艾葉油對小鼠肝臟生物鐘基因Bmal1、Clock mRNA時辰變化的影響

敖舟 保彩秀 張露 佟海英 黃先菊

【摘?要】?目的：研究艾葉精油對小鼠肝臟Bmal1和Clock生物鐘基因的影響。方法：將♀♂小鼠隨機(jī)分為8組。選取早、晚不同的時間，連續(xù)7d腹腔注射給藥，觀察其臨床表現(xiàn)及體重變化。實驗結(jié)束，分別于10：00和晚上22：00處死小鼠，取肝臟組織實時熒光定量RT-PCR法檢測Bmal1，Clock生物鐘基因的水平。結(jié)果：艾葉油可以促進(jìn)小鼠Bmal1，Clock生物鐘基因的表達(dá)，且艾葉油在10：00給藥時比22：00給藥效果更明顯。此外雄鼠比雌鼠對艾葉油更敏感。結(jié)論：艾葉油早晚給藥對生物鐘基因影響具有顯著不同，且具有性別差異，可為其臨床應(yīng)用提供理論參考。

【關(guān)鍵詞】?艾葉;生物鐘基因;時辰藥理;生理節(jié)律

【中圖分類號】R285.5?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A?【文章編號】1007-8517（2020）19-0022-05

Abstract：Objective To study the effect of Artemisiae argyi oil on the expression of Bmal1 and Clock in the liver of mice. Methods Mice were randomly divided into eight groups， half male and half female. Each group were respectively injected with Artemisiae argyi oil at 10∶00a.m. and 10∶00p.m.for seven days. Clinical manifestations and weight changes were observed and recorded. After the experiment， the mice were respectively killed at 10∶00a.m.and 10∶00p.m. Real time-PCR was used to detect the expression of Bmal1 and Clock in the liver of mice. Results Artemisiae argyi oil promotes the expression of Bmal1 and Clock in mice， and Artemisiae argyi oil was more effective when administered at 10∶00a.m. than 10∶00p.m.， in addition， males were more sensitive to Artemisiae argyi oil than females. Conclusion Artemisiae argyi oil administered in the morning and evening has significantly different effects on circadian rhythm and genders of mice， which can provide a theoretical reference for its clinical application.

Key?words：Artemisiae Argyi; Circadian Clock Genes; Chronopharmacology; Circadian Rhythm

艾葉（Artemisiae argyi）是菊科植物艾的干燥葉，廣泛應(yīng)用于治療各種炎癥、疼痛、婦科疾病、胎動、月經(jīng)不調(diào)等[1]。在中醫(yī)理論中，“陰”和“陽”是用以辨證施治的相對的哲學(xué)概念。艾葉性溫且干，略有升浮之性[2]，屬于“陽”性藥;因此，可以用來調(diào)理“陰”性病癥比如虛弱、衰老等。早在19世紀(jì)，西方科學(xué)家就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)藥物的服藥時間影響其治療作用，不同類型藥物的最佳給藥時間也各不相同[3]?，F(xiàn)代研究證明，人體的生理變化具有生物周期性，在生物鐘的控制調(diào)節(jié)下，人體的基礎(chǔ)代謝、體溫變化、新陳代謝、血糖含量和激素分泌等功能都具有節(jié)律性和峰谷值，致使藥物在吸收、分布、代謝和排泄等方面也成相應(yīng)改變[4]。因此，正確依據(jù)時辰給藥，可以實現(xiàn)以最小劑量，達(dá)到最佳療效，最小毒性的治療效果[5]。[JP] 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多哺乳動物體內(nèi)存在大量的日節(jié)律基因。其中有些基因參與生物鐘的調(diào)控，這些基因的改變可引起生物節(jié)律的異常，這些對維持生物體節(jié)律起關(guān)鍵性作用的日節(jié)律基因稱為鐘基因[6]。Clock和Bmal1為鐘基因的轉(zhuǎn)錄提供了最基本的動力[7]。在生物鐘基因調(diào)控的輔助環(huán)路-PAR蛋白復(fù)合體與E4BP4蛋白形成的輔助調(diào)節(jié)環(huán)路中：Bmal1和Clock的異源二聚體使DBP基因表達(dá)增加， 增加的DBP使 Bmal1/Clock 對 Per1/2 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的效率增強(qiáng)。相反，E4BP4則使Bmal1/Clock對Per1/2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的效率下降。因此， 在白天時，Bmal1/Clock被DBP誘導(dǎo)，從而促進(jìn)Per轉(zhuǎn)錄表達(dá);而在夜間將近時，Bmal1/Clock被E4BP4抑制，從而抑制Per轉(zhuǎn)錄表達(dá)[8]。在哺乳動物視交叉上核（SCN）中，Clock基因呈微弱的近日節(jié)律，在白天時量稍多，晚上時量略少，但是全天的表達(dá)水平相對比較恒定 [9]。

本實驗旨在研究艾葉早晚給藥對小鼠的生理節(jié)律的影響，分析艾葉精油對小鼠肝臟Bmal1和Clock生物鐘基因的影響，從而探索其臨床治療時辰規(guī)律，建議最佳用藥時間。

1?材料與方法

1.1?實驗材料?艾葉采自于湖北蘄春市，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院洪宗國教授鑒定。樣品（NO.S20180530）已存放于藥學(xué)院的植物標(biāo)本室。艾葉精油由本院洪宗國教授制備[2]，產(chǎn)率約為0.607%～0.953%，其主要成分為萜類化合物及其氧化物的混合物如4-萜烯醇、1，8-桉油腦、樟腦、龍腦等[10]（如圖1所示）。臨用前以橄欖油稀釋10倍備用。根據(jù)預(yù)實驗及文獻(xiàn)參考臨床安全用量，本研究中給藥劑量為0.5 mL/kg。其他試劑均為分析純。

1.2?動物實驗?48只昆明小鼠（18～22 g），♀♂各半，購自湖北省實驗動物中心。動物飼養(yǎng)在溫度（22±2）℃，12 h光照循環(huán)的房間中。將小鼠隨機(jī)分為8組，每組♀♂各3只。選取不同的時間，連續(xù)7 d腹腔注射給藥，在此期間，觀察記錄小鼠的臨床表現(xiàn)，并持續(xù)記錄小鼠的體重變化。最后一次給藥后，分別在10：00和22：00處死小鼠，取肝臟組織約50～100 mg放入Trizol液中低溫凍存。具體實驗方案如圖2所示。

1.3?實時熒光定量 RT-PCR 法檢測?采用實時熒光定量 RT-PCR 方法，以β-actin作為參照基因，檢測Bmal1、Clock生物鐘基因的相對表達(dá)水平。Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Master Mix10 μL 分別為 PrimerScript RT Enzyme Mix I（1.0 μL）、 RT Primer Mix×4（1.0 μL）、5×PrimeScript Buffer 2（for Real-time）（4.0 μL）、RNase Free dH2O（4.0 μL），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的總體積為 20 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，取 cDNA 2μL，TB Green Primix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各 0.8 μL，Rox Reference Dye or DyeⅡ（50×）0.4 μL，PCR 反應(yīng)總體積為 20 μL。使用以下擴(kuò)增體系進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增：Stage1 中先將 DNA 聚合酶在 95 ℃預(yù)熱變性 30 s，Stage2 在循環(huán)體系 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～40 s中循環(huán) 40 次。引物序列見表1。

1.4?統(tǒng)計方法?采用Graphpad-prism-8.3進(jìn)行統(tǒng)計分析，研究結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?臨床觀察?整個給藥過程中至實驗結(jié)束，各組小鼠均活動正常，體重呈穩(wěn)步增加的趨勢（數(shù)據(jù)未顯示）。在給與艾葉油后，部分小鼠出現(xiàn)給藥部位暫時局部刺激癥狀，但一般在給藥后兩天內(nèi)消失，且無異常表現(xiàn)。

2.2?艾葉油可顯著上調(diào)Bmal1、Clock基因mRNA表達(dá)?對照組小鼠Bmal1、Clock基因mRNA早晚表達(dá)比較平穩(wěn)，與上午10∶00對比，晚上22∶00的Bmal1基因水平約為其0.85倍;Clock基因水平約為其1.11倍。艾葉油對Bmal1和Clock基因的影響效果基本一致。從圖3和圖4中可以看出，艾葉油可顯著上調(diào)Bmal1、Clock基因mRNA表達(dá)，且上午給藥比晚上給藥mRNA相對表達(dá)水平更高。表明艾葉油此類“助陽”藥的最佳給藥時辰為上午。

2.3?雌雄之間Bmal1和Clock基因mRNA的表達(dá)差異?為了進(jìn)一步探討性別對生物鐘基因的影響，雌雄Bmal1和Clock基因 mRNA表達(dá)比例將與對照組相比。從圖5和圖6中可以看出，上午給藥的雄雌鼠Bmal1和Clock基因mRNA表達(dá)比例更高，差異更顯著;晚上給藥的雄雌鼠mRNA表達(dá)差異較小。表明艾葉油上午用藥對機(jī)體生物鐘基因的擾動較大，且艾葉油對不同性別的動物生物鐘基因的調(diào)控有一定程度的差異，雄性比雌性對艾葉油更敏感。

3?討論

生物的生命活動受晝夜節(jié)律的影響，生物的許多生理功能都具有明顯的晝夜節(jié)律。人體生理節(jié)律引起的體內(nèi)藥物濃度變化與藥物的治療效果密切相關(guān)[11]。生物鐘核心基因Bmal1和Clock是哺乳動物生命活動中最重要的中央時鐘元件之一，其突變可引起生物節(jié)律系統(tǒng)紊亂，甚至導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[12]。疾病的發(fā)生和臨床用藥都與晝夜節(jié)律有關(guān)。許多疾病都有晝夜波動，如哮喘、心絞痛、胃酸分泌、偏頭痛、癲癇、癌癥、關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病。另一方面，疾病的晝夜節(jié)律也會引起治療藥物的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的晝夜節(jié)律變化[13]。根據(jù)晝夜節(jié)律，定時給藥是中醫(yī)時間療法的特點之一。中國古人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在自然環(huán)境周期性變化的影響下，會發(fā)生人體陰陽的消長晝夜變化[14]。因此，應(yīng)根據(jù)晝夜節(jié)律增減藥物，以達(dá)到最佳效果。

本實驗結(jié)果表明，艾葉油給藥可以促進(jìn)小鼠生物鐘核心基因Clock、Bmal1的表達(dá)，從而改變小鼠的晝夜節(jié)律。在不同時間點對生物鐘基因Clock、Bmal1的晝夜節(jié)律有明顯不同的影響。在10∶00給藥比在22∶00點給藥mRNA相對表達(dá)量更高，說明小鼠在早上對艾葉油更敏感，藥效更好。本實驗充分驗證了白天是服用助陽藥藥效最佳時辰的理論，即艾葉油在早上使用效果更好。按照中醫(yī)理論，白天9點到13點之間是陽氣最盛的時候，疾病在病人的抵抗力的幫助下更容易治愈[15]。因此，只有在用藥時機(jī)與機(jī)體節(jié)律變化相一致的情況下，才能充分調(diào)動機(jī)體的積極免疫因素，提高藥物療效，甚至減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

此外，不同性別對藥物的反應(yīng)性也有所不同。本研究表明，艾葉油對雌性和雄性小鼠的生物鐘基因表達(dá)水平有一定程度的差異。雄性小鼠對艾葉油的敏感性略微高于雌性小鼠，對臨床用藥具有一定的參考意義。

4?結(jié)論

綜上所述，艾葉油可以促進(jìn)小鼠Bmal1、Clock生物鐘基因的表達(dá)，其早晚給藥對生物鐘基因影響具有顯著不同，且具有性別差異，可為其臨床應(yīng)用提供理論參考。

參考文獻(xiàn)

[1]李時珍.本草綱目（第一卷）[M].北京：北京文學(xué)出版社，1989.

[2]洪宗國.艾與蘄艾的生藥學(xué)研究與開發(fā)[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21（8）：1356-1357.

[3] RUTKOWSKA A，W PIEKOSZEWSKI J BRANDYS. Chronopharmacokinetics of amitriptyline in rats[J].Biopharmaceutics & drug disposition，1999，20（3）：117-124.

[4]郭萍，楊東. 時辰藥理學(xué)在服藥時間上的具體應(yīng)用及藥效學(xué)影響[J].中國臨床醫(yī)生雜志，2016，44（2）：26-28.

[5]房靜，張媛，侯芳菲，曹佳.時辰藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2018，30（3）：70-74.

[6]李然，彭小忠，曹濟(jì)民.哺乳動物日節(jié)律基因表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，25（7）：587-593.

[7]BUNGER M K， WILSBACHER L D， MORAN S M， et al.Mop3 is an essential component of the master circadian pacemaker in mammals[ J].Cell，2000（103）：1009-1017.

[8]SHUN Y， SHIGERU M， LILY Y， et al.Role of DBP in the circadian oscillatory mechanism [ J].Molecular Cellular Biol， 2000（20）：4773-4781.

[9]齊莎日娜，文勇立，王艷紅，等.生物鐘基因Clock研究進(jìn)展[J].四川草原，2006（2）：57-60.

[10]魏海勝.蘄艾化學(xué)成分的分析研究[D].武漢：中南民族大學(xué)，2013.

[11]石少棟，邸欣，王鑫，等.復(fù)方雷尼替丁分散片在 Beagle 犬體內(nèi)的時辰藥物動力學(xué)[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2015，32（40）：281-284.

[12]HARDIN P E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila[J]. Advances in Genetics，2011（74）：141-173.

[13]張立超，胡晉紅，朱全剛，等.疾病的晝夜節(jié)律及脈沖給藥系統(tǒng)[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2000，20（12）：738-740.

[14]高雪，李俠.中醫(yī)對血壓晝夜節(jié)律異常的認(rèn)識[J].中醫(yī)雜志，2016，57（20）：1798-1800.

[15]楊力強(qiáng)，蔣志洪.中醫(yī)擇時用藥及服藥規(guī)律探討[J].廣西中醫(yī)藥，2003，26（5）：22-24.

（收稿日期：2020-05-15?編輯：程鵬飛）