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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清瘟解熱合劑治療新型冠狀病毒肺炎的作用機(jī)制*

    2020-12-08 08:24:20朱波宇王洪武張翟軼崔換天廖家抱溫偉波
    關(guān)鍵詞:合劑靶點(diǎn)通路

    朱波宇,楊 璐,王洪武,張翟軼,李 欽,崔換天,廖家抱,溫偉波△

    (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617;2.云南省中醫(yī)醫(yī)院,云南 昆明 650021;3.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省動(dòng)物細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266237;4.嘉興市中醫(yī)醫(yī)院,浙江 嘉興 314033)

    今年初,湖北省武漢市出現(xiàn)了由新型冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)。COVID-19 具有傳播迅速廣泛、傳染性強(qiáng)、各類人群普遍易感的特點(diǎn),目前臨床尚無特效藥[1]。中醫(yī)藥作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥,在納入新型冠狀病毒肺炎診治方案后,取得了突出的療效。COVID-19在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里屬于“疫病”的范疇,多為外邪侵入機(jī)體,體內(nèi)正氣不足導(dǎo)致。運(yùn)用中醫(yī)理論進(jìn)行辨證,病因?yàn)楦惺芤哽逯畾?,病位在肺,基本病機(jī)特點(diǎn)為“濕、熱、毒、瘀”[2-3]。

    清瘟解熱合劑(Qingwen Jiere Mixture)是立足于中醫(yī)對“瘟疫”的防治理論而研制的中藥復(fù)方制劑。主要成分有:藿香、柴胡、黃芩、連翹、法半夏、草果、茵陳、馬蹄香、滑石、甘草、白薇、炒神曲、炒厚樸。藿香具有芳香化濕、和胃止嘔的功效;柴胡可以疏散退熱、升舉陽氣;黃芩和連翹能清熱、瀉火解毒;半夏可燥濕化痰、降逆止咳、消痞散結(jié);草果能燥濕溫中、截瘧祛痰;茵陳可清利濕熱,利膽退黃;馬蹄香內(nèi)服消風(fēng)散氣解暑,利尿通淋去積;滑石為寒涼藥物,能清熱解暑,保護(hù)腸壁;甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒和調(diào)和諸藥的功效,在驅(qū)邪的同時(shí)又扶助正氣;白薇能清熱涼、利尿通淋;厚樸歸肺經(jīng)、脾經(jīng),可以燥濕行氣、消痰平喘;神曲辛溫,歸脾胃經(jīng),具有消食和胃的功效。本方配伍用藥具有清熱化濕,芳香避穢,燥濕止瀉等功效;對于治療COVID-19感染輕中癥、疑似患者及時(shí)疫感冒癥見發(fā)熱身痛,咽痛咳嗽,腹脹痞滿,大便黏膩臭穢或便溏腹瀉,納差乏力等具有顯著療效。在我國新冠肺炎疫情暴發(fā)時(shí),清瘟解熱合劑用于云南省定點(diǎn)醫(yī)院及湖北省咸寧市部分受援單位,臨床療效顯著。清瘟解熱合劑用于老撾、緬甸等我國周邊國家及地區(qū),同樣取得了良好的臨床療效。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種常見的研究中藥復(fù)方作用機(jī)制的方法,從中醫(yī)的整體觀念出發(fā),結(jié)合辨證論治的方法,多種學(xué)科交叉運(yùn)用,構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò),探求疾病和藥物的聯(lián)系[4],為解釋中藥復(fù)雜作用機(jī)制提供了方法。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索清瘟解熱合劑的活性成分和靶點(diǎn),進(jìn)一步推測其治療COVID-19的作用機(jī)制,為清瘟解熱合劑臨床用于新型冠狀病毒肺炎治療,提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 清瘟解熱合劑成分篩選 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái) TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/lsp/tcmsp.php)[5]以“藿香,柴胡,黃芩,連翹,法半夏,草果,茵陳,馬蹄香,甘草,滑石,厚樸,白薇,神曲”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行查詢。中藥復(fù)方通常以口服為主,口服生物利用度(oral bioavailability,OB)是藥物吸收、分布、代謝、排泄(ADME)中重要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)之一,表示口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達(dá)體循環(huán)并吸收的速度與程度,OB值越高通常表示藥物的生物活性越好[6]。類藥性(drug-like,DL)是指化合物與已知藥物的相似性,是化合物能夠成為藥物的評價(jià)指標(biāo)[7],通常以O(shè)B≥30%,DL≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選得到清瘟解熱合劑的活性成分。

    1.2 有效成分靶點(diǎn)的預(yù)測和基因名的確定 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫對清瘟解熱合劑的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,再利用 UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)[8]規(guī)范與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白,獲得靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名。

    1.3 疾病靶點(diǎn)的篩選 以“corona virus disease 2019”和“novel coronavirus pneumonia”作為關(guān)鍵詞,在 OMIM 數(shù)據(jù)庫[9](http://omim.org/)和 Genecards數(shù)據(jù)庫[10(]https://www.genecards.org)中搜索疾病相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用Venny平臺(tái)(版本2.1,http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將清瘟解熱合劑作用靶點(diǎn)與COVID-19靶點(diǎn)取交集,得到清瘟解熱合劑治療COVID-19的相關(guān)靶點(diǎn)。

    1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)建立 將1.3得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)[11],得到蛋白相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖。蛋白間的連線越多,關(guān)聯(lián)度越大,成為核心靶點(diǎn)的概率越高。

    1.5 GO分析和KEGG分析 將篩選出來的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 DAVID 數(shù)據(jù)庫[12](http://www.david.niaid.nih.gov)中進(jìn)行基因功能(gene oncology,GO)富集分析,運(yùn)用 KOBAS3.0 數(shù)據(jù)庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)對核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)基因通路富集分析,以 p≤0.05、q≤0.05作為篩選指標(biāo),并對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

    1.6 藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的建立 在Cytoscape3.7.2[13]中導(dǎo)入預(yù)測藥物的活性成分、核心靶點(diǎn)以及相關(guān)聯(lián)的通路,構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò),通過網(wǎng)絡(luò)對其相互作用機(jī)制進(jìn)行闡述。

    1.7 清瘟解熱合劑藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立 方中飲片的歸經(jīng)信息從2015年版《中國藥典》中獲取,通過查取歸經(jīng)信息構(gòu)建清瘟解熱合劑的藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

    2 結(jié)果

    2.1 清瘟解熱合劑成分篩選結(jié)果 清瘟解熱合劑活性成分篩選共得到1 357種,其中甘草280種、法半夏116種、藿香94種、茵陳53種、草果59種、連翹150種、黃芩58種、柴胡288種、馬蹄香3種、滑石1種、白薇81種、炒厚樸139種、炒神曲35種。以O(shè)B≥30%,DL≥0.18,篩選后共有264種成分符合條件,見圖 1、表 1。

    表1 清瘟解熱合劑包含化學(xué)成分的對應(yīng)靶標(biāo)數(shù)

    圖1 清瘟解熱合劑各味藥物主要有效成分?jǐn)?shù)量

    2.2 有效成分靶點(diǎn)收集結(jié)果 在TCMSP中查詢到510個(gè)有效成分靶點(diǎn),將有效成分靶點(diǎn)名稱導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫,得到靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名。

    2.3 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果 在OMIM數(shù)據(jù)庫和Genecards數(shù)據(jù)庫中共收集到752個(gè)COVID-19相關(guān)靶點(diǎn),其中OMIM數(shù)據(jù)庫中有493個(gè)靶點(diǎn),Genecards數(shù)據(jù)庫中有259個(gè)靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)和藥物成分靶點(diǎn),取交集最終得到32個(gè)清瘟解熱合劑治療COVID-19的潛在靶點(diǎn),見圖2。

    圖2 藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

    2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中有30個(gè)作用節(jié)點(diǎn),共231條相互作用連線。其中白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、趨化因子(C-C motif ligand 2,CCL2)和絲裂原活化蛋白激酶 1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)的連通度較高,是核心靶點(diǎn),見圖3、表2。

    表2 靶點(diǎn)連通度

    2.5 靶點(diǎn)通路分析 GO功能富集分析得到GO條目共283條,其中生物過程(BP)條目226個(gè),細(xì)胞組成(CC)條目 26個(gè),分子功能(MF)條目 31個(gè),分別占80%、9%、11%。我們根據(jù)P值將生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)中的各前 15名列出,見表3。

    圖3 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

    表3 清瘟解熱合劑GO生物功能富集分析

    KEGG通路富集分析共得到232條通路,根據(jù)p值篩選出與COVID-19有關(guān)的前10條通路,包括IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、Th17細(xì)胞分化(Th17 cell differentiation)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等通路,見表4。

    2.6 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出來靠前的30條通路和藥物預(yù)測有效成分和疾病潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2,通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)來闡釋其復(fù)雜的作用機(jī)制,不同節(jié)點(diǎn)分別代表、成分、靶點(diǎn)、通路。紅色三角代表-靶點(diǎn),藍(lán)色四邊代表-信號通路,綠色四邊代表-活性成分,連線代表-各點(diǎn)之間的相互關(guān)系,見圖4。

    2.7 清瘟解熱合劑藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)清瘟解熱合劑的歸經(jīng)信息,構(gòu)建藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò),圖中黃色方塊表示藥材,綠色圓表示歸經(jīng)。途中連接最密切的三個(gè)節(jié)點(diǎn)是肺 lung)、脾(spleen)和胃(stomach),連接度分別是8,8,8,說明大多數(shù)藥材的歸經(jīng)是肺經(jīng)、脾經(jīng)和胃經(jīng)。清瘟解熱合劑中13味中藥大部分中藥歸肺、脾、胃三經(jīng),說明可能對由“濕熱”導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎具有很好的治療作用,見圖5。

    表4 KEGG富集通路分析結(jié)果

    圖4 清瘟解熱合劑治療新型冠狀病毒肺炎“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

    圖5 清瘟解熱合劑藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖

    3 討論

    自新型冠狀病毒肺炎爆發(fā)以來,全國疫情防控阻擊戰(zhàn)取得重大戰(zhàn)略成果,然而世界范圍內(nèi),情況依然不容樂觀。針對新型冠狀病毒肺炎,目前臨床還沒有特效藥。雖然有報(bào)道稱已經(jīng)篩選了部分藥物用于臨床,但其是否有確切的治療作用尚不明確,部分藥物還處于試驗(yàn)階段,不能廣泛運(yùn)用于治療中。中醫(yī)藥作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥,在疫病的防治上具有獨(dú)特的見解。2003年,中醫(yī)藥用于重癥急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)治療的有效性和安全性得到了廣泛的認(rèn)可[14]。吳鞠通的《溫病條辨》云:“溫疫者,厲氣流行,多兼穢濁,家家如是,若役使然也?!盵4]新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)范疇屬于“疫病”,致病原因多為外感疫毒邪氣,入里化熱,在臨床上以“急則治標(biāo),緩則治本,標(biāo)本兼治”作為治療原則,祛邪外出的同時(shí)兼顧扶助正氣。最新發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診治方案(試行第七版)》[15]指出,患者以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn),少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀。從中醫(yī)的角度分析,其病位在肺,兼在脾胃,病因?yàn)椤皾穸疽摺?,因邪氣侵肺,耗傷衛(wèi)氣而出現(xiàn)發(fā)熱、咽痛咳嗽;濕邪困脾而導(dǎo)致大便黏膩臭穢或便溏腹瀉。根據(jù)中醫(yī)理論分析,清瘟解熱合劑中的藥物多歸肺脾胃經(jīng),主要治療邪犯肺衛(wèi)、濕邪困脾。半夏、藿香辛溫歸脾胃肺經(jīng),能化濕止嘔;茵陳清利濕熱;草果燥濕溫中,截瘧祛痰;連翹、黃芩苦寒,清熱解毒、疏散風(fēng)熱、燥濕;柴胡疏散退熱,升舉陽氣;甘草補(bǔ)脾益氣,抵抗病邪;馬蹄香、滑石、白薇能利尿通淋;厚樸燥濕行氣、消痰平喘;神曲能消食和胃。使用此方能清熱化濕,芳香避穢,燥濕止瀉,在臨床治療患者具有良好的療效。

    基于臨床治療結(jié)果,部分SARS-CoV-2感染者后期病癥加重,甚至出現(xiàn)死亡的情況,可能與“炎癥風(fēng)暴”有關(guān),而“炎癥風(fēng)暴”的本質(zhì)是細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)。細(xì)胞因子在人體中有著重要的作用,調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、血管發(fā)生、免疫和炎癥反應(yīng)等。當(dāng)患者感染病毒后,血清中的促炎因子會(huì)增加,從而導(dǎo)致肺部炎癥和相應(yīng)的肺組織損傷。過度的免疫反應(yīng)激活大量的免疫細(xì)胞,對肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管造成彌漫性損傷,大量液體滲出到氣管中阻塞氣道,從而造成呼吸窘迫[16]。蛋白互作分析結(jié)果表明,IL6、TNF、CCL2、MAPK1等可能為清瘟解熱合劑治療COVID-19的核心靶點(diǎn)。此外,通過比較KEGG通路富集分析的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)這些核心靶點(diǎn)顯著富集在IL-17信號通路、Th17細(xì)胞分化、腫瘤壞死因子信號通路等通路上。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)是一種細(xì)胞中的重要信號傳導(dǎo)分子[17],在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,MAPK激活后可促進(jìn)細(xì)胞癥因子表達(dá)[18-19]。與此同時(shí),一些促炎性因子如TNF-α、IL6等,都可以激活MAPK通路從而加劇炎癥反應(yīng)[17]。在炎癥反應(yīng)中,TNF-α是一種出現(xiàn)最早、最重要的炎性因子,主要由單核巨噬細(xì)胞以及其它免疫細(xì)胞產(chǎn)生。在機(jī)體感染病毒時(shí),TNF-α可通過激活 T細(xì)胞促進(jìn) IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等細(xì)胞因子的產(chǎn)生及分泌,從而介導(dǎo)一系列炎性反應(yīng)[20]。CC趨化因子配體2(CCL2)是CC類趨化因子家族的成員,是人類發(fā)現(xiàn)最早的、有活性的趨化因子。當(dāng)CCL2與其相應(yīng)受體結(jié)合后可活化單核/巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和Th2細(xì)胞,并向炎癥部位聚集。有研究表明由支氣管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的CCL2可能會(huì)加重氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性[21]。對肺炎患者血清中的細(xì)胞因子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)重癥患者血清中的IL-6、TNF-α等明顯高于非重癥患者,這說明這些患者癥狀的加重與這些細(xì)胞因子的升高有關(guān)。Th17細(xì)胞是新型CD4+T細(xì)胞亞群,在免疫調(diào)節(jié)方面具有至關(guān)重要的作用,Th17細(xì)胞可以分泌IL-6、TNF-α和IL-17等多種效應(yīng)因子,并通過其來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。IL-6可以調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的數(shù)目并誘導(dǎo)其發(fā)育[22]。因此,清瘟解熱合劑可能通過調(diào)控這些通路改善COVID-19患者的炎癥反應(yīng)。

    綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對清瘟解熱合劑中有效成分治療新型冠狀病毒肺炎的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,清瘟解熱合劑可能是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路來協(xié)同作用的。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是大數(shù)據(jù)時(shí)代下的新興的學(xué)科,通過虛擬篩選技術(shù)初探了清瘟解熱合劑對COVID-19的治療作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù),但由于研究方法本身具有局限性,需要在臨床中進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

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