福建省蛇舌形蟲18S rRNA基因的擴(kuò)增及蟲種鑒定

宋肇程，黃瀟航，夏錫銳，黃志堅(jiān)，殷光文

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

本試驗(yàn)通過對福建省三明市的某蛇場得到的死亡病蛇進(jìn)行剖檢，觀察其器官的病變，并從其肺臟采集到的1對蟲體，初步懷疑為舌形蟲病。之后對采集的蟲體和腸道結(jié)節(jié)的18S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)序列進(jìn)行比較分析，從而對樣品進(jìn)行分子鑒定。為舌形蟲的分子鑒定提供了科學(xué)根據(jù)，也為將來同類的研究提供借鑒、例證。

1 材料與方法

1.1 樣品材料 樣品為采自福建省三明市某蛇場1條病死蛇。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit、高保真酶TransStart?FastPfuFlyDNA Polymerase高保真DNA聚合酶、EasyTaqMix聚合酶、膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pEASY-Blunt Simple載體、Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。凝膠成像系統(tǒng)(Omega Fluor Plus藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng))由Aplegen公司生產(chǎn)，PCR儀由基因有限公司生產(chǎn)。電泳系統(tǒng)由北京市六一儀器廠生產(chǎn)。

1.3 病變與病原觀察 剖檢眼鏡蛇尸體，肉眼觀察肺臟與腸道，檢查是否發(fā)生病變、結(jié)節(jié)。檢查病變器官是否存在寄生蟲蟲體，并進(jìn)行觀察。

1.4 樣本DNA提取及PCR擴(kuò)增目的片段 將蟲體和腸道結(jié)節(jié)按FastDNA SPIN Kit試劑盒說明書所述方法，提取基因組DNA。采用引物(NEMF1：5′-CGCAAATTACCCACTCTC-3′；S3：5′-AGTCAAATTAAGCCGCAG-3′)、TransStart?FastPfuFlyDNA Polymerase擴(kuò)增酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL體系(DNA模板6 μL，上下游引物各1 μL，TransStart FastPfu Fly 1 μL，DNA Buffer 10 μL，dNTPs 4 μL，ddH2O 27 μL)。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；(95 ℃ 20 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 1 min)×30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；擴(kuò)增時(shí)設(shè)陰性對照。擴(kuò)增結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 PCR產(chǎn)物純化、克隆及篩選 使用膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit，按照說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。后連接于pEASY-Blunt Simple載體上轉(zhuǎn)化至Trans I-T1感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，涂板培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，用EasyTaqMix和M13F/M13R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后挑選出陽性菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將測序得到的基因序列與NCBI中公布的相關(guān)基因序列進(jìn)行對比分析并繪制序列系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 病變與病原觀察 病蛇呼吸困難，有張口呼吸的情況，同時(shí)拒食。剖檢病蛇尸體發(fā)現(xiàn)，病變部位主要集中在肺臟和腸道(見中插彩版圖1)。在剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)肺臟上有1對寄生蟲蟲體(見中插彩版圖2)，蟲體為蠕蟲狀，略呈圓柱形，細(xì)長，約有7.55～7.61 cm。顏色為乳白色略有發(fā)黃，半透明狀。頭尾較尖細(xì)，中間部位較粗，肉眼未見到明顯的體環(huán)。體壁柔軟，略有彈性?？谄魑挥谙x體頭部，口周圍有4個(gè)口鉤，頭胸部之間較細(xì)，可見1條貫穿于蟲體的消化道，消化道內(nèi)有黑色內(nèi)容物。對腸道結(jié)節(jié)進(jìn)行壓片鏡檢發(fā)現(xiàn)存在有鉤狀結(jié)構(gòu)的寄生蟲(見中插彩版圖3)。根據(jù)對病蛇器官組織病變以及蟲體的觀察，初步懷疑為舌形蟲病。

2.2 基因片段的擴(kuò)增結(jié)果與序列分析 以TransStartFastPfuFlyDNA Polymerase擴(kuò)增酶，采用特異性引物(NEMF1，S3)對基因進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示基因片段均在750 bp左右(見圖4)。

圖4 舟山眼鏡蛇舌形蟲 18S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

試驗(yàn)篩選的陽性菌落經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序后得到舟山眼鏡蛇肺部寄生蟲成蟲和腸道結(jié)節(jié)的18S rRNA序列，序列全長均為770 bp，與NCBI的Nucleotide BLAST公布的相關(guān)序列比較可知，其18S rRNA基因序列與GenBank中的EU370434.1(Raillietiellasp.1 BMR-2008 strain C129)；AY744887.1(Raillietiellasp.MCZ DNA101107)的舌形蟲相似性為99.74%；與KC904945.1(Raillietiellaorientalis)的舌形蟲相似性為97.40%；與JX088397.2(Linguatulaserrateisolate NoDog1)的相似性為93.51%。由此可證明，從福建舟山眼鏡蛇中發(fā)現(xiàn)的舌形蟲為Raillietiella屬的寄生蟲。

經(jīng)GenBank檢索10種有代表性的舌形蟲、作為外群的一種闊節(jié)裂頭絳蟲的18S rRNA進(jìn)行相似性分析。舌形蟲序列的序列號分別為：EU370434.1、AY744887.1、AY304521.1、AY304520.1、KC904945.1、KU975377.1、KU975376.1、KU975375.1、KU975378.1、JX088397.2，闊節(jié)裂頭絳蟲序列號為：KF218251.1。使用DNASTAR 7.1軟件的Megalign程序?qū)σ陨闲蛄羞M(jìn)行比對，可以看出各個(gè)序列之間的相似性與差異性的百分比。此次分離到的成蟲和腸道結(jié)節(jié)中的序列相似性為100%，與GenBank中舌形蟲之間序列相似性在91.7%～99.6%；與闊節(jié)裂頭絳蟲Diphyllobothrium latum(序列號：KF218251.1)的相似性低于70.9%(見圖5)。

圖5 舟山眼鏡蛇舌形蟲與其他舌形蟲基因序列相似性對比圖

選取18S rRNA基因序列使用MEGA 7.0軟件繪制序列系統(tǒng)發(fā)生樹(見圖6)。通過種系發(fā)育分析顯示：福建舟山眼鏡蛇肺部舌形蟲18S rRNA基因序列與EU370434.1、AY744887.1和KC904945.1的親緣關(guān)系比較近。與AY304521.1和AY304520.1同屬于一個(gè)大的分支。與其他舌形蟲的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。由此可確定該株為Raillietiella屬的舌形蟲。

圖6 舟山眼鏡蛇舌形蟲18S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討論

舌形蟲主要寄生蛇類等食肉爬行動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)中，也會感染蟾蜍、鳥類以及包括人類等在內(nèi)的哺乳類動(dòng)物[1-3]。人類舌形蟲病主要經(jīng)食物或水源傳播，與終末宿主的密切接觸也可能造成感染[4]。舌形蟲病分為內(nèi)臟型和鼻咽型2個(gè)型[5]，可以引起腹痛、腹瀉、嘔吐、肝腫大、黃疸以及肺葉空洞等[6-9]。除國內(nèi)報(bào)道過的尖吻蝮、滑鼠蛇等和本實(shí)驗(yàn)室此次發(fā)現(xiàn)的舟山眼鏡蛇外，在澳大利亞、巴西和北美等地也有蛇類舌形蟲病的報(bào)道[10-11]?？梢娚嘈蜗x已經(jīng)存在較為廣泛的分布。

本試驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定方法對舟山眼鏡蛇的舌形蟲進(jìn)行了鑒定。利用高度保守的18S rRNA基因的特異性引物對舟山眼鏡蛇的舌形蟲蟲體和蛇腸道結(jié)節(jié)的18S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序。結(jié)果表明，該蟲體為Raillietiella屬的舌形蟲。且試驗(yàn)結(jié)果顯示，其18S rRNA基因序列種內(nèi)差異小于種間差異，表明18S rRNA基因可以作為種間遺傳標(biāo)記來鑒定舌形蟲。我們在舟山眼鏡蛇的體腔中發(fā)現(xiàn)的這對成蟲蟲體和腸道結(jié)節(jié)的PCR和測序結(jié)果一致，說明肺臟和腸道具有同時(shí)寄生的情況。據(jù)Raillietiella舌形蟲已有的生活史研究可知：蟲卵被終末宿主排出，發(fā)育為感染性蟲卵被中間宿主吞食，在中間宿主中發(fā)育為若蟲，中間宿主被終末宿主吞食后，感染性若蟲在其腸道內(nèi)進(jìn)行發(fā)育，從腸壁鉆出經(jīng)體腔移行至肺臟繼續(xù)發(fā)育成成蟲。這與本試驗(yàn)的結(jié)果相吻合。該養(yǎng)殖場用作飼料的蛙類和雛雞都可作為中間宿主感染，并且場址地處山林，畜舍附近經(jīng)常有野生的蛙類和鼠類出沒，由此可以推測：養(yǎng)殖場的眼鏡蛇還有誤食感染了舌形蟲的野生動(dòng)物從而成為終末宿主的可能性。本試驗(yàn)成功確診福建省三明市某蛇場的舟山眼鏡蛇患有舌形蟲病，為福建省舟山眼鏡蛇舌形蟲的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。此寄生蟲對蛇類和人類都會造成嚴(yán)重危害，養(yǎng)殖蛇類尚且存在感染，意味著野生蛇類可能存在更加嚴(yán)重的感染。由此提醒相關(guān)人員做好防治工作以保證舟山眼鏡蛇的生存質(zhì)量。由于舌形蟲的生物學(xué)分類的研究仍然存在著一定的爭議，所以對于其物種的分類仍有待進(jìn)一步探索。