基于GEO芯片聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學探討當歸飲子治療慢性蕁麻疹的cross-talk及miRNA-mRNA機制*

包成通，魏歆然，張依依，鐘 峰，匡泓俊，牛子青，劉小娟，王 璐，李俊熙，章 薇△

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

慢性蕁麻疹（CU）[1]是因皮膚黏膜的小血管短暫通透性增加，而出現(xiàn)局限性水腫的一種常見慢性疾病，以易反復發(fā)作，遷延不愈，難以根治為主要特征，以皮膚風團、瘙癢、水腫等為主要臨床表現(xiàn)，發(fā)病機制主要與自身免疫、感染、炎癥反應等相關。CU屬中醫(yī)學“白疹”“癮疹”“風疹”等范疇[2]，病機總屬本虛標實，與血虛風燥相關，氣血虧虛，衛(wèi)外失護，開泄失度，外邪（風邪為主）乃入；氣血阻滯，精液不暢，布達難榮，化燥生風，風盛則瘙癢，正邪交爭于皮膚腠理，發(fā)為癮疹[3]。當歸飲子出自《重訂嚴氏濟生方》[4]，由荊芥、黃芪、白蒺藜、何首烏、防風合四物湯組成，具有養(yǎng)血和營、祛風止癢之功，皮膚疥瘡，或癢或腫，或膿或發(fā)赤者適用，臨床上治療CU具有較好療效，主要與調節(jié)免疫、抑制炎癥反應有關，但深層機制尚不明確。本研究基于生物信息學技術，采用GEO芯片聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學的方法，初步探討當歸飲子治療CU的cross-talk及miRNA-mRNA深層機制，為后期實驗及臨床驗證提出理論現(xiàn)實依據(jù)，為CU的臨床治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 慢性蕁麻疹差異基因分析 以慢性蕁麻疹“Chronic Urticaria”為檢索詞，在NCBI基因表達GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索，獲取GSE57178芯片表達數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集中包括6個病變皮膚樣本，7個非病變皮膚樣本，5個正常皮膚樣本。本研究采用R語言“l(fā)imma”包對比分析6個病變皮膚樣本（GSM1376737、GSM1376739、GSM1376741、GSM1376743、GSM1376745、GSM1376747） 與 5個正常皮膚樣本 （GSM1376750、GSM1376751、GSM 1376752、GSM1376753、GSM1376754），以│logFC│>1；P-value<0.05為篩選條件，篩選出慢性蕁麻疹的差異基因（Differential Expression Genes；DEGs），并繪制DEGs火山圖。

1.2 當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點篩選 通過TCMSP[5（]http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）數(shù)據(jù)庫，以口服生物利用度（OB）≥30%；藥物類藥性（DL）≥0.18為篩選條件[6-7]，獲取當歸飲子中藥有效成分。

通過PubChem[8（]https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫收集當歸飲子中藥有效成分SDF結構式。

通過Swiss Target Prediction[9（]http：//www.swis stargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，將當歸飲子中藥有效成分SDF結構式導入，獲取當歸飲子潛在靶點。

通過R語言“VennDiagram”包繪制當歸飲子潛在靶點與慢性蕁麻疹DEGs韋恩圖，以獲取當歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點。

1.3 當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點PPI網(wǎng)絡構建及拓撲分析 通過String[10（]https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，導入當歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點，獲取PPI網(wǎng)絡相關信息，采用Cytoscape 3.7.2軟件對PPI信息進行網(wǎng)絡可視化。采用“Network Analysis”對PPI分析，設定 0＜Degree≤5 為“粉紅色”；5＜Degree≤10 為“藍色”；10＜Degree≤15“大紅色”；“Degree”值越大則節(jié)點越大，可信分數(shù)越高則線條越粗；“Combined Score”值越大，邊越粗。采用“CytoHubba”對 PPI進行“Closeness”、“Betweenness”、“MCC”拓撲分析，以篩選出當歸飲子治療慢性蕁麻疹的關鍵靶點（Hub-gene）。

1.4 當歸飲子治療慢性蕁麻疹的cross-talk機制初探通過DAVID[11]（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）數(shù)據(jù)庫，導入當歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點，獲取KEGG富集分析數(shù)據(jù)。采用R語言“ggplot2”包，以富集倍數(shù)為橫軸；通路為縱軸；-lgP為顏色；基因數(shù)為氣泡大小繪制KEGG富集分析氣泡圖。從當歸飲子治療慢性蕁麻疹的KEGG通路中，篩選出蕁麻疹最相關通路，采用R語言“circlize”包繪制“基因—KEGG”弦圖，以尋找出當歸飲子治療慢性蕁麻疹關聯(lián)性最強的通路靶點，同時采用 R語言“UpSetR”包繪制“基因—KEGG”UpSet圖，以篩選出當歸飲子治療慢性蕁麻疹的具體cross-talk通路靶點。

1.5 當歸飲子治療慢性蕁麻疹的miRNA-mRNA機制初探利用TargetScan[12]（http：//www.targetscan.org/mamm_31/）數(shù)據(jù)庫反向預測當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點mRNA的miRNA，篩選并收集保守性miRNA，同時利用Cytoscape 3.7.2軟件構建miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡調控模式。設定miRNA為方塊、灰色；mRNA為菱形、紅色。

2 結果

2.1 慢性蕁麻疹差異基因分析結果 采用R語言limma包對GEO芯片進行差異分析，以│logFC│>1；P-value<0.05為篩選條件獲取DEGs，分析出257個差異基因，其中240個基因表達上調（如：HIF1A、MMP12、STAT3等）；有17個基因表達下調（如：FABP7、KRT15、LGR5 等）。以“l(fā)ogFC”為橫軸，“-lgP”為縱軸，差異上調基因設為“紅色”，差異下調基因設為“藍色”，繪制 DEGs火山圖（圖 1）。

圖1 慢性蕁麻疹差異基因火山圖

2.2 當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點篩選結果 通過TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫，共獲取當歸飲子中藥有效成分共202個，其中黃芪15個（如：Mairin、Jaranol、Bifendate等），白芍 13個（如：Paeoniflorgenone、Lactiflorin、beta-sitosterol等），川芎 7個（如：Wallichilide、Perlolyrine、Myricanone等），當歸 2 個（如：beta-sitosterol、Stigmasterol），防風 18 個（如：Anomalin、Divaricatacid、Ammidin等），何首烏 73個（如：beta-sitosterol、Tricin、Rhein等），蒺藜 12個（如：Terrestriamide、Isorhamnetin、Sitosterol等），荊芥 11個（如：Diosmetin、Sitosterol、Schizonepetoside B 等），生地黃 51個（如：Acteoside、Daucosterol、Glutinoside等）。

通過PubChem、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，對上述202個當歸飲子中藥有效成分進行靶點預測，去除重復值，保留唯一值后，共獲取964個當歸飲子潛在靶點。采用R語言“VennDiagram”包繪制當歸飲子潛在靶點與慢性蕁麻疹DEGs韋恩圖（圖2），獲取36個當歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點（表1）。

圖2 當歸飲子潛在靶點與慢性蕁麻疹DEGs韋恩圖

表1 當歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點

2.3 當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點PPI網(wǎng)絡構建及拓撲分析結果 通過String數(shù)據(jù)庫，采用Cytoscape 3.7.2軟件對PPI信息進行網(wǎng)絡可視化及網(wǎng)絡分析（圖3），該PPI網(wǎng)絡中，共有36個節(jié)點，91條邊，P<1.0e-16，平均節(jié)點度為5.06，平均聚類系數(shù)為0.584。根據(jù) Degree 值排序顯示：ITGB2＞TLR4＞STAT3＞VCAM1＞10，表示此4個靶點在當歸飲子治療慢性蕁麻疹中作用最強。同時采用“CytoHubba”對PPI進行“Closeness”、“Betweenness”、“MCC”拓撲分析（圖 4），以篩選出 Hub-gene（表 2）。

圖3 當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點PPI網(wǎng)絡圖

表2 當歸飲子治療慢性蕁麻疹Hub-gene

圖4 當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點拓撲分析網(wǎng)絡圖

2.4 當歸飲子治療慢性蕁麻疹的cross-talk機制 通過DAVID數(shù)據(jù)庫，獲取KEGG富集分析數(shù)據(jù)，采用R 語言“ggplot2”“circlize”“UpSetR”包，分別繪制“基因—KEGG”氣泡圖、弦圖、UpSet圖。當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點共富集17條KEGG通路，如氣泡圖所示（圖5A）：NF-kappa B通路、HIF-1通路、TNF通路等。通路富集的基因靶點，如弦圖所示 （圖 5B）：NF-kappa B 通路由 LYN、VCAM1、TLR4、ICAM1基因靶點富集；HIF-1通路由STAT3、HIF1A、TLR4基因靶點富集；TNF通路由VCAM1、SELE、ICAM1基因靶點富集等。cross-talk是通路共同基因靶點相互“串話”，激活2條以上通路，介導一種或多種表型的機制模式，當歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點中cross-talk機制如UpSet圖所示（圖5C）：1個靶點（SELE）在TNF通路與細胞粘附分子（CAMs）2條通路中“串話”；1個靶點（ITGB2）在吞噬體與CAMs 2條通路中“串話”；2個靶點（CTSL、CTSS）在抗原處理表達、吞噬體與溶酶體3條通路中“串話”；2個靶點（VCAM1、ICAM1）在 NF-kappa B、TNF與CAMs 3條通路中“串話”；1個靶點（TLR4）在 HIF-1、NF-kappa B、吞噬體 3條通路中“串話”。

圖5 當歸飲子治療慢性蕁麻疹“基因—KEGG”氣泡圖（A）、弦圖（B）、UpSet圖（C）

2.5 當歸飲子治療慢性蕁麻疹的miRNA-mRNA機制 TargetScan數(shù)據(jù)庫反向預測當歸飲子治療慢性蕁麻疹的miRNA，其中36個潛在靶點中，共有24個潛在靶點 mRNA（如：TLR4、HIF1A、STAT3等）存在保守 miRNA（如：miR-140-5p；miR-542-3p；miR-489-3p等）調控，構成了477組miRNA-mRNA模式（如 ：miR-140-5p-TLR4；miR-199a-5p-HIF1A；miR-370-3p-STAT3等），相互作用結果如圖6。

圖6 相互作用結果

3 討論

cross-talk即“串話”[13]，原指通信線路上信號雜散耦合到其他通信線路造成干擾的現(xiàn)象，在細胞信號通路相關研究中，認為細胞間信號通路是一個復雜的網(wǎng)絡體系，單一信號通路在一定條件下會受到其它信號通路的影響，從而產生了細胞生物學界的“信號串話”。 miRNA[14]是微小的非編碼RNA，主要通過結合靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（UTR），導致靶mRNA進行切割或轉錄抑制。在CU的治療中cross-talk與miRNA-mRNA機制是當前的熱點問題。

當歸飲子由荊芥、黃芪、白蒺藜、何首烏、防風、當歸、川芎、白芍、生地黃組成，方中四物湯養(yǎng)血活血，補通同用；何首烏養(yǎng)血滋陰，祛風止癢；黃芪益氣實表，托毒行滯；白蒺藜、防風、荊芥散風邪以止癢，全方共奏養(yǎng)血、滋陰、潤燥、祛風之功，善治CU之血虛風燥證。當歸飲子治療CU血虛風燥證具有較好的療效，且在實驗中得到廣泛驗證，葉靜靜[15]對168例CU患者進行RCT，發(fā)現(xiàn)當歸飲子能顯著降低患者血清中MDA含量，抗氧化應激以提高免疫，從而降低CU復發(fā)率，改善患者瘙癢、水腫等癥狀。徐風等[16]研究證實當歸飲子能下調LC3II、p62表達，促進自噬小體形成，改善CU水腫及毛細血管擴張，但其深層機制尚未明確，需待進一步研究。

本研究旨在利用生物信息學算法研究當歸飲子治療CU的cross-talk及miRNA-mRNA機制。GEO芯片差異分析出257個差異基因，240個基因表達上調，17 個基因表達下調（如：FABP7、KRT15、LGR5等）。網(wǎng)絡藥理學方法分析出當歸飲子有效成分及潛在靶點共964個，取潛在靶點與差異基因交集后得到36個當歸飲子治療CU的潛在靶點；對篩選分析出的當歸飲子治療 CU的潛在靶點進行 PPI、KEGG、cross-talk及miRNA預測分析，以初步明確當歸飲子治療CU的分子機制。

當歸飲子治療CU的PPI網(wǎng)絡分析中，有36個節(jié)點（基因），91條邊，拓撲分析出 TLR4、STAT3、ITGB2等18個關鍵基因，能初步認為此18個基因可能在當歸飲子治療CU中作用最強。研究發(fā)現(xiàn)CU患者外周血中TLR4顯著升高，TLR4能誘導IL-6和MIP-1α分泌，介導CU患者免疫炎癥反應[17]，同時研究發(fā)現(xiàn)當歸飲子中有效成分當歸多糖[18]在多種疾病中能抑制TLR4表達[19-20]，抑制炎癥反應。Luo等[21]研究發(fā)現(xiàn)CU患者皮膚組織中JAK2/STAT3信號通路被激活，炎癥細胞增殖，此過程能被OSMR能被抑制，同時王麗新[22]提出STAT3是檢測CU臨床療效的潛在客觀指標之一。因此可認為36個當歸飲子治療CU的靶點中的18個可作為潛在的臨床療效標志物及治療靶點。

cross-talk是通路共同基因靶點相互“串話”，激活2條以上通路，介導一種或多種表型的機制模式，本研究以KEGG富集分析為切入點，結合關聯(lián)性弦圖及UpSet圖，將篩選出的“通路串話”靶點進行可視化（如：TLR4可能在HIF-1、NF-kappa B、吞噬體3條通路中“串話”等）。Pei等[23]研究發(fā)現(xiàn)IL-38能通過HIF-1與NF-kappa B信號通路，降低HIF-1α、NFΚB p65與TLR4表達，抑制炎癥反應，在大鼠模型中初步驗證了TLR4可能參與HIF-1與NF-kappa B信號通路之間的串話，在炎癥反應中發(fā)揮作用。Hu等[24]研究發(fā)現(xiàn)內皮細胞表面的雙鏈蛋白聚糖（BGN）與其受體TLR2、TLR4結合，激活HIF-1與NF-kappa B信號通路，增強HIF-1α、NF-κB啟動子之間的相互作用，從而刺激下游VEGF表達。本研究構建的cross-talk“通路串話”機制模式，雖已有部分在實驗中驗證，但仍有大量的cross-talk模式尚未研究，因此不僅可作為當歸飲子治療CU的分子機制，而且也為其他疾病的治療提供了新的思路。

miRNA是一類廣泛存在于動植物中，對轉錄后基因表達調控起關鍵作用的內源性小非編碼RNA。成熟miRNA先與RNA誘導沉默復合體（RISC）的復合物結合，再特異性與下游靶mRNA的3’UTR形成不完全互補配對，阻斷轉錄后翻譯，從而調控基因表達，此過程稱為miRNA-mRNA互作模式。本研究初步篩選出TLR4、HIF1A、STAT3在內的24個潛在靶點的477組miRNA-mRNA模式（如：miR-140-5p-TLR4；miR-199a-5p-HIF1A；miR-370-3p-STAT3等）。Ching-Kow等[25]通過miRNA微陣列技術發(fā)現(xiàn)CU患者中有16種差異miRNA（DEMs），其中5個miRNA（miR-2355-3p、261-3p、4264、2355-5p、29c-5p）與7個上調mRNA（FBXL20，OPHN1，YPEL2，STARD9，SELE，KLHL24，ING4） 相互作用明顯，對CU疾病的診斷與治療提出了指導性的建議，構建的miRNA-mRNA模式中與本研究篩選的miR-6835-3p-SELE、miR-6893-3p-STAT3；miR-140-5p-TLR4等相互吻合，因此本研究構建的當歸飲子治療CU的miRNA-mRNA模式能成為后續(xù)實驗驗證的潛在分子機制模式。

綜上所述，本研究采用GEO芯片聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學的方法，篩選出當歸飲子治療CU的關鍵靶點，構建了蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡，并進一步從通路、cross-ralk、miRNA-mRNA機制角度得出當歸飲子治療CU可能通過 TLR4參與的HIF-1、NF-kappa B、吞噬體3條通路中“串話”機制發(fā)揮作用，同時miR-140-5p-TLR4的相互作用關系可能在其中發(fā)揮重要作用，同時得出當歸飲子治療CU的多靶點、多cross-ralk、多miRNA-mRNA機制將成為未來機制研究的新方向。本研究從基因、分子角度預測和分析了當歸飲子治療CU的作用機制，為后續(xù)研究提供了依據(jù)。