎn)加工方為新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司。

2?方法與結果

2.1?溶液的配制

2.1.1?對照品溶液的制備?取蒜氨酸對照品適量，加50%甲醇溶液制成每1mL含1mg的溶液，即得。

2.1.2?供試品溶液的制備?稱取1 g大蒜粉，加甲醇5 mL，振搖，靜置，取上清液即得。

2.1.3?茚三酮溶液的配制?顯色劑1（英國/歐盟藥典）：精密稱取適量茚三酮，加冰乙酸—丁醇=5∶95溶液溶解，制成2 g/L茚三酮溶液（冰乙酸-丁醇，5∶95）。

顯色劑2（美國藥典）：精密稱取適量茚三酮，加正丁醇-2 moL/L冰乙酸=19∶1溶液溶解，制成0.2%茚三酮溶液（正丁醇-2 mol/L冰乙酸溶液，19∶1）。

顯色劑3：精密稱取適量茚三酮，加無水乙醇溶解，制成2 g/L茚三酮無水乙醇溶液。

2.3?薄層色譜條件優(yōu)選

2.3.1?供試品制備方法考察?分別按照三種方法制備供試品溶液：

①歐盟藥典供試品溶液制備： 取1 g大蒜粉，加甲醇5 mL，振搖60 s，濾過，作為供試品溶液1。

②美國藥典供試品溶液制備：取1 g大蒜粉，加甲醇-水（1∶1）20 mL，超聲10 min，離心（轉速為8000轉/min）10 min，取上清液，沉淀加甲醇-水（1∶1）20 mL，再超聲10 min，合并兩次上清液，濃縮至5 mL，作為供試品溶液2。

③課題組方法供試品溶液制備：取1g大蒜粉，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇20 mL溶解，超聲10 min，離心（轉速為8000轉/min）10 min，取上清液，作為供試品溶液3。

分別取對照品溶液和上述供試品溶液各5 μL，點于同一薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點清晰，檢視，如圖1所示。結果表明：三種方法制備的供試品溶液主斑點與對照品溶液斑點的顏色、位置相同，均有較好的分離度，故供試品溶液制備方法選擇操作簡單的歐盟藥典方法。

2.3.1?展開系統(tǒng)選擇?吸取對照品溶液與供試品溶液各5μL，點于同一薄層板上，分別以冰乙酸-丙醇-水-無水乙醇（1∶1∶1∶2）、正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水（3∶1∶1∶1）、正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴氨基酸專屬顯色劑0.2%茚三酮乙醇溶液，在105℃加熱，蒜氨酸斑點均清晰可見，如圖2所示。采用冰乙酸-丙醇-水-無水乙醇（1∶1∶1∶2）為展開劑，展開，對照品溶液與供試品溶液Rf（0.7）值較大，且分離度較差;采用正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水（3∶1∶1∶1）和正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開劑，展開，對照品溶液與供試品溶液Rf（0.43-0.48）值適中，分離度均良好，確定配制方法簡單、使用有機溶劑種類少的正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為最佳展開系統(tǒng)。

2.3.2?顯色劑的選擇?吸取對照品溶液與供試品溶液各5μL，點于同一薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，分別噴以2 g/L茚三酮溶液（冰乙酸-丁醇，5∶95）、0.2%茚三酮溶液（正丁醇-2 moL/L冰乙酸溶液，19∶1）、0.2%茚三酮乙醇溶液三種顯色劑，在105 ℃加熱至斑點顏色清晰，檢視，如圖3所示。結果表明，三種顯色劑均可使主斑點顯色清晰，故選擇制備方法簡單，使用有機溶劑種類最少的課題組方法，即0.2%茚三酮無水乙醇溶液為顯色劑。

2.3.3?點樣量的選擇?吸取對照品溶液和供試品溶液各3 μL、5 μL和7 μL，點于同一薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮無水乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，立即檢視，如圖4所示。結果顯示：對照品溶液和供試品溶液點樣量在3～7 μL范圍內，各斑點清晰，且分離度較好，故選擇點樣量為均為5 μL。

2.4?耐用性考察

2.4.1?不同廠牌薄層板的考察?吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，分別點于三個不同廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，立即檢視，如圖5所示。結果顯示：三種硅膠G薄層板分離效果良好，表明該色譜條件耐用性良好。

2.4.2?不同溫度考察?吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開劑，分別于4 ℃、20 ℃、35 ℃展開，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮無水乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顏色清晰，立即檢視，如圖6所示。結果顯示：20 ℃和35 ℃，供試品薄層色譜分離效果良好，但在4 ℃主斑點與雜質斑點未完全分離，分離效果稍差一些，表明在20～35 ℃范圍內，溫度對薄層色譜鑒別影響較小。

2.4.3?不同相對濕度考察?在雙側展開缸的一側分別加入適當濃度的硫酸溶液，得到相對濕度分別為RH42%、RH65%、RH88%的環(huán)境[1]。取供試品溶液和對照品溶液各5 μL，點于同一薄層板，放在另一側槽中，密閉放置30 min左右，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）展開，取出，晾干，以2 g/L茚三酮無水乙醇溶液顯色，在105 ℃下加熱至斑點清晰，置日光下檢視，如圖7所示。結果顯示：濕度對蒜氨酸對照品與供試品的分離度并未產(chǎn)生影響。

2.5?不同批次大蒜粉的薄層鑒別?按上述實驗確定的色譜條件，對來自不同產(chǎn)地大蒜加工的六批次大蒜粉進行薄層鑒別，如圖8所示，結果顯示：在與對照品相對應的位置，供試品顯示相同顏色斑點，不同產(chǎn)地大蒜制得的大蒜粉色譜圖一致。

3?討論

本研究參照美國藥典、英國藥典、歐盟藥典及相關文獻，建立大蒜粉薄層鑒別方法，確定以蒜氨酸為對照品，以甲醇為提取溶劑制備供試品溶液，點樣量5 μL，正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開系統(tǒng)，以2 g/L茚三酮無水乙醇溶液為顯色劑，105 ℃下加熱至斑點清晰，置日光下檢視。與美國藥典、英國藥典及歐盟藥典大蒜粉薄層鑒別方法相比，新建方法具有以下幾點優(yōu)勢：①英國藥典和歐盟藥典以丙氨酸替代蒜氨酸做標準物質，而本研究方法以功效成分蒜氨酸標準物質為對照品，專屬性更強，達到準確鑒別供試品的目的;②新建方法中供試品制備方法參照歐盟藥典，操作簡便快速，而美國藥典及文獻方法中供試品制備方法復雜，提取時長達3 h，不能滿足薄層色譜鑒別快速和簡便的要求;③展開劑配制方法最簡單，且色譜斑點分離效果比歐盟藥典的方法好。

本研究中的大蒜粉為來自不同產(chǎn)地的大蒜經(jīng)切碎、真空冷凍干燥等工藝加工制得，對多批次大蒜粉進行薄層鑒別（僅列出6批薄層鑒別圖譜），結果顯示各批次供試品色譜圖在與對照品相應位置，顯相同顏色斑點，且各批次樣品的色譜圖具有較高相似度，揭示大蒜粉生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，且不同產(chǎn)地大蒜中氨基酸的組成差異不大。

4?結論

本研究建立的薄層色譜鑒別方法具有操作簡單、專屬性強、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，為控制大蒜粉的生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品質量提供簡便易行的檢測手段，確保以大蒜粉為原料的保健食品和藥品質量可控。

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（收稿日期：2020-05-15?編輯：程鵬飛）