傣百解對腸道黏膜屏障功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

楊麗萍，陳 普，張光云，段小花

（云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室，云南 昆明 650500）

腸道黏膜屏障不僅能幫助機(jī)體消化吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，還能維持腸道內(nèi)菌群穩(wěn)定，防治各種有害物質(zhì)和內(nèi)毒素對腸道的侵害。腸道黏膜屏障由機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障組成，其中機(jī)械屏障是最為重要的一道防線[1]，它由完整的腸道上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞間緊密連接形成，可有效阻止腸道內(nèi)細(xì)菌及毒素等進(jìn)入體內(nèi)[2]。腸上皮細(xì)胞由隱窩干細(xì)胞分化而來，當(dāng)細(xì)胞增殖與調(diào)亡過程發(fā)生異常時，會引起黏膜屏障結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，細(xì)菌或毒素進(jìn)入機(jī)體導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征或多器官功能障礙[3]。此外，腸上皮細(xì)胞在腸道黏膜屏障發(fā)生病理性損傷后可起到修復(fù)因子的作用，其可通過增殖分化來替換和彌補(bǔ)損傷的腸上皮細(xì)胞，以保證腸上皮的完整性進(jìn)而維持腸道黏膜屏障的功能[4]。臨床上，許多疾病均會導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能發(fā)生障礙，對患者的生命健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響[5]。

傣百解為蘿藦科牛奶菜屬植物通光散Marsdenia.tenacissima（Roxb.）Moon植物，屬于傣族傳統(tǒng)用藥，是傣族最具代表的“解藥”之一[6]。在我國云南省西雙版納、德宏及緬甸、老撾等傣族地區(qū)廣泛使用。傣百解以根入藥，性涼，味苦；入風(fēng)、火、土塔；具有清火解毒、消腫止痛的功效，常用于治療咽喉腫痛、療瘍斑疹、口舌生瘡、肺熱咳嗽、胃脘痛、尿痛、解藥食毒及清除因飲食不潔、用藥不當(dāng)而致的各種不良反應(yīng)[7]。傣百解已被分離出多種化學(xué)成分，并認(rèn)為其具有抗腫瘤、抗生育、平喘、調(diào)節(jié)免疫和降壓等作用，能顯著減輕因嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性哮喘，對抗炎性介質(zhì)[8-9]。傣族認(rèn)為傣百解可解百毒，并在傣族地區(qū)常用于治療胃腸道疾病，但關(guān)于傣百解對腸道黏膜的保護(hù)作用及作用機(jī)制的藥理學(xué)研究未見報道。本實驗基于臨床用藥經(jīng)驗，使用不同濃度的傣百解水提物對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞模型和小鼠急性腸道屏障功能損傷模型進(jìn)行觀察，明確傣百解對腸道黏膜的保護(hù)作用及作用機(jī)制，以期為臨床用藥及后期的進(jìn)一步研究提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動物 大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6細(xì)胞株（ATCC，美國）；40只SPF級昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2015-030。

1.2 藥物制備 傣百解由云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室提供，稱取傣百解50 g，10倍水浸泡 1 h后煎煮30 min，紗布過濾收集藥液；8倍水繼續(xù)煎煮剩下的藥渣30 min，紗布過濾收集藥液；再以6倍水煎煮藥渣30 min，紗布過濾藥液；合并3次的藥液，濃縮至所需濃度后-20℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞實驗使用時先用0.22 μm過濾后稀釋到所需濃度。

1.3 試劑與儀器 脂多糖LPS（Escherichia coli 055：B5，純度：99%）購自美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO） 購自 Meresco公司；IL-6（H007）、TNF-α（H052）、IL-1β（H002）、D-乳酸（H263）、RNA（N066）試劑盒和MTT（G020-1-1）均購于南京建成生物工程研究所；胎牛血清購自德國PAN-Biotech公司；青霉素-鏈霉素（C0222）和 0.25%胰蛋白酶（P1005）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA公司；qRT-PCR引物購自上海生工生物科技有限公司，蘇木素-伊紅染料（中國索萊寶）。

ME104E/02電子天平（梅特勒-拖利多儀器（上海）有限公司）；雙門立式超低溫冰箱（美國賽歐飛世爾公司）；酶標(biāo)儀（美國 Molecular）；微量移液器（eppendorf公司）；低溫高速冷凍離心機(jī)（Thermo公司）；核酸電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR擴(kuò)增儀2720型（美國ABI公司）；熒光定量PCR儀7500fast（美國ABI公司）；石蠟切片機(jī)（德國萊卡）；石蠟包埋機(jī)（德國萊卡）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞實驗 IEC-6細(xì)胞在37℃、5% CO2條件下，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70%～80%進(jìn)行傳代，0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞接種于96孔板中，分為空白對照組、LPS組、不同濃度的傣百解組、LPS+不同濃度的傣百解組；空白對照組只加培養(yǎng)液，LPS組加100 μg/mL的LPS溶液，傣百解組加入不同濃度的傣百解，LPS+不同濃度的傣百解組分別加不同濃度的傣百解1 h后再加100 μg/mL LPS，每個組設(shè)6個復(fù)孔，加完試劑和藥物后，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 動物實驗 40只昆明種雄性小鼠隨機(jī)分為正常對照組、LPS組、LPS+傣百解低、高劑量組，LPS+傣百解低、高劑量組分別給予1.17、3.51 g/kg的傣百解，連續(xù)灌胃給藥1周后，除正常對照組外，其余各組均一次性腹腔注射 LPS（5 mg/kg）建立小鼠腸道屏障損傷模型。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 傣百解干預(yù)IEC-6細(xì)胞及LPS誘導(dǎo)后IEC-6細(xì)胞活力的檢測 IEC-6細(xì)胞以1×105個/mL接種于96孔板，24 h后換無血清培養(yǎng)基，待24 h細(xì)胞周期同步化后，分為對照組、不同濃度的傣百解組和LPS+不同濃度的傣百解組，分別加入相應(yīng)的藥物及含血清培養(yǎng)基，使每孔終體積為200 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，放回培養(yǎng)箱孵育4 h后輕輕吸走上清液，每孔加DMSO 150 μL，在微孔振蕩器上振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度值（OD），以檢測細(xì)胞相對活力。

1.5.2 ELISA檢測 IEC-6細(xì)胞上清液中 IL-1β、TNF-α和IL-6含量 IEC-6細(xì)胞按1×105個/mL接種于96孔板后，分為對照組、LPS組、LPS+60、120、240 μg/mL傣百解組，藥物處理24 h后收集細(xì)胞上清液，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

1.5.3 檢測小鼠血清中D-乳酸的含量 建立小鼠腸道屏障損傷模型2 h后，眼球取血，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定血清中D-乳酸的含量。

1.5.4 qRT-PCR檢測腸道屏障損傷后小鼠結(jié)腸IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)水平 小鼠處死后，取結(jié)腸于液氮中保存?zhèn)溆?。將凍存后的小鼠結(jié)腸研磨，然后按RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，電泳和紫外檢測RNA純度和完整度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后以生成的cDNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測各組結(jié)腸表達(dá)TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的水平，引物序列見表1。

1.5.5 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 小鼠結(jié)腸用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化。

表1 引物序列表

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用GraphPad prim 7軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，若方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane’s T2檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傣百解對IEC-6細(xì)胞活力的影響 與對照組比較，30～480 μg/mL濃度范圍內(nèi)的傣百解對IEC-6細(xì)胞活力無顯著差異（P>0.05），提示傣百解在30～480 μg/mL濃度范圍內(nèi)對IEC-6細(xì)胞活力無影響，見表2。

表2 不同濃度的傣百解對IEC-6細(xì)胞活力的影響（±s，n=6，μg/mL）

表2 不同濃度的傣百解對IEC-6細(xì)胞活力的影響（±s，n=6，μg/mL）

組別 給藥劑量 細(xì)胞活力對照組 - 0.70±0.07傣百解組 30 0.65±0.12傣百解組 60 0.65±0.08傣百解組 120 0.62±0.09傣百解組 240 0.62±0.12傣百解組 480 0.66±0.11

2.2 傣百解對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活力的影響 與對照組比較，LPS組顯著降低了IEC-6細(xì)胞的活力；與LPS組比較，30～480 μg/mL濃度范圍內(nèi)的傣百解可提高IEC-6細(xì)胞的活力，并且在濃度為120～480 μg/mL 時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示傣百解能對抗LPS對IEC-6細(xì)胞活力的抑制作用，見表3。

表3 不同濃度的傣百解對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活力的影響（±s，n=6，μg/mL）

表3 不同濃度的傣百解對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活力的影響（±s，n=6，μg/mL）

注：與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01。

組別 LPS給藥劑量對照組 -LPS組 100傣百解給藥劑量- -LPS+傣百解組 100 LPS+傣百解組 100 30 60 LPS+傣百解組 100 LPS+傣百解組 100 LPS+傣百解組 100 120 240 480細(xì)胞活力0.73±0.05 0.36±0.1**0.42±0.06 0.48±0.08 0.57±0.14##0.71±0.12##0.67±0.1##

2.3 傣百解對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞形態(tài)的影響 結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、呈鋪石路狀貼壁生長（圖 1A）；100 μg/mL的 LPS刺激 24 h后，IEC-6細(xì)胞大量變圓、皺縮、細(xì)胞排列雜亂、死細(xì)胞增多（圖1B）；而不同濃度的傣百解處理后，240 μg/mL濃度下可明顯改善細(xì)胞形態(tài)，皺縮和變圓細(xì)胞減少（圖1C）。

2.4 傣百解對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎癥因子的影響 與對照組比較，LPS組中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平顯著升高（P<0.01）；與LPS組比較，不同濃度的傣百解組均能一定程度上減少IL-1β、TNF-α、IL-6 的水平，在 120 μg/mL 和 240 μg/mL 濃度時對TNF-α的降低最顯著（P<0.05），提示傣百解能減輕LPS對IEC-6細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，見表4。

圖1 傣百解對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞形態(tài)的影響

表4 傣百解對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎癥因子的影響（±s，n=6）

表4 傣百解對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎癥因子的影響（±s，n=6）

注：與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05。

IL-6/（pg·mL-1）對照組 - - 350.82±10.72 222.82±26.31 180.6±3.36 LPS 組 100 - 562.01±58.98** 532.42±83.58** 235.32±8.78**LPS+傣百解組 100 60 528.65±95.94 391.81±53.8 230.24±1.41 LPS+傣百解組 100 120 502.43±23.47 332.74±94.94# 228.10±2.53 LPS+傣百解組 100 240 484.96±41.65 372.49±107.52# 226.82±3.18組別 LPS給藥劑量/（μg·mL-1）傣百解給藥劑量/（μg·mL-1）IL-1β/（pg·mL-1）TNF-α/（pg·mL-1）

2.5 傣百解對LPS誘導(dǎo)小鼠腸道屏障損傷模型中D-乳酸的影響 與對照組比較，LPS組D-乳酸水平顯著升高（P<0.01）；與LPS組比較，傣百解低、高劑量組均降低了D-乳酸的水平（P<0.05），提示傣百解能改善腸黏膜的通透性和損傷程度，見表5。

2.6 傣百解對LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷模型IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的影響 與對照組比較，LPS組 IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 的水平顯著升高（P<0.01）；與LPS組比較，傣百解低、高劑量組均具有降低 IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 水平的作用，其中以TNF-α mRNA的水平降低最為顯著（P<0.01），提示傣百解能減輕LPS誘導(dǎo)小鼠腸道損傷模型的炎癥反應(yīng)，見表5。

表5 傣百解對LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷模型中D-乳酸的影響（±s，n=10）

表5 傣百解對LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷模型中D-乳酸的影響（±s，n=10）

注：與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05。

組別 LPS給藥劑量/（mg·kg-1）對照組 -LPS組 5傣百解給藥劑量/（g·kg-1）- -傣百解低劑量組 51.17傣百解高劑量組 53.51 D-乳酸/（nmol·μL-1）0.46±0.06 0.72±0.08**0.58±0.06#0.57±0.07#

2.7 傣百解對LPS誘導(dǎo)的腸炎小鼠結(jié)腸病理學(xué)的影響 顯微鏡下顯示，正常組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完好，絨毛排列整齊，腸腺輪廓清晰完整，上皮完好。LPS組腸絨毛腫脹、斷裂，局部上皮細(xì)胞壞死。治療組小鼠小腸組織病理變化較模型組均有改善，黏膜組織層次分明，黏膜絨毛及腺體排列紊亂程度減輕，見圖2。

表5 傣百解對LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷模型IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的影響（±s，n=10）

表5 傣百解對LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷模型IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的影響（±s，n=10）

注：與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01。

組別 LPS給藥劑量/（mg·kg-1）傣百解給藥劑量/（g·kg-1）IL-6IL-1βTNF-α對照組 - - 1.35±0.11 1.42±0.06 1.18±0.07 LPS 組 5 - 23.36±2.91** 12.02±3.45** 5.03±0.84**傣百解低劑量組 5 1.17 15.83±5.12 10.79±0.45 2.80±0.67##傣百解高劑量組 5 3.51 15.54±4.91 8.06±2.52 2.49±0.67##

圖2 傣百解對LPS誘導(dǎo)的腸炎小鼠結(jié)腸病理學(xué)的影響（×100）

3 討論

腸上皮細(xì)胞損傷在危重病發(fā)展過程中起著非常重要的作用，而小腸上皮細(xì)胞的增殖是腸道黏膜病理性損傷后修復(fù)，重建上皮完整性和維護(hù)黏膜屏障的關(guān)鍵，積極防護(hù)腸上皮細(xì)胞的損害對維持腸道黏膜屏障功能具有重要意義[10]。LPS在人腸腔內(nèi)大量存在，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，也是引發(fā)炎癥的重要因子[11]。機(jī)體處于正常狀態(tài)時，腸腔內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素不能通過腸屏障進(jìn)入機(jī)體，當(dāng)腸黏膜屏障損傷時，腸道內(nèi)致病菌及毒素進(jìn)入，引起內(nèi)毒素血癥并刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥因子，導(dǎo)致局部或系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)又可進(jìn)一步損害腸道屏障功能[12]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌或內(nèi)毒素侵染腸黏膜上皮細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)緊密連接蛋白的磷酸化和去磷酸化，損傷細(xì)胞間緊密連接，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加，從而影響?zhàn)つて琳系谋Ｗo(hù)功能[13]。本研究結(jié)果表明，LPS刺激IEC-6細(xì)胞24h后細(xì)胞變圓甚至死亡，細(xì)胞活力顯著下降，小鼠一次性腹腔注射5 mg/kg的LPS可引起明顯的精神萎靡、腹瀉等腸炎癥狀。因此，在后續(xù)實驗中選用了在相應(yīng)劑量下的IEC-6細(xì)胞體外模型和小鼠腸道屏障損傷模型來研究傣百解對腸道屏障的保護(hù)作用。

腸黏膜損傷后，細(xì)菌和內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，釋放出大量的IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子[14]。IL-6、IL-1β、TNF-α作為主要的促炎因子，在炎癥進(jìn)展和急性炎癥瀑布式爆發(fā)中起著非常重要的作用[15-16]。TNF-α可激活鞘磷脂酶介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）1和3活化，導(dǎo)致組織損傷[17]。TNF-α的升高還可導(dǎo)致緊密連接蛋白表達(dá)降低，從而增加腸道細(xì)胞通透性，臨床已證明抗TNF-α治療對腸道炎癥疾病的療效[18]。IL-6作為重要的炎癥介質(zhì)，具有聚集炎癥因子，在腸炎疾病的發(fā)病中起著主要作用，參與腸道緊密連接的調(diào)節(jié)，應(yīng)用IL-6抗體治療能夠改善小鼠腸道通透性[19-20]。研究顯示，腸道黏膜組織中的IL-1β在炎性條件下顯著升高，升高程度與腸道炎癥嚴(yán)重程度正相關(guān)，并能增加腸道通透性[21]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的傣百解水提物對IEC-6細(xì)胞活力沒有顯著影響，LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞后，通過傣百解水提物的干預(yù)能提高IEC-6細(xì)胞的活力。傣百解可降低LPS誘導(dǎo)的 IEC-6細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平及小鼠腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的水平，具有抗炎作用。

D-乳酸屬于細(xì)菌的一種代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸黏膜屏障完整時，D-乳酸不能釋放入血；當(dāng)腸黏膜受損后，細(xì)菌易位，則血液中可檢測出D-乳酸，因此，D-乳酸的水平可反映腸黏膜通透性和損傷程度[22-23]。實驗結(jié)果顯示，傣百解可降低LPS誘導(dǎo)后小鼠血清中D-乳酸含量，病理觀察顯示傣百解能夠降低結(jié)腸組織的損傷情況，提示傣百解能改善腸黏膜的通透性和損傷程度。

綜上所述，傣百解能提高LPS誘導(dǎo)后的IEC-6細(xì)胞活力，并能減輕由LPS誘導(dǎo)后產(chǎn)生的炎癥因子水平及其mRNA的表達(dá)，降低小鼠血清中D-乳酸含量，減輕小鼠結(jié)腸損傷，提示傣百解對腸道黏膜屏障功能具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。