鋅摻雜二氧化硅在雪菊中木犀草苷分析中的應(yīng)用*

韓 想， 阿迪拉·阿布都熱西提， 賀小剛，馮昱龍， 楚剛輝

(新疆藥食用植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 喀什大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000)

0 引 言

植物材料中的生物活性成分是新藥、功能性食品和食品添加劑的重要來(lái)源，這些活性成分主要是通過(guò)溶劑萃取從植物中得到的，這些活性成分具有多種結(jié)構(gòu)的化合物組成，如萜類，醌類，黃酮類和生物堿類化合物。在各種生物活性成分分離方法中吸附分離法因?yàn)槠渚哂懈咝В?jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，在研究領(lǐng)域中得到了普遍認(rèn)可和應(yīng)用[1-2]。木犀草苷是雪菊中的黃酮類活性成分之一，對(duì)雪菊的分析主要體現(xiàn)在對(duì)黃酮類物質(zhì)的提取及含量檢測(cè)方法研究，對(duì)分離提純等方面的研究相對(duì)較少[3-8]。木犀草苷是一種黃酮糖苷類化合物，即由木 犀草素結(jié)合一個(gè)單糖獲得的產(chǎn)物，研究表明，木犀草苷具有一系列藥理活性，如降低膽固醇含量，呼吸道殺菌作用以及抗腫瘤，抗感染，抗炎等作用，目前植物樣品中木犀草苷測(cè)定的方法較多的是色譜法及色譜聯(lián)用法，但這些方法卻在不同程度上存在著儀器成本較高，操作起來(lái)繁瑣，有機(jī)溶劑消耗量大等缺陷[9-14]。

由于檢測(cè)快速、易實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)、對(duì)樣品無(wú)損害等特點(diǎn)，近紅外光譜分析被許多行業(yè)如煙草生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)應(yīng)用和制藥分析等領(lǐng)域中大量使用[15-17]。為了進(jìn)一步改善近紅外光譜分析方法的靈敏度，前人在將吸附預(yù)富集技術(shù)與近紅外光譜技術(shù)相結(jié)合測(cè)定微量成分的研究中取得了許多研究成果[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素在一定條件下可以和某些金屬離子發(fā)生配位作用[21-23]，木犀草苷作為木犀草素的衍生物，基于這些研究，也可以考慮通過(guò)配位作用實(shí)現(xiàn)木犀草苷的分離富集。本研究通過(guò)制備的鋅摻雜二氧化硅作為吸附劑對(duì)雪菊所含的微量木犀草苷進(jìn)行富集，采用近紅外漫反射結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)實(shí)現(xiàn)其中木犀草苷的靈敏、選擇性檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料

AntarisⅡ近紅外光譜儀(美國(guó)Thermo 公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HY-2 型多用調(diào)速振蕩器(蘇省金壇醫(yī)療儀器廠)；TU-1900 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)( 北京普析通用儀器有限公司)；SF-TDL-2SOA低速離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；IR-200型紅外光譜儀(美國(guó)Thermo公司)；WS70-1紅外快速干燥箱(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

木犀草苷(上海晶純生化科技股份有限公司，98%)；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，98%)；無(wú)水乙醇、正硅酸乙酯、氫氧化鈉、甲醇、乙酸鋅等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鋅摻雜二氧化硅吸附材料的制備

稱量4.39 g乙酸鋅固體，加入甲醇試劑充分溶解，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，定容，靜置備用。在250 mL的三頸燒瓶加入50 mL無(wú)水乙醇、2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、10 mL正硅酸乙酯和50 mL 0.2 mol·L-1的乙酸鋅甲醇溶液，35 ℃水浴下攪拌1 h，之后添加10 mL 1% 氫氧化鈉溶液充分?jǐn)嚢?2 h；可能的合成機(jī)理見(jiàn)圖1。

最后利用低速離心機(jī)離心分離，收集最終產(chǎn)物，蒸餾水洗調(diào)節(jié)pH至7左右，最后無(wú)水乙醇再洗滌一次，離心，并將產(chǎn)物于60 ℃烘干待用。

圖1 鋅摻雜二氧化硅吸附劑合成機(jī)理Fig 1 Synthesis mechanism of zinc-doped silica adsorbent

1.2.2 木犀草苷的吸附試驗(yàn)

把木犀草苷作為分析測(cè)試對(duì)象，稱量0.25 g吸附劑(鋅摻雜二氧化硅材料)于100 mL的錐形瓶中，加入50.00 mL 配制好的木犀草苷樣品溶液，在常溫下于振蕩器中振蕩20 min，使用量筒式過(guò)濾器，收集濾渣進(jìn)行近紅外光譜分析；在349 nm處測(cè)量濾液的吸光度，計(jì)算木犀草苷的吸附率，公式如下：

上式中，B0和B表示木犀草苷溶液吸附前和吸附后的吸光值。

1.2.3 木犀草苷樣品的制備與富集

木犀草苷樣品存在于雪菊提取液中，雪菊提取液的制備如下：量取適量雪菊，浸泡在含50 mL 35%的甲醇水溶液的100 mL錐形瓶中，放置過(guò)夜，將雪菊樣品超聲30 min，并過(guò)濾，收集備用，將上述溶液制備成不同濃度的69個(gè)雪菊提取液，濃度范圍為0.05～15.0 mg·L-1。稱量0.25 g鋅摻雜二氧化硅吸附劑于100 mL錐形瓶中，將上述制備的69個(gè)雪菊提取液分別倒入放置了吸附劑的錐形瓶中，并將這69個(gè)錐形瓶分別于常溫下振蕩20 min，抽濾，濾渣晾干(室溫)，使用近紅外光譜直接檢測(cè)富集了木犀草苷的鋅摻雜二氧化硅吸附劑。將得到的69個(gè)固體樣本近紅外光譜，其中有47個(gè)定量校正模型，22 個(gè)預(yù)測(cè)樣本(9對(duì)重復(fù)樣本)，建立了近紅外光譜分析方法。

1.2.4 光譜測(cè)量方法

在波數(shù)為4 000～10 000 cm-1之間進(jìn)行掃描，4 cm-1的儀器分辨率，經(jīng)積分球漫反射模式采集所有樣品的近紅外光譜，光譜儀于室溫下預(yù)熱1 h后開(kāi)始進(jìn)行測(cè)量，每隔1 h對(duì)其進(jìn)行校正。每個(gè)樣品光譜及背景光譜均要經(jīng)過(guò)64次掃描，并進(jìn)行3次重復(fù)裝樣后測(cè)量，以提高儀器的信噪比，降低誤差。3次測(cè)量的光譜數(shù)據(jù)取平均值，以考慮樣品內(nèi)部的變異性以及堆積密度和粒徑的差異。圖2為69個(gè)樣品的近紅外光譜，為了揭示近紅外光譜數(shù)據(jù)中存在的信息，必須通過(guò)一個(gè)校準(zhǔn)的過(guò)程來(lái)建立預(yù)測(cè)模型。校準(zhǔn)階段使用的樣本數(shù)據(jù)集必須代表當(dāng)前和未來(lái)的預(yù)測(cè)樣本。這意味著在校準(zhǔn)和驗(yàn)證樣本數(shù)據(jù)集中必須考慮所有預(yù)期的變異源。在這里我們使用了偏最小二乘回歸(PLSR)來(lái)構(gòu)建校正模型。并使用TQ analyst 9儀器軟件包選擇了4 188.6～9 009.8 cm-1的波長(zhǎng)范圍。

圖2 69個(gè)雪菊樣本的近紅外光譜Fig 2 Near-infrared diffuse reflectance spectra of the 69 luteoloside samples

2 結(jié)果與討論

2.1 鋅摻雜二氧化硅吸附劑的紅外光譜

分別將二氧化硅與鋅摻雜二氧化硅吸附劑和KBr按1:100～200壓片，掃描300～4 000 cm-1范圍內(nèi)紅外光譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)與二氧化硅吸附劑的紅外光譜(a曲線)相比較，鋅摻雜二氧化硅吸附劑的紅外光譜(b曲線)在3 400～3 200 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了氨基伸縮振動(dòng)峰，在3 000～2 700 cm-1出現(xiàn)了飽和C-H伸縮振動(dòng)峰，在1 600 cm-1左右處出現(xiàn)了碳碳雙鍵伸縮振動(dòng)峰，在1 375 cm-1左右出現(xiàn)了甲基的C-H對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰，在720 cm-1左右出現(xiàn)了—(CH2)n—的面內(nèi)搖擺振動(dòng)峰。與二氧化硅的紅外光譜相比，鋅摻雜二氧化硅吸附劑中這些新峰的出現(xiàn)說(shuō)明了金屬離子鋅已經(jīng)結(jié)合到SiO2上。吸附木犀草苷后的鋅摻雜二氧化硅吸附劑的紅外光譜(c曲線)在3 400～3 200 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了氨基伸縮振動(dòng)峰，在1 650～1 560 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)氨基的彎曲振動(dòng)峰，但這兩個(gè)峰明顯比b曲線吸收減弱，說(shuō)明木犀草苷吸附到了鋅摻雜二氧化硅吸附材料上。

圖3 二氧化硅(a)，鋅摻雜二氧化硅吸附材料(b)和吸附木犀草苷后鋅摻雜二氧化硅吸附材料(c)的紅外光譜Fig 3 Infrared spectrogram of silicon and zinc-doped silica adsorption materials before and after adsorption of luteoloside

2.2 鋅摻雜二氧化硅對(duì)木犀草苷的吸附

為考察所制備的鋅摻雜二氧化硅吸附劑對(duì)木犀草苷的吸附情況，分別對(duì)木犀草苷水溶液和吸附抽濾后的濾液檢測(cè)紫外光譜，并將兩者的紫外光譜繪圖做對(duì)比，如下圖4。

由圖可知：在波長(zhǎng)為349 nm下，木犀草苷出現(xiàn)了特征吸收，對(duì)比木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg·L-1)的吸收曲線(a)，被鋅摻雜二氧化硅吸附材料吸附后的吸收曲線(b)顯示，在349 nm處的吸光度明顯減少。根據(jù)吸附材料上的官能團(tuán)推測(cè)，它對(duì)木犀草苷的吸附機(jī)理可能是由于鋅與木犀草苷上的羥基絡(luò)合所致[24-26]，可能的機(jī)理見(jiàn)圖5，由圖5可以看出，鋅摻雜二氧化硅的吸附材料對(duì)木犀草苷的吸附效果比較好。

圖4 木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液吸附前(a)及吸附后(b)的紫外光譜Fig 4 UV spectra change for luteoloside before and after the adsorption

圖5 木犀草苷的吸附機(jī)理Fig 5 Adsorption mechanism of luteoloside

2.3 影響鋅摻雜吸附劑吸附木犀草苷過(guò)程的因素

2.3.1 質(zhì)量對(duì)吸附能力的影響

準(zhǔn)確配制10 mg·L-1木犀草苷的水溶液，用電子天平準(zhǔn)確稱得0.15、0.20、0.25、0.30 g的吸附材料，分別加入100 mL錐形瓶中再向瓶中加入50.00 mL木犀草苷水溶液，充分振蕩20 min后進(jìn)行抽濾并取其清液，于波長(zhǎng)為349 nm下分別測(cè)定它們的吸光度，根據(jù)1.2.2的方法計(jì)算吸附率，并以吸附率對(duì)吸附材料用量(質(zhì)量)作圖，其結(jié)果如下圖6(a)。由圖可以看出，木犀草苷的吸附率隨著吸附材料的質(zhì)量增加而增加，當(dāng)吸附材料的質(zhì)量是0.25 g時(shí)吸附率為最大即87.1%，之后吸附率幾乎不再變化，故吸附材料的最恰當(dāng)使用質(zhì)量為0.25 g。

2.3.2 pH對(duì)吸附能力的影響

另外，對(duì)pH的影響進(jìn)行討論，準(zhǔn)確配制pH為2、4、6、7、8、10的濃度均為10 mg·L-1的木犀草苷溶液。稱量0.25 g的鋅摻雜二氧化硅吸附劑，按照1.2.2的方法振蕩吸附，于波長(zhǎng)為349 nm下測(cè)定吸附后的吸光度，計(jì)算吸附率，并用吸附率對(duì)pH作圖，見(jiàn)下圖6(b)。由圖可知：木犀草苷的吸附率隨著pH值的增大而增大，在pH大于或等于7時(shí)，木犀草苷的吸附率基本不再發(fā)生變化，基本趨于穩(wěn)定狀態(tài)，因此選擇pH為7的中性條件下進(jìn)行吸附，且此時(shí)木犀草苷的吸附率為86.7%。

2.3.3 時(shí)間對(duì)吸附能力的影響

配制10 mg· L-1木犀草苷的水溶液，稱量0.25 g鋅摻雜二氧化硅吸附劑，在室溫下振蕩2、5、10、20、30、40、60 min，離心后取上層清液，在波長(zhǎng)為349 nm下測(cè)定它們的吸光度并計(jì)算其吸附率，以吸附率對(duì)吸附時(shí)間作圖，見(jiàn)下圖6(c)。由圖可知，振蕩時(shí)間在20 min時(shí)木犀草苷的吸附率到達(dá)最大值，在此時(shí)間下吸附率達(dá)到了87.1%，因此20 min為最佳振蕩時(shí)間。

圖6 質(zhì)量(a)、pH(b) 及時(shí)間(c)對(duì)吸附的影響Fig 6 Effects of quality, pH and time on the adsorption

2.4 用近紅外光譜定量分析木犀草苷的結(jié)果

2.4.1 建立木犀草苷定量校正模型

根據(jù)PLS建立了木犀草苷定量模型，為了完善定量校正模型，采用多元散射校正(MSC) 、一階導(dǎo)數(shù)(1st ) 、Savitzky-Golay(SG) 平滑、 小波變換(CWT) 、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)對(duì)光譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行了預(yù)處理[27-28]。根據(jù)蒙特卡洛交叉驗(yàn)證(MCCV) 法得到模型的因子數(shù)為6、7、8，不同的光譜預(yù)處理方法得到的木犀草苷PLS 定量校正模型的結(jié)果見(jiàn)表1 。這是由于近紅外光譜中既包含了木犀草苷的信息，也包含有鋅摻雜二氧化硅吸附劑中的成分、樣品基質(zhì)等干擾。通過(guò)Matlab 程序?qū)崿F(xiàn)以上各種光譜預(yù)處理和PLS定量模型的建立，表1中顯示的是各種光譜預(yù)處理后得到的木犀草苷定量模型的預(yù)測(cè)能力，每一種預(yù)處理方法所得的定量預(yù)測(cè)模型分別通過(guò)三個(gè)參數(shù)：預(yù)測(cè)殘差值(RPD)、交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)和相關(guān)系數(shù)R檢驗(yàn)。木犀草苷的預(yù)測(cè)濃度與實(shí)際濃度之間的相關(guān)性是由R體現(xiàn)的，預(yù)測(cè)濃度與實(shí)際濃度的偏離程度則是由RMSECV來(lái)體現(xiàn)的。根據(jù)之前發(fā)表的文獻(xiàn)表明，光譜預(yù)處理方法得到的定量校正模型可以應(yīng)用在定量預(yù)測(cè)的前提是RPD大于2.5，RPD 越大得到的定量結(jié)果越準(zhǔn)確[29]。與無(wú)處理方法作比較，從表1 的結(jié)果可以看出，樣品的光譜經(jīng)CWT、一階導(dǎo)數(shù)(1st ) 、二階導(dǎo)數(shù)(2nd ) 、SNV +CWT、SNV+1st 處理后，校正模型的R值減小、RMSECV 值增大、RPD 值減小，表明這些與處理方法可以有效改善定量結(jié)果； 而經(jīng)過(guò)MSC、MSC+CWT、SNV、MSC+1st方法處理后，模型與無(wú)處理方法相比，R值增大，RMSECV 誤差減小，RPD 值增大，這四種光譜預(yù)處理方法結(jié)果表明背景干擾均得到一定消除，這些結(jié)果表明對(duì)木犀草苷的定量預(yù)測(cè)能力有所提高。為了讓預(yù)測(cè)的結(jié)果更準(zhǔn)確，我們選擇了SNV 方法讓選擇誤差最小，RPD值最大來(lái)處理全部樣品的近紅外光譜。研究表明，樣品微粒分布不均勻及微粒體積不同產(chǎn)生的散射會(huì)使光譜中含有大量干擾信息，而SNV作為一種常用的光譜校正和增強(qiáng)技術(shù)，它可以校正樣品散射產(chǎn)生的光譜誤差，從而產(chǎn)生更好的校正和預(yù)測(cè)性能[30]。

表1 木犀草苷PLS 模型及交叉驗(yàn)證的結(jié)果

2.4.2 木犀草苷定量模型的論證

為了檢驗(yàn)定量校正模型的預(yù)測(cè)結(jié)果，我們用了22 個(gè)外部預(yù)測(cè)集樣品(9 對(duì)重復(fù)樣本)檢驗(yàn)了所建立的偏最小二乘模型。預(yù)測(cè)集樣品使用了和校正集樣品一樣的光譜測(cè)量條件、制備方法、建模方法。圖7顯示了預(yù)測(cè)集樣品(實(shí)心圈)和校正集樣品(虛心圈)的關(guān)系圖，圖上的參考濃度體現(xiàn)了兩種樣品集中偏最小二乘模型中參考濃度與預(yù)測(cè)濃度兩者的擬合關(guān)系，以 HPLC測(cè)定的結(jié)果為準(zhǔn)，圖7結(jié)果得到預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)為0.6498 mg·L-1，預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)為0.9909，木犀草苷預(yù)測(cè)集樣本回收率的范圍在87%～118%內(nèi)，說(shuō)明木犀草苷校正模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品有較好的預(yù)測(cè)結(jié)果，模型穩(wěn)健有效。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，雖然存在吸附劑、樣品基質(zhì)的干擾，但經(jīng)過(guò)對(duì)近紅外光譜的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV) 法預(yù)處理，仍能夠采集樣品光譜中木犀草苷的定量信息，能夠較為準(zhǔn)確地測(cè)定雪菊提取液中的木犀草苷。

圖7 木犀草苷參考濃度和預(yù)測(cè)濃度相關(guān)關(guān)系Fig 7 Relationship of predicted concentration and the reference values of luteoloside

3 結(jié) 論

(1)通過(guò)簡(jiǎn)單溫和的方法實(shí)現(xiàn)了鋅摻雜二氧化硅吸附劑的制備，吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該吸附劑對(duì)木犀草苷具有良好的吸附效果。在紅外光譜表征后，將它作為用于雪菊提取液中木犀草苷的富集與近紅外光譜檢測(cè)的吸附劑。

(2)把木犀草苷當(dāng)作分析對(duì)象，考察了吸附劑時(shí)間、質(zhì)量和pH 對(duì)吸附能力的影響，結(jié)果表明在吸附劑質(zhì)量為0.25 g，中性條件下常溫振蕩吸附20 min 時(shí)，對(duì)木犀草苷的吸附率接近90%，表現(xiàn)出吸附劑對(duì)木犀草苷的檢測(cè)靈敏度有所提升。

(3)使用近紅外漫反射光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)雪菊中的木犀草苷進(jìn)行定量分析。分析結(jié)果表明，用SNV 對(duì)近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理效果最好，并且使用了PLSR方法建立木犀草苷的定量校正模型。其中用22個(gè)樣本(9 對(duì)重復(fù)樣本) 當(dāng)作預(yù)測(cè)集對(duì)回歸模型的準(zhǔn)確性實(shí)行了驗(yàn)證。在較低濃度范圍0.05～15.0 mg·L-1內(nèi)，預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)為0.9909，預(yù)測(cè)集樣本的回收率在87%～118%之間，實(shí)現(xiàn)了雪菊提取液中木犀草苷微量級(jí)的定量預(yù)測(cè)。