氧化微晶纖維素-殼聚糖接枝物的制備及表征*

陳淑花，于 馳，趙啟成，許利麗，孫婷婷，詹世平，王景昌

(大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622)

0 引 言

殼聚糖和氧化微晶纖維素由于其自身的優(yōu)異性能，比如生物降解性及相容性，對(duì)細(xì)胞無毒害等，引起了人們對(duì)生物高分子材料的極大興趣，主要關(guān)于在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展如：醫(yī)用敷料、創(chuàng)傷修復(fù)、藥物控釋等[1-2]。

作為甲殼類動(dòng)物骨架中最豐富的多糖之一，殼聚糖的來源十分廣泛，通常存在于幾種真菌和藻類的細(xì)胞壁中[3]，殼聚糖具有無毒性，無致敏性，無致突變性；生物降解性較好，具有抗菌性；還具有資源豐富，廉價(jià)易得易貯存等特點(diǎn)[4-6]。由于純殼聚糖膜具有較差的機(jī)械性能，這對(duì)其在醫(yī)用敷料方面的應(yīng)用有一定的限制。因此，已有實(shí)驗(yàn)將殼聚糖與天然或合成聚合物如纖維素等混合或交聯(lián)等來改變其力學(xué)性能[7-10]。

通過對(duì)微晶纖維素本身化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)纖維素分子結(jié)構(gòu)中葡萄糖基環(huán)含有3個(gè)醇羥基，纖維素自身的分子與分子之間通過氫鍵結(jié)合，因此纖維素的物理性能十分穩(wěn)定，具有結(jié)晶度較高以及機(jī)械性能較好等特點(diǎn)[11-12]。纖維素還具有良好的生物可降解性和生物相容性。但作為傷口敷料，它在生理液體中的溶解性受到一定的阻礙。因此，人們通過TEMPO三元復(fù)合氧化體系對(duì)微晶纖維素上的伯羥基改性，使其具備較大的比表面、高強(qiáng)度，低密度等特性，同時(shí)其氧化后的產(chǎn)物在溶液中具有良好的分散性，此外，它無毒，具有優(yōu)良的生物相容性、血液相容性和生物降解性。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用其氧化體系制備出的氧化微晶纖維素的羧基含量為16%～24%，止血性能最好[13]。

為了得到一種性能更好的生物材料，將CS與MCC(O)進(jìn)行接枝，通過改變?cè)虾虴DC/NHS的質(zhì)量比和反應(yīng)溫度，得到接枝率更高的產(chǎn)物，然后進(jìn)行性能測(cè)定，以期得到一種新型生物醫(yī)用材料。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)的原理主要是將TEMPO自由基在NaClO的氧化作用下先生成一種亞硝翁離子，使亞硝鎓離子與纖維素結(jié)構(gòu)單元上的伯羥基發(fā)生了親核反應(yīng)，從而選擇性的使伯羥基變?yōu)榱薈6羧酸鈉[14]。

圖1 氧化微晶纖維素的制備原理Fig 1 Preparation principle of oxidation microcrystalline cellulose

使用EDC作為交聯(lián)劑，NHS作為催化劑，將氧化微晶纖維素上的羧基與殼聚糖上的氨基形成酰胺鍵而結(jié)合。EDC/NHS組合在酰胺化反應(yīng)過程中經(jīng)常被使用，并且這兩種試劑無毒，可以通過透析或沖洗輕松去除[15-16]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

微晶纖維素，分析純，山東瑞泰化工有限公司；2，2，6，6四甲基哌啶-1-氧自由基，98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；殼聚糖(5萬)，分析純，南京奧多福尼生物科技有限公司；殼聚糖(20萬、100萬)，DD≥95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-乙基- ( 3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)，分析純，上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司；N-羥基琥玻酰亞胺(NHS)，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

電子天平，BS200S，d=0.001 g，北京賽多利斯天平有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，DF-101D，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；離心機(jī)，80-2，金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；循環(huán)水式真空泵，SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市英峪儀器廠；真空干燥箱，DZF-6020，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；冷凍干燥箱，F(xiàn)D-1A-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；紅外光譜儀，Nicolet 560，美國尼高麗紅外有限公司。

1.3 氧化微晶纖維素的制備

1.3.1 微晶纖維素的預(yù)處理

將5.0 g的微晶纖維素放入100 mL的NaOH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%)中，在60 ℃下磁力攪拌2 h。然后將其冷卻，抽濾，并用大量去離子水清洗，直至中性。將產(chǎn)物放在真空干燥箱中，在40 ℃下烘干備用。

1.3.2 微晶纖維素在TEMPO三元氧化體系中的改性

將2.0 g預(yù)處理的微晶纖維素放入Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液(pH約為10.83)中，在40 ℃下高速攪拌使其溶解。隨后按順序加入40 mg TEMPO，0.6 g NaBr，繼續(xù)攪拌，攪拌速度調(diào)為2 500 r/min，直至完全溶解。隨后加入8 mL NaClO溶液(用HCL調(diào)節(jié)pH為10.0)，然后每隔0.5 h加入一次NaClO溶液，控制速率，保持pH在10.0左右，反應(yīng)5 h[17]。結(jié)束后將其倒入燒杯中，加入過量乙醇，得到白色析出物，用無水乙醇清洗數(shù)次，抽濾[18]。將產(chǎn)物在60 ℃下真空干燥，得到產(chǎn)物氧化微晶纖維素。

1.4 殼聚糖溶液的配制

移取50.00 mL 2%的HAC溶液，稱取0.5 g殼聚糖放入其溶液中，在65 ℃下持續(xù)攪拌，使其完全溶解。

1.5 殼聚糖-氧化微晶纖維素接枝物的制備

在三頸燒瓶中分別加入0.5 g氧化微晶纖維素和50.00 mL去離子水，充N2除氧30 min，磁力攪拌使其充分溶解。隨后加入一定質(zhì)量比的EDC·HCL和NHS，在N2保護(hù)下攪拌活化30 min。然后向溶液中緩慢加入配好的殼聚糖溶液，使其充分混合，在一定溫度下攪拌24 h，隨后將溶液倒出，在溶液中緩慢滴加NaOH溶液，析出產(chǎn)物。然后，用去離子水洗滌至溶液為中性，離心干燥得到產(chǎn)物。

1.6 樣品表征

1.6.1 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

紅外光譜分析：使用傅里葉變換-紅外光譜儀(FTIR)測(cè)定殼聚糖-氧化微晶纖維素接枝物的紅外光譜圖。采用溴化鉀(KBr)壓片法進(jìn)行測(cè)試，波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1。

1.6.2 產(chǎn)物的接枝率檢測(cè)

氧化微晶纖維素接枝物的接枝率為接枝支鏈占氧化微晶纖維素基質(zhì)的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，按以下公式計(jì)算：

GR/%=(mG-mo)/mo×100%[19]

(1)

式中，GR為接枝率，mG為接枝產(chǎn)品的質(zhì)量，mo為接枝前氧化微晶纖維素的質(zhì)量。

1.6.3 產(chǎn)物的靜態(tài)水接觸角檢測(cè)

將CS、MCC、CS-g-MCC(O)溶于2%的醋酸溶液中，加熱攪拌使其充分溶解。然后將少量溶液均勻滴在載玻片上并干燥形成薄膜。取3 μL去離子水通過微量移液器滴加在待測(cè)膜的表面，使用儀器迅速拍下樣品膜的接觸角照片，并測(cè)量接觸角的大小。

1.6.4 產(chǎn)物的熱性能檢測(cè)

產(chǎn)物的熱性能通過差式掃描量熱儀進(jìn)行檢測(cè)。首先分別準(zhǔn)確稱量10.0000 mg的CS、MCC、CS-g-MCC(O)，小心放入坩堝內(nèi)，設(shè)定初始溫度為100 ℃，終止溫度為350 ℃，升溫速率為5 ℃/min。

1.6.5 產(chǎn)物的結(jié)晶性檢測(cè)

使用X-Xay Diffraction對(duì)CS、MCC、CS-g-MCC(O)的結(jié)晶性能進(jìn)行檢測(cè)。使用Cu靶X射線管，掃描角度范圍為5°～40°，掃描速度為1°/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化微晶纖維素

2.1.1 氧化微晶纖維素取代度分析

在30 mL的丙酮中放入0.5 g氧化微晶纖維素，攪拌10 min，加入7.5 mL二甲基亞砜，以同樣的轉(zhuǎn)速攪拌1 h，充分溶解樣品。以酚酞作為指示劑，用NaOH(0.1 mol/L)溶液標(biāo)定，溶液變粉紅色且不變色，記錄消耗的NaOH溶液體積V0。持續(xù)攪拌，加入10 mL的NaOH溶液(1 mol/L)，主要促進(jìn)氧化纖維素醋酸酯水解，攪拌2 h，然后加入50 mL熱水，使瓶壁周圍沖洗干凈，持續(xù)攪拌2～3 min。接著再加入2～3滴酚酞指示劑，用1 mol/LH2SO4溶液標(biāo)定，溶液逐漸變?yōu)闊o色，再多滴加4滴H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄所消耗的H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積C。持續(xù)攪拌，保持溶液充分混合，5 min后，用0.1 mol/L的NaOH溶液標(biāo)定，當(dāng)溶液呈粉紅色，并在1 min中內(nèi)不褪色，將所消耗的NaOH體積記為A。同時(shí)按相同的步驟做空白試驗(yàn)。

取代度DS=[(D-C)Na+(A-B)Nb]×6.005/W[20]

(2)

式中：A為滴定樣品所消耗的NaOH的體積，mL；B為滴定空白所消耗的NaOH的體積，mL；Nb為NaOH的濃度，mol/L；C為滴定樣品所消耗的H2SO4的體積，mL；D為滴定空白所消耗的H2SO4的體積，mL；Na為H2SO4的濃度，mol/L；W為所用樣品質(zhì)量，g。

通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：W=0.200 g，D=6.68 mL，C=1.95 mL，A=4.52 mL，B=13.76 mL求出取代度DS=16.98%，因此本實(shí)驗(yàn)采用的氧化微晶纖維素平均取代度在16.98%左右。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)羧基的含量保持在16%～24%范圍內(nèi)的時(shí)候，氧化纖維素便具有十分優(yōu)異的止血性能。因此，此實(shí)驗(yàn)所選用的氧化微晶纖維素具有十分優(yōu)良的止血能力。

2.1.2 氧化微晶纖維素羧基含量分析

將0.3 g氧化微晶纖維素放入到5 mL的NaCl溶液(0.01 mol/L)與55mL的去離子水混合溶液中，用0.1 mol/L的HCL溶液調(diào)pH值，介于2.5～3.0之間，再用0.1 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行標(biāo)定，用電導(dǎo)率儀器對(duì)滴定的曲線進(jìn)行記錄。

羧基含量(mmol/g)=C(V1-V2)/M×1 000[21]

(3)

式中：C為NaOH溶液濃度；V1為曲線平穩(wěn)初期消耗的NaOH標(biāo)液體積；V2為曲線平穩(wěn)后期消耗的NaOH標(biāo)液體積；M為氧化微晶纖維素的質(zhì)量。

圖3 電導(dǎo)率的滴定曲線圖Fig 3 Conductivity titration curve

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用TEMPO氧化體系在pH為10時(shí)進(jìn)行氧化反應(yīng)，其氧化后的纖維素羧基含量可達(dá)到1.4～1.7 mmol/g[22]。結(jié)合圖3和公式(3)，可以求得氧化微晶纖維素羧基含量為1.56 mmol/g，和研究結(jié)果相符合。

2.2 殼聚糖-氧化微晶纖維素接枝物

2.2.1 紅外光譜(FT-IR)分析

MCC(O)在1 740、1 638.05和1 414.33 cm-1出現(xiàn)-COOH的非對(duì)稱伸縮和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，在3 450 cm-1處出現(xiàn)O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰[22]。在上述CS光譜中，在3 432 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，即為氫鍵締合的O-H和N-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 638.18cm-1吸收峰歸屬為C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰[23]。而在MCC(O)-CS譜圖中，在1 616.06、1 542cm-1處出現(xiàn)吸收峰，歸屬于酰胺鍵的酰胺I、II譜帶，說明微晶纖維素氧化物和殼聚糖在羧基和氨基位置處通過形成酰胺鍵結(jié)合[24]。

圖4 接枝共聚物的紅外譜圖：(a)CS,(b)MCC(O)-CS,(c)MCC(O)Fig 4 FT-IR spectra of CS,MCC(O)-CS and MCC(O)

2.2.2 氧化微晶纖維素的接枝率

由表1可知，當(dāng)殼聚糖分子量為5萬，溫度為60 ℃，氧化微晶纖維素和殼聚糖的含量為1∶2，EDC和NHS的含量比為3∶1時(shí)，其接枝率最大。

表1 氧化微晶纖維素的接枝率

2.2.3 X射線衍射(XRD)分析

殼聚糖的衍射曲線在12.596°處具有弱的衍射峰,在19.947°處具有尖而強(qiáng)的衍射峰，峰形尖銳，結(jié)晶度高[25]；在12.105°、19.621°、21.619°處，氧化微晶纖維素顯示不同強(qiáng)度的衍射峰。殼聚糖/氧化纖維素接枝物的衍射曲線在12.576°、19.866°、21.459°處顯示不同強(qiáng)度的衍射峰，說明氧化纖維素的接入改變了殼聚糖原有的結(jié)晶性能，同時(shí)說明殼聚糖與氧化纖維素接枝聚合物的形成。圖5中，殼聚糖/氧化微晶纖維素接枝聚合物的衍射峰變寬，強(qiáng)度明顯減弱，說明其結(jié)晶性能減弱，無定形程度增大。這可能是因?yàn)闅ぞ厶堑摹狽H3+與氧化微晶纖維素的-COO-之間發(fā)生靜電作用，同時(shí)兩者形成分子間氫鍵，限制了分子鏈的運(yùn)動(dòng)，在凝固再生過程中很難發(fā)生結(jié)晶[26]。

圖5 接枝共聚物的XRD圖譜：(a) CS, (b)MCC(O),(c)MCC(O)-CSFig 5 XRD spectra of CS,MCC(O) and MCC(O)-g-CS

圖6 接枝共聚物DSC曲線圖：(a)MCC(O)-CS, (b) MCC(O),(c) CSFig 6 DSC spectra of MCC(O)-CS,MCC(O) and CS

2.2.4 熱穩(wěn)定性測(cè)試

由圖6可發(fā)現(xiàn)，殼聚糖、氧化微晶纖維素、殼聚糖/氧化微晶纖維素的最高分解溫度分別為260、310、310 ℃；接枝物的熱流量高于氧化纖維素的熱流量，說明接枝物在分解的過程中需要吸收的能量越多，這表明接枝物的熱穩(wěn)定性能更強(qiáng)。這表明在氧化微晶纖維素/殼聚糖接枝物中的兩種組分間的相互作用使得分解氧化微晶纖維素和殼聚糖分子中的糖苷鍵、C—H鍵、C—O鍵和C—C鍵更加困難，使其脫水、脫羧和脫羰難以進(jìn)行，從而提高了熱分解溫度，熱穩(wěn)定性能得到改善。

2.2.5 靜態(tài)接觸角測(cè)試

接觸角主要反映材料本身的親水性，其大小表明膜材料是否具有親水性。如果接觸角越小，表示親水性較好，制備的膜具有優(yōu)異的親水性，更好地吸收傷口滲出物，減少傷口表面細(xì)胞的粘連，傷口愈合加速。

圖7 接枝共聚物的接觸角液相圖Fig 7 Contact angle liquid phase diagram of CS, MCC(O)-CS and MCC(O)

圖7即為殼聚糖、氧化微晶纖維素/殼聚糖接枝物、氧化微晶纖維素的接觸角圖片，其都具有親水性，通過將殼聚糖接枝到氧化微晶纖維素上，提高了其親水性能，使性能得到了一定的改善，有利于傷口敷料的使用。

3 結(jié) 論

(1)為了優(yōu)化CS與MCC作為單體的性質(zhì)，通過EDC/NHS縮合體系制備CS-g-MCC(O)接枝共聚物，通過紅外和XRD測(cè)試，證實(shí)了殼聚糖-氧化纖維素接枝聚合物的形成。

(2)由XRD測(cè)試結(jié)果可知，氧化纖維素的接入改變了殼聚糖原有的結(jié)晶性能，其結(jié)晶性能減弱，無定形程度增大。

(3)通過DSC測(cè)試，發(fā)現(xiàn)接枝物的熱流量高于氧化纖維素的熱流量，表明其接枝物的熱穩(wěn)定性能更強(qiáng)。

(4)通過接觸角分析，發(fā)現(xiàn)接枝物的親水性能得到提升，可以更好的吸收傷口滲出物，利于傷口愈合。

(5)通過以上測(cè)試結(jié)果可知，將生物相容性良好的殼聚糖和氧化微晶纖維素進(jìn)行接枝，改善兩者的不足，生成性能更為優(yōu)異的生物醫(yī)用材料，促進(jìn)了生物醫(yī)用材料的發(fā)展。