普洱茶醇提物對非酒精性脂肪性肝病小鼠的肝保護(hù)作用研究*

賈 璐，柯 旺，李 襄，邢 玥，徐 梅，楊 雋，趙 榮，欒云鵬△

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 云南 昆明 650021）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種非酒精所致的，以肝臟中脂類所占比重過高及肝臟細(xì)胞脂肪變性為特征的臨床綜合征[1]。NAFLD是導(dǎo)致慢性肝臟疾病的主要原因。近年來隨著相關(guān)代謝綜合征和肥胖癥在全球大范圍流行，NAFLD的發(fā)病率也逐步升高且患者日漸年輕化，已成為我國較為普遍的疾病[2-3]。目前已知有多種原因可引發(fā)NAFLD，臨床上最常見的原因是肥胖，約50%～75%的肥胖患者合并有不同程度的NAFLD，因此調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝正?；瘜χ委烴AFLD有積極意義。普洱茶是一類深受大眾歡迎的保健茶，其浸出物包含茶堿、咖啡堿、茶多酚以及維生素等多種生理活性物質(zhì)。近年來，普洱茶在解毒、降血脂、抑菌等方面有較多的應(yīng)用研究[4-5]。本試驗以高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型為基礎(chǔ)，探討普洱茶醇提物在改善脂質(zhì)代謝紊亂及肝臟病理損傷中的效用，為開發(fā)安全有效的NAFLD干預(yù)保護(hù)及輔助治療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡ICR小鼠50只，雄性，平均體質(zhì)量（24.87±2.91）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，生產(chǎn)批次：SCXK（湘）2016-0002。小鼠在空調(diào)動物飼養(yǎng)室中同室群籠飼養(yǎng)，室溫（22±2）℃，濕度40%～70%，自然光照，每日定時通風(fēng)。自由采食和飲水，每日更換墊料、鼠籠并洗滌飲水瓶。

1.2 藥物與試劑 基礎(chǔ)鼠糧（江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司）；全脂奶粉（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；魚肝油乳（國藥控股星鯊制藥廈門有限公司）。普洱茶（熟茶）（中國普洱茶研究院，編號：532721-616）；無水乙醇、石油醚、正丁醇、多聚甲醛（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，AR）；苦味酸（臺山市眾城化工有限公司，AR）；TG、TC、AST、ALT 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；HE染色試劑盒（上海榕柏生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 SW-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（中國浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；TU-1901紫外/可見分光光度儀（上海菁華科技儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA集團(tuán)）；DMi1倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；101-1AB電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 高脂鼠糧制備 每100 g基礎(chǔ)鼠糧加入豬油50 g，雞蛋液 60 g，全脂奶粉 20 g，魚肝油 50 g，食鹽1 g，混勻攪拌成糊狀，捏制成直徑不超過5 cm的圓餅，放入微波爐大火烤5 min后翻面再烤5 min即得。

1.4.2 普洱茶膏的制備 普洱茶（熟茶）購自中國普洱茶研究院。茶樣打磨成粉，過80目篩，取100 g茶粉與1 000 mL 95%乙醇混合進(jìn)行抽提，重復(fù)3次后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再冷凍干燥至恒重后即得固態(tài)膠狀茶膏，保存于4℃，使用時以蒸餾水溶解茶膏得水溶劑，灌胃。

1.4.3 動物分組及給藥 50只健康ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)抽取10只作為空白對照，剩余40只用于構(gòu)建NAFLD小鼠模型。在建模期間，空白對照組飼喂基礎(chǔ)鼠糧，建模組飼喂高脂鼠糧，每隔1周記錄小鼠體質(zhì)量，持續(xù)至第19周。通過體質(zhì)量變化及生理行為觀測確認(rèn)建模成功后，將40只NAFLD小鼠隨機(jī)分為：模型組10只、高劑量治療組15只、低劑量治療組15只，對高、低劑量組進(jìn)行為期6周的普洱茶干預(yù)治療。治療期間所有ICR小鼠均飼喂基礎(chǔ)鼠糧，自由飲水；高、低劑量組額外增加普洱茶醇提物灌胃治療。根據(jù)多項普洱茶提取物經(jīng)口毒性試驗結(jié)果，受試個體最保守 LD50為＞5.0 g/kg·bw[6-7]，設(shè)置高劑量為5.0 g/kg·bw，低劑量為 2.0 g/kg·bw，每日灌胃 1 次。

1.4.4 指標(biāo)檢測 每天進(jìn)行生理行為觀察，每周測量1次體質(zhì)量。治療期結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死小鼠。通過眼眶靜脈叢釆集全血，分離血清，測定血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesteral，TC）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的含量；取肝臟經(jīng)液氮研磨后的上清液，測定肝臟中TG、TC、AST、ALT的含量。分離腹腔脂肪、腎周脂肪以及睪丸周圍脂肪稱重，計算體脂肪（體脂肪總量=腹腔脂肪+腎周脂肪+睪周脂肪）[8-9]。取小鼠肝臟稱重，計算肝臟指數(shù)（肝臟指數(shù)=解剖時提取的肝臟濕重/斷水?dāng)嗉Z12 h后小鼠體質(zhì)量×100%）。取部分肝臟置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)醇脫水、透明、石蠟包埋后制成切片，HE染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 22.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法處理。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化 實驗初始，空白組與NAFLD建模小鼠采用隨機(jī)分組方式，初始體質(zhì)量（25.01±2.89）g、（24.57±2.67）g，組間體質(zhì)量無差異。高脂鼠糧飼喂19周，NAFLD建模組小鼠明顯表現(xiàn)出慵懶、行動緩慢、精神萎靡的癥狀，且毛發(fā)有油膩感，進(jìn)食減少，體質(zhì)量遠(yuǎn)高于空白對照組小鼠（P＜0.05），提示造模成功。建模完成后，治療期起始（記為0周），連續(xù)灌胃6周，模型組、高劑量組、低劑量組小鼠體質(zhì)量均高于正常組，但組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。普洱茶灌胃治療期間，與模型組相比，高、低劑量治療組平均體質(zhì)量降低（P＜0.05），其中高劑量組體質(zhì)量基本達(dá)到空白對照組水平，精神狀態(tài)也有所恢復(fù)。以上結(jié)果表明，普洱茶醇提物能有效降低高脂飲食導(dǎo)致的體質(zhì)量增加，并改善由此引發(fā)的異常行為表現(xiàn)，見表1。

表1 普洱茶對小鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）

表1 普洱茶對小鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）

注：與同期空白組比較，*P＜0.05；與同期模型組比較，△P＜0.05。

組別 N/支 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周空白組 10 39.15±3.79 40.12±3.50 40.67±3.84 41.25±3.28 41.83±3.11 42.21±2.78 42.61±3.04模型組 10 45.43±2.23* 46.21±2.78* 45.53±3.31* 45.72±2.95* 46.34±3.02* 46.58±2.46* 47.13±2.35*高劑量組 15 45.54±2.57* 45.43±3.56* 44.21±3.98*△ 44.52±3.78*△ 43.71±4.06△ 43.31±3.31△ 42.71±2.94△低劑量組 15 45.47±2.93* 45.44±3.12* 44.71±2.96*△ 44.84±3.18*△ 44.51±3.20*△ 43.71±3.59△ 43.52±3.16△

2.2 臟器及血清脂質(zhì)含量變化 肝臟指數(shù)能在一定程度上反映肝臟的病理學(xué)改變。與空白組比較，模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著增高（P＜0.05）。經(jīng)過普洱茶醇提物治療后，治療組小鼠肝臟指數(shù)較模型組明顯降低（P＜0.05），并呈現(xiàn)出一定的劑量趨勢。治療組小鼠體內(nèi)儲存性脂肪與模型組相比明顯減少（P＜0.05），表現(xiàn)為腹腔及睪周脂肪含量雖仍高于空白組小鼠，相較于模型組同一部位的脂肪含量下降顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，普洱茶能在一定程度上降低NAFLD小鼠體內(nèi)脂肪組織沉積，在控制肥胖引起的肝臟重量增加方面效果更為明顯，表現(xiàn)出良好的肝臟保護(hù)作用，見表2。

表2 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟指數(shù)及體脂含量的影響（±s）

表2 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟指數(shù)及體脂含量的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 N/支 肝臟指數(shù)/% 腹腔脂肪/g 腎周脂肪/g 睪周脂肪/g 體脂肪總量/g空白組 10 3.32±0.13 0.12±0.04 0.21±0.12 0.19±0.08 0.52±0.15模型組 10 5.05±0.21* 0.18±0.04* 0.28±0.14* 0.71±0.21* 1.17±0.26*高劑量組 15 4.10±0.06△ 0.16±0.02△ 0.27±0.10 0.54±0.11△ 0.96±0.13△低劑量組 15 4.68±0.16△ 0.17±0.05△ 0.27±0.12 0.53±0.14△ 0.97±0.19△

甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平能進(jìn)一步反映體內(nèi)脂肪代謝的紊亂程度。與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織和血清中TG、TC的含量明顯升高（P＜0.05）。經(jīng)普洱茶醇提物治療后，高、低劑量組小鼠的肝臟與血清中TC、TG水平較模型組明顯下降，并呈現(xiàn)出一定的劑量趨勢（P＜0.05），表明普洱茶能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低血清和肝臟中脂肪含量的作用，見表3。

表3 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟與血清中TC、TG的影響（±s）

表3 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟與血清中TC、TG的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別N/支肝TC/（mmol·L-1）肝TG/（mmol·L-1）血TC/（mmol·L-1）血TG/（mmol·L-1）空白組 10 1.51±0.06 0.71±0.12 1.10±0.08 1.24±0.09模型組 10 3.22±0.07* 2.12±0.16* 2.31±0.12* 2.98±0.21*高劑量組 15 2.14±0.12△ 1.02±0.03△ 1.33±0.17△ 1.96±0.08△低劑量組 15 2.70±0.09△ 1.72±0.11△ 1.63±0.15△ 2.25±0.16△

2.3 轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST活性 肝臟中富含各種轉(zhuǎn)氨酶，其中ALT、AST是臨床上常用的檢測肝細(xì)胞受損程度的指標(biāo)。與空白組比較，模型組小鼠肝臟和血清中AST、ALT的活性明顯升高（P<0.05），提示肝細(xì)胞受損。經(jīng)普洱茶醇提物治療后，治療組的AST、ALT水平都明顯下降（P<0.05），且存在劑量依賴性。可見普洱茶醇提物在緩解肝細(xì)胞受損、降低轉(zhuǎn)氨酶方面療效顯著。

表4 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟與血清中ALT、AST的影響（±s）

表4 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟與血清中ALT、AST的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別N/支肝ALT/（U·L-1）肝AST/（U·L-1）血ALT/（U·L-1）血AST/（U·L-1）空白組 10 47.30±3.23 21.00±3.98 92.85±4.99 49.35±6.59模型組 10 96.86±4.21* 52.71±2.25* 176.18±5.34* 77.16±2.26*高劑量組 15 60.69±4.65△ 29.56±1.32△ 118.45±6.47△ 55.95±6.55△低劑量組 15 82.91±3.87△ 43.18±2.51△ 143.98±3.56△ 64.84±6.54△

2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 各組小鼠的肝臟切片經(jīng)HE染色后置于低倍鏡下觀察，空白組肝臟組織小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富，染色均勻，細(xì)胞核明顯，未見明顯異常。NAFLD模型組中可見肝細(xì)胞腫脹，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)存在彌漫性脂肪空泡，并可融合成細(xì)胞內(nèi)大的脂滴。這表明高脂鼠糧飼喂方式成功構(gòu)建了NAFLD小鼠模型，且在不經(jīng)藥物處理，換喂基礎(chǔ)鼠糧6周后，肝臟脂肪沉積狀況并無改善。經(jīng)普洱茶醇提物治療后，不同劑量治療組的肝臟病理情況明顯改善，高劑量組肝臟雖還有許多脂肪空泡，但數(shù)量和大小較模型組已顯著減少；低劑量組的改善效果較模型組不夠明顯。表明普洱茶醇提物對NAFLD肝臟細(xì)胞的脂肪變性具有較好的改善作用，且治療恢復(fù)能力與劑量相關(guān)，見圖1。

圖1 肝臟組織HE染色（×200）

3 討論

NAFLD是肥胖和代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）累及肝臟的表現(xiàn)，治療單純性脂肪肝階段的首要目標(biāo)是減肥和改善胰島素抵抗（insulin resistance，IR），預(yù)防和治療 MetS、Ⅱ型糖尿?。═2DM）及其相關(guān)并發(fā)癥，從而減輕疾病負(fù)擔(dān)、改善患者生活質(zhì)量并延長壽命[10]。在減肥方面，普洱茶作為一種傳統(tǒng)降脂減肥茶備受歡迎。徐湘婷等[11-12]發(fā)現(xiàn)普洱茶湯能較好地抑制高脂模型動物的體質(zhì)量與血脂，減輕高脂飼料誘發(fā)的大鼠肝臟脂肪變性程度，并且可能與抗氧化相關(guān)的超氧化物歧化酶SOD和GSH-PX活性有關(guān)，認(rèn)為普洱茶可能通過抗脂質(zhì)過氧化來調(diào)節(jié)血脂紊亂。熊昌云[13]探討了普洱茶乙酸乙酯萃取層及水層分離物對小鼠體內(nèi)脂肪代謝相關(guān)酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)前者呈劑量效應(yīng)降低小鼠體內(nèi)肝脂肪酸合成酶活性及血清瘦素含量，并且二者在一定程度上抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的活力和增殖，同時促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞的脂解，減少其數(shù)量和體積，從而減少甘油三酯的整體含量。研究認(rèn)為普洱茶主要通過茶褐素、茶多糖、茶多酚及發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的他汀類物質(zhì)直接影響食物攝入、吸收，抑制脂肪合成、加快脂肪分解，從而達(dá)到減肥降脂的效果[14]。Huan等[15]深入探討了普洱茶中的茶褐素通過腸道菌群和膽汁酸代謝改善高膽固醇血癥的機(jī)制，提示了腸道菌群在脂代謝中的重要作用。

本研究通過飼喂高脂飼料構(gòu)建了NAFLD小鼠模型，建模成功后采用普洱茶醇提物進(jìn)行灌胃治療，各治療組的肝臟指數(shù)、肝臟脂質(zhì)和主要血脂指標(biāo)與模型組相比都明顯降低，證實普洱茶醇提物在降脂減肥方面有顯著功效。相比水提物，普洱茶醇提物中主要含茶多酚、兒茶素類及沒食子酸等，茶褐素、可溶性糖及可溶性蛋白等含量則明顯偏低，提示普洱茶醇提物與水提物的降脂減肥機(jī)制可能存在差異[11]。針對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等的體外研究表明，普洱茶醇提物的抑菌效果顯著，且95%醇提物抑菌效果強(qiáng)于水提物及75%醇提物[16-17]。由此我們推測普洱茶醇提物可能對實驗小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了一定影響，進(jìn)而影響到脂代謝的調(diào)節(jié)，對于該假設(shè)的驗證實驗還需進(jìn)一步開展。

臨床研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者肝臟和血清中ALT、AST的水平與正常個體存在差異，中度NAFLD患者的肝臟AST、ALT出現(xiàn)輕度或中度升高，而重度NAFLD會引起AST、ALT顯著增高[18]。此外，當(dāng)NAFLD由單純性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎（nonalco holic steatohepatitis，NASH）發(fā)展過程中，也伴隨AST、ALT含量的明顯上升，而NASH被認(rèn)為是NAFLD進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的分水嶺[19-20]，可見ALT、AST的含量是評估NAFLD的重要指標(biāo)。本研究構(gòu)建的NAFLD模型小鼠肝臟及血液中ALT、AST的含量遠(yuǎn)高于空白組，經(jīng)過6周的普洱茶醇提物治療后，二者含量均明顯降低，表明普洱茶具有修復(fù)受損肝細(xì)胞并阻止NAFLD進(jìn)一步向肝纖維化發(fā)展的功效。此外，治療組小鼠腹腔、腎周及睪周脂肪量降低有限，高、低劑量治療效果差異也不明顯，而肝臟指數(shù)和肝臟脂質(zhì)得到顯著改善且與劑量相關(guān)，推測普洱茶醇提物在改善肝臟脂肪代謝方面更有優(yōu)勢，其具體作用機(jī)制有待深入研究。

雖然治療組小鼠的各項指標(biāo)較模型組有明顯改善，但部分指標(biāo)仍與空白組存在一定差距。例如治療組小鼠僅體質(zhì)量基本恢復(fù)到空白組水平，體脂、血脂、ALT、AST的含量雖呈下降趨勢，仍高于正常組，可能與普洱茶醇提物成分或作用較為單一以及用藥周期較短有關(guān)，另一方面也顯示出干預(yù)和治療NAFLD的復(fù)雜性。